Алчность на основе взаимодействия внеклеточной скрининга (AVEXIS) для масштабируемых обнаружения низкого сродства внеклеточного рецептор-лиганд

Краткое содержание

AVEXIS является высокая пропускная способность белковых взаимодействий анализа разработаны систематически экран роман внеклеточный рецептор-лиганд пары, участвующие в клеточных процессах признания. Она специально разработана для обнаружения переходных взаимодействий белков, которые трудно определить с помощью других подходов, высокой пропускной способностью.

Аннотация

Внеклеточный белок: белковые взаимодействия между секретируемыми или привязанными к мембране белками имеют решающее значение как для инициирования межклеточной коммуникации, так и для обеспечения сплоченности внутри многоклеточных организмов. Белки, которые, как предполагается, образуют внеклеточные взаимодействия, кодируются примерно четвертью человеческих^генов1, но, несмотря на их важность и распространенность, большинство этих белков не имеют документально подтвержденного партнера по связыванию. В первую очередь это связано с их биохимической неподатливостью: мембранные белки трудно растворяются в своей нативной конформации и содержат структурно важные посттрансляционные модификации. Кроме того, аффинность взаимодействия между рецепторными белками часто характеризуется чрезвычайно низкой интенсивностью взаимодействия (период полураспада < 1 секунду), что исключает их обнаружение с помощью многих широко используемых методов с высокой пропускной^{способностью.}

Здесь мы описываем анализ, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen), который преодолевает эти технические проблемы, позволяя обнаруживать очень слабые белковые взаимодействия (t_1/2 ≤ 0,1 сек) с низким процентом ложных срабатываний³. Анализ обычно реализуется в формате с высокой пропускной способностью, что позволяет проводить систематический скрининг многих тысяч взаимодействий в удобном формате микротитрового планшета (рис. 1). Он основан на производстве растворимых рекомбинантных белковых библиотек, которые содержат эктодоменные фрагменты рецепторов клеточной поверхности или секретируемые белки для скрининга взаимодействий; Таким образом, данный подход подходит для рецепторов клеточной поверхности типа I, типа II, связанных с GPI, и секретируемых белков, но не для многопроходных мембранных белков, таких как ионные каналы или транспортеры.

Библиотеки рекомбинантных белков производятся с использованием удобной и высокоуровневой системы экспрессии млекопитающих⁴, чтобы гарантировать добавление важных посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование и дисульфидные связи. Экспрессированные рекомбинантные белки секретируются в среду и производятся в двух формах: биотинилированная приманка, которая может быть захвачена на твердой фазе, покрытой стрептавидином, подходящей для скрининга, и пентамеризованная ферментная (β-лактамазная) добыча. Белки приманки и добычи представлены друг другу в бинарном виде для обнаружения прямых взаимодействий между ними, аналогично обычному ИФА (рис. 1). Пентамеризация белков у жертвы достигается за счет пептидной последовательности из хрящевого олигомерного матриксного белка (COMP) и увеличивает локальную концентрацию эктодоменов, тем самым обеспечивая значительный прирост авидности, позволяющий обнаруживать даже очень преходящие взаимодействия. Нормализовав активность как приманки, так и добычи до заранее определенных уровней до скрининга, мы показали, что взаимодействия с мономерным периодом полураспада 0,1 секунды могут быть обнаружены с низкой частотой ложноположительных^{результатов}.

Протокол

1. Компиляция библиотеки приманки и Prey плазмид-векторов экспрессии

1. Составьте список клеточным рецептором поверхности и секретируемых белков, представляющих интерес для пройти обследование для взаимодействия и извлекать их последовательности из подходящей базы данных последовательности белка. Большинство белков, содержащих N-концевых секреторных сигнального пептида подходит (к ним относятся тип I, GPI-связанные и секретируемых белков). Как правило, белка семьи (например, надсемейства иммуноглобулинов или все рецепторы ограничены определенным типом клеток, таких как эритроциты) будет выбран.
2. Определить степень внеклеточного регионов путем определения расположения сигнального пептида и трансмембранный регионе, используя функцию белка предсказание программного обеспечения. Обычно мы используем SignalP v3.0 ⁵ и TMHMM v2.0 ^6.
3. Дизайн праймеров наборы, которые усиливают весь фрагмент эктодомена для каждого рецептора. У нас есть набор приманки и добычу векторов, которые подходят для этой цели, которыемодели шириной от Addgene ( http://www.addgene.org/~~V ). Дизайн смысле грунтовки вокруг начала метионин включить фермента NotI сайт ограничения и оптимальной последовательности Козака, это следует до 25 пар оснований точное совпадение генов определенной последовательности (рис. 2).
4. Дизайн антисмысловой праймер для усечения типа я рецепторные белки только до предсказанных трансмембранных регионе таким образом, чтобы выразить всю эктодомена как растворимый рекомбинантный белок. Включите сайт Сумки ограничения в этой грунтовкой, которая должна затем перевести в рамки С-концевой крысы Cd4d3 +4 белка теги ⁷ (рис. 2).
5. Усиление эктодомена фрагменты из всех генов с помощью этих праймеров и клонировать их в приманку или добычу вектор. Мы иногда бывает полезно сначала клонировать их в векторы трансфер до субклонирования в соответствующий вектор экспрессии млекопитающих, мы используем производной вектор pTT3 ^3,4. Как приманку и добычу векторов ContaiП С-терминального белка теги следующим образом (рис. 2В).
   1. Приманки: метки с областями 3 и 4 крыс CD4 (Cd4d3 +4) белок следует пептидной последовательности, которая является субстратом для фермента E.coli Бира и поэтому может быть monobiotinylated на определенный остаток лизина (рис. 2В) . Cd4d3 +4 теги признан OX68 моноклональных антител и используется для количественного выражения приманки белков методом ИФА. Приманки белков, следовательно, мономерные и monobiotinylated. Дополнительная приманка белка векторов, где biotinylatable пептид заменяется 6-теги его для очистки доступны.
   2. Добыча: жертвы и содержат крыс Cd4d3 +4 тега следуют пептидной последовательности из хряща крыс олигомерных белков матрицы (КОМП) и С-концевой β-лактамаз, ферментов. COMP пептид обеспечивает добычу формы пентамеры раз выражена (рис. 2В).

2. Prey и приманки экспрессии белка

Мы используемудобный высокого уровня экспрессии системы с помощью подвески культуры HEK293E клеточной линии ⁴ производим наши библиотеки белка, но любая система млекопитающих выражение должно быть подходящим. Коммерчески доступные альтернативы системе Freestyle. Клетки обычно культивируют на дрожащей платформа (125 оборотов в минуту) при 37 ° C, 5% CO ₂ при 70% относительной влажности. Положительные и отрицательные белки контроля также должна быть выражена. Крыса Cd4d3 +4 теги только фрагмент доступна как приманки и добычу и пригодны отрицательного контроля. Кроме того, приманка и добыча векторов, которые кодируют положительного контроля доступны (Addgene), мы обычно используем крысы CD200-Cd200R взаимодействия ^8.

1. Семенной HEK293E клеток за день до трансфекции с плотностью 2,5 • 10 ⁵ клеток мл ^-1. Мы регулярно культуре клеток в объеме 50 мл в Freestyle293 средств массовой информации в соответствии с рекомендациями производителя. Для обеспечения эффективного биотинилирование, дополнять тОн среду клеточной культуры для производства белков приманки с D-биотин до конечной концентрации 100 мкМ. Средняя используется для выражения добычу белки не должны быть дополнены D-биотин.
2. На следующий день, трансфекции клеток с помощью подходящего реагента трансфекции (например, 293fectin). Использование 25 мкг приманку или добычу плазмиды конструкций для трансфекции 50 мл культуры. Для получения биотинилированного приманки, совместно трансфекции плазмидой, кодирующей приманки построить с плазмидой, кодирующей выделяется форма E.coli белок-биотин-лигазы ( Бира), которая доступна из Addgene. Со-трансфекции плазмиды приманку в соотношении 10:1 (2,5 мкг) плазмиды, кодирующей белок секретируемый Бира.
3. Урожай культур пять дней после трансфекции сначала гранулирования клеток путем центрифугирования при 3000 х г в течение 20 минут с последующей фильтрацией супернатант через 0,22 мкм фильтр.

[Подсказка: Bait и добычу белокследует хранить неразбавленным при температуре 4 ° С, а в качестве общего руководства следует использовать в течение года. Добавить bacteriostatics например, 50 мкг / мл полимиксина В сульфата или 10 мМ NaN ₃ для предотвращения бактериального загрязнения супернатантах.]

3. Нормализация приманки и Prey Образцы

Одной из ключевых особенностей анализа AVEXIS том, что из-за рекомбинантные белки выделяются их можно разбавлять или концентрированные (нормированная) в пределах установленного порога деятельность до того, как используются в анализе. Мы обнаружили, что уровни, на которых рекомбинантные белки экспрессируются охватывают широкий диапазон - до 4 порядков - и, следовательно, нормализация шаг значительно снижает количество ложных срабатываний в экранах.

3,1 Bait нормализации

Примечание: неконъюгированной D-биотин должны быть удалены из средств массовой информации (как правило, путем диализа), поскольку он будет конкурировать с бай биотинилированногот белка для связывания стрептавидин сайтов связывания.

1. Передача приманки супернатантов в диализе трубы, этикетки, обрезать и надежно диализировать широко против подходящий буфер, таких как PBS для удаления свободного биотина.

[Примечание: Мы обнаружили, что достаточное диализ обычно достигается в течение 6 х 50 мл приманки супернатантах с объемом 4,5 л с 4 PBS изменений в течение 24-часового периода. Недостаточный диализ можно наблюдать торможение связывания с белками при низких разведениях на этапе нормализации приманки (рис. 3А).

2. Выполните ИФА для определения относительного уровня, при котором приманка белки экспрессируются. Подготовить разведение серии биотинилированного белка приманки и взять их на покрытых стрептавидином иммунологических планшет. Используйте крысу Cd4d3 +4 теги для выявления и количественной оценки захваченных приманки белков с использованием моноклональных антител (OX68). Концентрат или разбавлять приманки белков Минимальная сумма, необходимая для насыщения всех Биов сайтах связывания в колодец стрептавидин покрытия пластины.
3. Блок лунки стрептавидин покрытия пластины с фосфатным буферным saline/0.1% Твин-20 (PBST) / 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 15 минут.
4. В отдельную табличку, сделать разведение серию (четыре 1:03 разведения, как правило, достаточно) на приманку белков в PBST / 2% BSA и передаче скважин стрептавидин покрытия пластины. Выдержите в течение 1 часа при комнатной температуре.
5. Вымойте 3x в PBST. Добавить 100 мкл 2 мкг / мл анти-мышь крыса Cd4d3 +4 IgG (OX68) инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре.
6. Вымойте 3x в PBST. Добавить 100 мкл антимышиным щелочной фосфатазы в разведении 1:5000 в PBST / 2% BSA и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
7. Вымойте 3x в PBST и выполнять последней промывки в PBS, чтобы удалить остатки моющего средства. Добавить 100 мкл 1 мг / мл субстрата в 104 диэтаноламин буфера (10% диэтаноламина (V / V), 0,5 MgCl _2, 10 мМ NaN _3, pH9.8, хранить в защищенном от света на 4° C).
8. Через час, измерение оптической плотности при 405 нм. Представитель результатов приманка нормализации показано на рисунке 3А.
9. Приманка белки, которые выражаются на уровне, недостаточно, чтобы насытить все биотин-сайтов связывания стрептавидин покрытие пластин, при использовании неразбавленным, должны быть сосредоточены использованием Vivaspin концентраторы (Vivascience, 10kDa MWCO). В качестве ориентира, по нашим оценкам, ~ 5 мкг типичного белка приманки (~ 80 кДа) является достаточным для насыщения 96 пластин.
   1. Приманка белков, высказанные на высоком уровне можно развести в PBST / 2% БСА в концентрации, достаточной для насыщения стрептавидин покрытия пластины. Деятельность приманки следует перепроверил после разведения или концентрации, чтобы они насыщают все сайты связывания биотина в покрытых стрептавидином пластины.

3,2 Prey нормализации

1. Количественная относительно уровней, на которых добыча белки выражается с помощью β-лактамазыферментативной активности.
2. Во-первых, убедитесь, разведение ряд супернатант, содержащий белки в жертву PBST / 2% BSA буфере. Затем добавить 20 мкл разведения до 60 мкл 242 мкМ (0,125 мг / мл) nitrocefin решение (Calbiochem).
3. Немедленно передать пластины читатель иммунологических планшет, которая измерения абсорбции при 485 нм, каждую минуту в течение 20 минут при комнатной температуре. Представитель результаты добычи нормализации показано на рисунке 3b.
4. Концентрат образцов с использованием центробежных концентраторов или разводить их в PBST / 2% BSA, чтобы достичь порога активности ~ 2 нмоль мин ^-1 оборот nitrocefin. Практически это достигается, если все nitrocefin гидролизуется в течение ~ 7 минут.

4. Процедура отбора AVEXIS

1. Вымойте покрытых стрептавидином пластины PBST.
2. Добавить 100 мкл PBST / 2% BSA в каждую лунку и инкубировать в течение 30 минут, чтобы блокировать любые ложные сайты связывания белков в каждую лунку.

[Совет: чтобы удалить остатки промывочного буфера после промывания, пластины постучал - решительно - на бумажных полотенцах]

3. Удалите блокирующий раствор с умным движением пластина над раковиной и добавить 100 мкл биотинилированного нормированного мономерных приманки соответствующие лунки и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
4. Удалить приманки образцы пластины переворачивание пластину и энергично стряхивая над раковиной, и промыть 3 раза в PBST.
5. Добавить 100 мкл нормированного добычу pentamerized построить в каждую лунку и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа, мыть, как в пункте 4.4 и выполнить последний моют только PBS.
6. Добавить 60 мкл 242 мкМ nitrocefin раствор (растворить 5 мг nitrocefin в 500 мкл ДМСО, тщательно перемешать и далее разбавить nitrocefin в 40 мл PBS и проходят через 0,22 мкм фильтр перед добавлением в пластинах) и выдержите при комнатной температуре . Положительные взаимодействия можно наблюдатьна глаз с желтым nitrocefin гидролизуется в красный цвет. Количественная читая абсорбции при 485 нм, используя ридер. Типичный пластины и количественного показано на рис. 4.

[Подсказка: Положительное взаимодействие, как правило, наблюдаются в течение 2 часов при комнатной температуре, хотя пластины должны быть размещены на 4 ° C в течение 16 часов, чтобы убедиться, что все потенциальные взаимодействия не обнаружено. Мы также обнаружили, что осажденный nitrocefin и недостатки по пластику планшета, такие как царапины / отпечатков пальцев может иногда привести к артефактного ложных срабатываний при 485 нм, несмотря на отсутствие открытой гидролиза nitrocefin. Поэтому целесообразно, чтобы сделать фотографии плит визуально записывать nitrocefin оборот в скважинах.]

5. Представитель Результаты

В качестве примера представитель пластины скрининг AVEXIS показано на рисунке 4. Следует заметить гидролиза (желтого до красного) в nitrocefin субстрата вположительного контроля скважин (как антитело-опосредованной жертвой захвата контроля, а также позитивного взаимодействия управления) в течение примерно десяти минут. Некоторые взаимодействия внутри экрана наблюдаются также в течение этого времени масштабы, но другие могут занять больше времени (несколько часов), чтобы появиться. Как правило, хит-скорость около 0,4-0,6% (позитивного взаимодействия для каждого 150-250 взаимодействия проходит проверку) является типичным, в зависимости от белка библиотеки проходит проверку.


Рисунок 1. Идентификация рецептор-лиганд опосредующих клеточные процессы распознавания с помощью AVEXIS. Схема показывает двух взаимодействующих клеток (А и В) обмена информацией через взаимодействие между мембраной встроенные белки рецепторов. AVEXIS является масштабируемым анализа взаимодействия белков, специально предназначенные для идентификации новых рецептор-лиганд пар, которые характеризуются очень слабым сильные взаимодействия. Рекомбинантный такluble библиотек белков, представляющие весь эктодомена от рецепторов клеточной поверхности, репертуар, как клетки составляются либо как pentameric β-лактамаз, помеченные жертвы (типа клеток) или мономерные биотин, помеченные приманки (для мобильного типа В). Pentamerisation из жертв увеличивается локальная концентрация ectodomains осуществлять общее усиление алчность, так что даже очень переходных взаимодействий может быть обнаружена. Приманки библиотека одел на покрытых стрептавидином пластин и систематически исследовал для взаимодействия с жертвой белки. После короткой стирки, любой захваченный жертвы определяются с использованием β-лактамаз деятельности, связанной с добычей.


Рисунок 2. Приманки и дизайн добычу конструкции. (А), крысы CD200 рецептор белка в качестве примера того, как все ectodomains клеточных поверхностных белков рецепторов определяется и грунтовки предназначены, чтобы сделать как приманкаи конструкции добычу выражения. КДНК и перевод белковой последовательности показаны с N-терминального сигнального пептида на мембране трансмембранный охватывает область крыса CD200. Смысл грунтовка предназначена для включения 5 'NotI сайт рестрикции фермента и оптимальную последовательность Козака следовало 25 баз точной последовательности матч CD200 кДНК. Антисмысловой праймер содержит сайт Сумки и 25 баз точной последовательности матч расположен непосредственно перед выбранной остаток усечение эктодомена. Чтобы сохранить эктодомена в рамке с крысой Cd4d3 +4 тега, сайт Сумки должны перевести как Gly-Ala-Pro. (Б) Схематическое представление приманки и конструкции добычу выражения. Каждый из них содержит рецепторы ectodomains окружении NotI и Аски-сайтов и Cd4d3 +4 тегов. Приманок содержащих С-концевой пептидной последовательности, которые могут быть специально monobiotinylated по котрансфекции плазмидой выражения фермент секретируемый Бира. Жертвы следуют pentamerisation последовательностьиз матрицы хрящей олигомерных белков (КОМП) и β-лактамаз фермента.


Рисунок 3. Нормализация приманка и добыча белки. (A) Характерные примеры приманки нормализации. Разведение серию из четырех различных диализу супернатантах приманки были обнаружены ИФА с использованием анти-CD4 теги моноклональных антител. Четыре приманки, высказанные на различных уровнях 1> 2> 3> 4. Приманки должны быть нормализованы до порогового уровня, который насыщает мест связывания биотина в каждую лунку. Высоко выразил приманки может быть разбавлен для сохранения белков (например, приманка 1 может быть разбавлен ~ 1:100), и слабо выраженным приманки сосредоточены. Снижение показаний при низких разведений иногда наблюдаются в некоторых приманок (например, приманка 2), что объясняется наличием неконъюгированного D-биотин в связи с неполным диализа. (B) уровни, на которых охотятся белки являются бывшиминажата количественно, используя скорость гидролиза β-лактамаз подложки, nitrocefin. В приведенном примере, три жертвы выражаются на разных уровнях: добыча 1> 2> 3. Добыча должна быть нормирована на деятельность ~ 2 нмоль мин ^-1, что соответствует полному гидролизу 14,5 нмоль nitrocefin в ~ 7 минут (например, добыча 1). Других жертв в этом примере должно быть сосредоточено до использования в скрининге.


Рисунок 4. Представитель результаты AVEXIS скрининга. (A), фотография представитель пластины скрининг AVEXIS. Добычу белок исследовали против 41 различных приманок и позитивного взаимодействия обнаружен в хорошо E2. Управления, используемые в скрининг пластин включает: биотинилированного анти-CD4 антитела, чтобы захватить всю добычу белок добавляется к хорошо (G6), управление взаимодействием: крыса CD200 (приманка) Cd200R (добыча) с Cd200R охотятся используется на пороге разведения (H3), 1:10 (Н4) и 1:100 (H5). Отрицательного контроля были: Cd4d3 +4 приманки исследовали с добычей белка проходит проверку (H1) и добыча Cd200R (H2). (B) Количественная оценка значения абсорбции и тот же экран осуществляется в трех экземплярах. Данные точки среднее ± SD.

Обсуждение

Когда живые клетки наблюдается в естественных условиях, их мембраны плазмы демонстрируют высокую динамику поведения: расширение и процессы втягивания мембраны как они входят в контакт и общаться со своими соседями ^2. Физическое взаимодействие между мембраной встроенный рецепторные белки, которые опосредуют многие из этих контактов развивались чрезвычайно слаба, чтобы при этом очень подвижны поведения. Было подсчитано, что мономерные сильные взаимодействия, слабые до 50 мкм может быть достаточно, чтобы управлять спонтанного взаимодействия на физиологические концентрации рецептора ^9, который делает выявление новых взаимодействий чрезвычайно сложной ^2,10. Метод AVEXIS описанный здесь является чувствительным методом для определения переходных внеклеточный белок: белковых взаимодействий, которые могут быть реализованы в масштабируемых образом с низким уровнем ложных срабатываний. В то время как другие масштабируемые методы были разработаны для обнаружения внеклеточные взаимодействия ^11-15,Одним из преимуществ является то, что AVEXIS экспериментальные параметры, такие как приманка и добыча мероприятия были количественно обнаружить даже самые слабые взаимодействия (Т _1/2 ≤ 0,1 с), сохраняя при этом низкий процент ложных срабатываний ^3. Кроме того, рациональный и надежный процедуры подготовки пробы позволили этого анализа будет осуществляться на гораздо большем масштабе, чем в других тестах, и мы недавно описал систематическое взаимодействие экрана на общую сумму свыше ~ 16 500 потенциальных взаимодействий ^16.

Анализ может быть выполнена на любой белок, для которых можно выразить растворимый рекомбинантный фрагмент белка. Таким образом, это включает в себя белки, содержащие N-терминального сигнального пептида, такие как тип I, GPI-связанные и секретируемых белков. Недавно мы разработали набор векторов, что теперь позволяет нам выразить типа II белка как приманку ^17. Анализ как правило, не подходит для многопроходной мембранных белков, таких как ион транспортерс или насосы, так как они вряд ли будет правильно сложить вне контекста мембране. Мы использовали это различные системы и успешно выразил внеклеточных белков данио ^3,16,18, человека, мыши и П. тропической взаимодействия экранов.

С точки зрения ресурсов, необходимых для создания экрана AVEXIS, мы обнаружили, что значительное узким местом является выбор, строительство и полное секвенирование выражение плазмид. Этот аспект метода может занять до года, чтобы ~ 100 приманки и добычу конструкции, однако, с уменьшением стоимости ген синтеза, мы сейчас выступаем коммерческой аутсорсинга этот аспект проекта. Млекопитающих система выражения вместе с большой тряски культуры тканей инкубатор (мы используем INFORS HT Multitron Cell) позволяет одному исследователю, чтобы выразить и нормализовать до ~ 100 приманки и добычи белки в месяц. Как только белки производятся и нормализовалась, сcreening для взаимодействий с быстрым до двенадцати 96-луночных быть удобно, обрабатываемых за один день. Только на заказ оборудования, которые мы разработали для облегчения производства такого большого количества белков сжатого воздуха управляемой поршень, который используется для передачи до пяти супернатантов через 0.22μm фильтр параллельно.

Основной класс взаимодействий, которые могут быть пропущены по сравнению с взаимодействием ожидать от литературы (ложных негативов) являются homophilic взаимодействия, хотя некоторые из этих взаимодействий может быть обнаружено ^3. В тех случаях, когда ожидаемый взаимодействия не обнаружено, мы считаем, что это связано с формированием homophilic взаимодействий белков добычу (добычу "маскировки" эффект), которые затем предотвращает дальнейшее взаимодействие с иммобилизованными белками приманки. Частота, при которой взаимодействие обнаружены зависит от содержания белка библиотеке проходит проверку. В качестве ориентира для читателя, экран> 30000 взаимодействия в данио надсемейства иммуноглобулинов привело в 188 срабатываний - частота 0,6% ^3,16,18. Очень быстрой проверки, которые могут быть выполнены, чтобы проверить любое положительное хитов для определения взаимодействия могут быть обнаружены и в приманку-жертва ориентации, которые, может же быть обнаружены взаимодействия независимо от того, белки присутствуют либо как приманка или добычу. Всякий раз, когда мы наблюдали это возвратно-поступательное движение поведения, обязательные впоследствии было показано, что определенный, демонстрируя прямую насыщающимся связывания белков с использованием очищенного поверхностного плазменного резонанса. Следует подчеркнуть, что, поскольку мы увеличиваем обязательный алчность искусственно pentamerising добычу белки, мы не считаем, пригодных для анализа количественного сравнения взаимодействие сил. Для получения биофизических параметров связывания взаимодействия мы используем мономерные белки и резонанс поверхностных плазмонов. Наконец, когда взаимодействие было выявлено, приветGH природы пропускной способности анализа позволяет относительно легко адаптировать анализ для выявления реагентов, таких как антитела и малые молекулы, которые блокируют взаимодействие.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Кат. Номер	Комментарии
Фристайл СМИ	Invitrogen	12338018
Nitrocefin	Calbiochem	484400
SA-покрытием планшет	Nunc	734-1284
OX68 антител	AbDSerotec	MCA1022R
Диализ трубы	Прокалывать	PN68100
Полимиксин	Сигма	P4932
D-биотин	Сигма	B4639-5-го поколения
Субстрат-104	Сигма	1040-506
Vivaspin-20 центробежные концентраторы	Портняжная мышца	VS2002
0,22 мкм фильтры	Nalgene	190-2520