Здесь мы опишем быстрый и простой метод измерения жесткости клетки. Общий принцип этого подхода заключается в измерении деформации мембраны в ответ на четко определенных отрицательным давлением подается через микропипетки к поверхности клетки. Этот метод представляет собой мощный инструмент для изучения биомеханических свойств подложки подключенных клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микропипетки Стремление основания подключенных клетки к оценке сотовых жесткости
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Растущее число исследований показывают, что биомеханические свойства отдельных клеток играют важную роль во многих клеточных функций, в том числе клеточной пролиферации, дифференцировки, миграции и межклеточных взаимодействий. Два ключевых показателей клеточного биомеханики являются клеточными деформируемости или жесткость и способность клеток к договору и генерировать силу. Здесь мы опишем простой и быстрый метод оценки жесткости клетки путем измерения степени деформации мембраны в ответ на отрицательное давление со стеклянной микропипетки к поверхности клетки, техника, которая называется стремление микропипетки или микроаспирацией.
Микроаспирацией осуществляется путем вытягивания стеклянных капилляра для создания микропипетки с очень небольшой совет (2-50 мкм в диаметре в зависимости от размера клетки или образец ткани), который затем подключается к датчику давления пневматического и доведено до конца близости от клетки под микроскопом. Когдакончика пипетки коснется клетки, шаг отрицательным давлением наносится на пипетку преобразователем пневматическим давлением создания четко определенных давление на клеточные мембраны. В ответ на давление, мембрана всасывается в пипетку и прогрессивной деформации мембраны или "мембраны проекция" в пипетку измеряется как функция времени. Основной принцип этого экспериментального подхода является то, что степень деформации мембраны в ответ на определенной механической силы является функцией мембраны жесткости. Чем жестче мембраны, тем медленнее скорость деформации мембраны и короче стационарных стремление length.The техника может быть выполнено на изолированных клетках, как в подвеске и подложки подключением, большими органелл, и липосомы.
Анализ проводится путем сравнения максимальных деформаций мембраны, достигнутых в рамках данного давления для различных популяций клеток или экспериментальных условиях. «Коэффициент жесткости» является эс-оценивалась путем построения атмосферный длина мембраны деформации в зависимости от приложенного давления. Кроме того, данные могут быть дополнительно проанализированы для оценки модуля Юнга клеток (E), наиболее распространенный параметр характеризует жесткость материала. Важно отметить, что плазменные мембраны эукариотической клетки можно рассматривать как двухкомпонентная система, где двухслойной липидной мембраны в underlied суб-мембранного цитоскелета и что это цитоскелета, что представляет собой механическую эшафот мембраны и доминирует деформируемости клеточной оболочки. Такой подход, следовательно, позволяет зондирования биомеханических свойств суб-мембраны цитоскелета.
Протокол
1. Вытащив стекло Микропипетки
Оборудование: микропипетки Puller, Microforge.
Стекло: Boroscillicate стеклянных капилляров (~ 1,5 мм наружным диаметром ~ 1,4 мм внутреннего диаметра).
- Микропипетки тянут, используя тот же базовый подход, который используется для подготовки стекла микроэлектродов для записи электрофизиологии. Короче говоря, стеклянный капилляр нагревается в среднем и, когда стекло начинает плавиться две половинки капилляр растаскивают создания двух микропипетки. Многочисленные коммерческие съемники доступны для выполнения этого процес....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Микроаспирацией обеспечивает простую и высокую воспроизводимость метода оценки жесткости клеток / деформируемости путем применения отрицательного давления на клеточные мембраны и измерения деформации мембраны в ответ на четко определенных давление. Она была впервые разработана Mitchison и Swann (1954) для характеристики упругих свойств морского ежа яйца, чтобы обеспечить понимание механизмов клеточного деления 21 и затем, чтобы посмотреть на механические свойства в красных кровяных клетках 1. Этот .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Каталог / номер модели | Комментарии |
| Саттер пипетки съемника | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Перевернутый флуоресцентного микроскопа | Zeiss | Axiovert 200M | Микроскопа должна быть предпочтительно снабжен 3D/deconvolution возможности. |
| Видеокамера | Zeiss | AxioCam MRM | |
| Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Преобразователь давления пневматический | BioTek | DPM-1B | DPM1B пневматический преобразователь Tester теперь можно найти по счастливой случайности. |
| Пипетка стеклянная | Richland | Индивидуальные стекла | Пипетки были настроены с внутренним диаметром 1,2 и 1,6 наружного диаметра. |
| DiI краска | Invitrogen | D282 | Хорошо растворяется в ДМСО |
Ссылки
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure. Biophys. J. 4, 115-135 (1964).
- Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. Molecular maps of red cell deformation: hidde....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
