Спектральный Кариотипирование (SKY) является передовой техникой цитогенетики для идентификации геномных и хромосомных аберраций. Эта техника использует датчики хромосомы картины, которые позволяют классификации всех хромосом. SKY можно также определить комплекс хромосомных аберраций и разделение дефектов у мышей и людей с различными заболеваниями, в том числе поликистоз почек.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Спектральный Кариотипирование по изучению хромосомных аномалий у человека и мыши с поликистозом почек
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Традиционный метод идентификации и классификации отдельных хромосом основан на уникальном характере полосатости каждой хромосомы конкретного анализируемого вида 1, 2. Однако этот классический метод полосатого окрашивания недостаточно надежен при выявлении сложных хромосомных aberраций, например, связанных с онкологическими заболеваниями. Чтобы преодолеть ограничения метода полосатого окрашивания, был внедрен спектральный кариотипинг (SKY), который позволяет получить гораздо более достоверную информацию о хромосомных аномалиях.
SKY — это метод многоцветной флуоресцентной гибридизации in-situ (FISH), используемый для детектирования метафазных хромосом с помощью спектрального микроскопа 3, 4. Было доказано, что SKY является ценным инструментом для цитогенетического анализа широкого спектра хромосомных аномалий, связанных с большим количеством генетических заболеваний и злокачественных новообразований 5, 6. Метод SKY предполагает использование многоцветных флуоресцентно-меченных ДНК-зондов, полученных с помощью ПЦР с использованием вырожденных олигонуклеотидных праймеров. Таким образом, после гибридизации in-situ с зондами, которые дифференциально мечены смесью флуоресцентных красителей (родамин, Texas Red, Cy5, FITC и Cy5.5), каждая хромосома приобретает уникальный спектральный цвет. Набор зондов, используемых для SKY, состоит из до 55 хромосомно-специфических зондов 7-10.
Процедура SKY включает несколько этапов (Рисунок 1). Для SKY требуются клетки с высоким митотическим индексом, полученные из нормальной или патологически измененной ткани или крови. Хромосомы одной клетки — первичной выделенной клетки или клетки клеточной линии — распределяют по стеклянному предметному стеклу. Этот препарат хромосом маркируют различными комбинациями флуоресцентных красителей, специфичных для каждой хромосомы. Для детекции зондов и получения изображений используется система спектральной визуализации, состоящая из интерферометра Саньяка и ПЗС-камеры. Это позволяет измерять спектр видимого света, излучаемый образцом, и получать спектральное изображение отдельных хромосом. Программное обеспечение HiSKY, используемое для анализа полученных изображений, обеспечивает легкость идентификации хромосомных аномалий. Конечным результатом является изображение метафазы и классификации кариотипа, на котором каждая пара хромосом имеет отчетливый цвет (Рисунок 2). Это позволяет легко определять принадлежность хромосом и выявлять транслокации. Для получения более подробной информации, пожалуйста, посетите веб-сайт Applied Spectral Imaging (http://www.spectral-imaging.com/).
Метод SKY недавно применялся для идентификации дефектов сегрегации хромосом и хромосомных аномалий у людей и мышей с аутосомно-доминантной поликистозной болезнью почек (ADPKD) — генетическим заболеванием, характеризующимся дисфункцией первичных ресничек 11-13. Используя этот метод, мы продемонстрировали наличие аномальной сегрегации хромосом и хромосомных дефектов у пациентов с ADPKD и в моделях на мышах 14. Дальнейший анализ с помощью SKY позволил нам не только определить количество и идентичность хромосом, но и точно выявить очень сложные хромосомные aberрации, такие как делеции и транслокации хромосом (Рисунок 2).
Протокол
1. Предварительная обработка клеток и метафазных подготовки
- Клетки, выращенные в модификации Дульбекко среднего орла (DMEM), содержащих 10-15% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина при 37 ° С с 5% СО 2 инкубатора, пока они не достигают 70-80% слияния.
- Относитесь к клеткам с колцемид решение на уровне 0,05 мкг / мл в течение 30-60 мин.
- Соберите среде, содержащей любой плавающих клеток в 50 мл стерильной труб сокол центрифуги. Промойте клетки на пластине с sterile1X-би-эс. После инкубации с трипсином стерильной в течение 1-2 мин, урожай и собрать оставшиеся клетки в одну трубу.
- Вращай....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Спектральный Кариотипирование (SKY) является цитогенетики техника, используемая в изучении генома и хромосомные композиций. Эта техника использует датчики хромосомы живописи, и обнаружение этих зондов, полученных в результате Саньяка интерферометра. Весь процесс SKY обычно занимает около одной недели, и она включает в себя несколько основных этапов (рис. 1). SKY используется стандартный протокол, который был впервые описан Падилья-Nash и др. 3. С тех пор протокол был адаптирован в ра.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Брайана Мунтян, Шао вот, Маки Такахаши и Блэр Мелл за техническую помощь. Эта работа была поддержана награды от NIH (DK080640) и Университет Толедо и ProMedica Поступательное премии стимулирование исследований доктора Сурья Наули.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| DMEM | CellGro Mediatech Инк | 10-013-CV | |
| Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin / стрептомицином | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Колцемид | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 мкг / мл |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Фосфатного буфера | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| SKY краски зонд комплект (Human) | Прикладные спектральных изображений | SKY000028 | |
| SKY краски зонда набор (мышь) | Прикладные спектральных изображений | SKY000030 | |
| Концентрированный комплект обнаружения антител | Прикладные спектральных изображений | SKY000033 | |
| Трипсин | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| Метанол | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Уксусная кислота | Fisher Scientific | A38-212 | |
| РНКазы | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| Пепсин | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl 2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% формальдегида | Mallinckrodt Бейкер | 2106-02 | |
| 20-кратный SSC | Promega | V4261 | |
| Формамид | Fluka | 47671 | готовить непосредственно перед употреблением |
| Твин-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Слайды стекло микроскопа | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Микроскоп покровного стекла 24x60mm | VWR Vista, Видение | 16004-312 | |
| Резиновый цемент | Элмер (местный розничный магазин) | ||
| Гибридизация / humidifiedchamber / лоток | Simport | M920-2 | положить мокрые полотенца бумаги на дне |
| Thermoвелосипедист | Эппендорф | Epgradient S | |
| Тряска платформы / Орбитальный шейкер | Bellco биотехнологии | ||
| Тряска / водяной бане | Точность научного | ||
| DAPI фильтр куб | Chroma технологии | ||
| SKY фильтр куб | Chroma технологии | ||
| SpectraCube | Прикладные спектральных изображений | ||
| Инвертированный микроскоп культуре клеток | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
| Флуоресцентный микроскоп | Олимп | IX70 | 60X нефти |
Ссылки
- Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
- Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
