Мезотелиальной анализ оформления, описанные здесь преимущества флуоресцентно меченых клеток и покадровой видео микроскопии для визуализации и количественного измерения взаимодействия рака яичников многоклеточных сфероидов и мезотелиальной монослоя клеток. Этот тест моделирует ранних стадиях метастазирования рака яичников.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В пробирке мезотелиальной Анализ просвет, что модели ранних стадиях рака яичников Метастазы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Рак яичников занимает пятое место по количеству смертей от онкологических заболеваний в Соединенных Штатах1. Несмотря на положительный первичный ответ на терапию, у 70–90% женщин с раком яичников развиваются новые метастазы, и рецидив часто оказывается летальным2. Следовательно, необходимо понять механизмы возникновения вторичных метастазов, чтобы разработать более эффективные методы лечения рака яичников на промежуточных и поздних стадиях. Метастазирование рака яичников происходит, когда злокачественные клетки отделяются от первичного очага опухоли и распространяются по брюшной полости. Рассеянные клетки могут образовывать многоклеточные кластеры или сфероиды, которые либо остаются свободными, либо имплантируются в органы брюшной полости3 (Рисунок 1, Видео 1).
Все органы брюшной полости выстланы единым непрерывным слоем мезотелиальных клеток4-6 (Рисунок 2). Однако, как показали исследования электронных микрофотографий срезов удаленных тканей опухолей человека, под массивами перитонеальных опухолей мезотелиальные клетки отсутствуют3,5-7 (Рисунок 2). Это позволяет предположить, что мезотелиальные клетки вытесняются из-под опухолевого массива в результате неизвестного процесса.
Предыдущие эксперименты in vitro показали, что первичные клетки рака яичников прикрепляются к внеклеточному матриксу более эффективно, чем к мезотелиальным клеткам8, а более поздние исследования продемонстрировали, что первичные мезотелиальные клетки брюшины фактически создают барьер для адгезии и инвазии клеток рака яичников (по сравнению с адгезией и инвазией на субстратах, не покрытых мезотелиальными клетками)9,10. Это позволяет предположить, что мезотелиальные клетки служат барьером против метастазирования рака яичников. Клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых клетки рака яичников преодолевают этот барьер и вытесняют мезотелий, до недавнего времени оставались неизвестными.
Здесь мы описываем методику анализа in vitro, который моделирует взаимодействие между сфероидами клеток рака яичников и мезотелиальными клетками in vivo (Рисунок 3, Видео 2). Наш протокол был адаптирован на основе ранее описанных методов анализа взаимодействия клеток опухоли яичников с мезотелиальными монослоями8-16 и впервые был представлен в отчете, демонстрирующем, что клетки опухоли яичников используют интегрин-зависимую активацию миозина и силу тяги для того, чтобы способствовать вытеснению мезотелиальных клеток из-под опухолевого сфероида17. В данной модели используется флуоресцентная микроскопия с записью временных интервалов (time-lapse) для мониторинга двух популяций клеток в режиме реального времени, что позволяет получить пространственную и временную информацию о взаимодействии. Клетки рака яичников экспрессируют красный флуоресцентный белок (RFP), а мезотелиальные клетки — зеленый флуоресцентный белок (GFP). Сфероиды клеток рака яичников, экспрессирующие RFP, прикрепляются к мезотелиальному монослою, экспрессирующему GFP. Сфероиды распластываются, инвазируют и оттесняют мезотелиальные клетки, создавая отверстие в монослое. Это отверстие визуализируется как отрицательное пространство (черный цвет) на изображении GFP. Затем площадь этого отверстия может быть измерена для количественного анализа различий в активности очистки между контрольными и экспериментальными популяциями клеток рака яичников и/или мезотелиальных клеток. Данный анализ требует лишь небольшого количества клеток рака яичников (100 клеток на сфероид × 20-30 сфероидов на условие), поэтому его возможно проводить с использованием ценных образцов первичных опухолевых клеток. Кроме того, этот метод анализа может быть легко адаптирован для высокопроизводительного скрининга.
Протокол
1. Рак яичников Сотовые сфероид Формирование
- RFP-экспрессирующие клетки рака яичников культивируют в 10% базы Средний (пользовательские культуральной среде ячейку, содержащую 50:50 смесь 199 и MCDB105, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пера стрептококк). Чтобы выразить ППП в немеченого клеток рака яичников, трансфекции клеток плазмиды, содержащей ППП и выбрать для клеток, экспрессирующих ППП. Кроме того, вирусные векторы могут быть использованы для временно выразить флуоресцентные белки, или клетки могут быть предварительно инкубируют с красным флуоресцентным красителем клетки трекер (Invitrogen).
- До формирования сфероидов рака яичников, необходимо подготовить с низким коэффициентом сцепления 96 круглых блюд нижней культуры. Для производства с низким коэффициентом сцепления плит культуры, 30μl поли-НЕМА (6 мг полигидроксиэтилметакрилат в 1 мл 95% этанола) раствор добавляют в каждую лунку 96 Corning блюдо культуре клеток. 96 Пластины инкубировали при 37 ° C, не увлажненном инкубаторе для испарения этанола, лeaving пленка поли-НЕМА в каждую лунку. Это поли-НЕМА фильм мешает клеткам прикрепляться к нижней части так, что заставляет клетки растут в виде суспензии 18. [Кроме того, Ultra-Low вложений культуры пластин (Corning) может быть использован вместо поли-НЕМА покрытием блюд.]
- После того, как с низким коэффициентом сцепления плит культуры готовят, trypsinize тарелку яичника раковые клетки, гранулы клеток в настольные центрифуги (Heraeus) в 900 RCF в течение 3 минут, супернатант аспирации и вновь приостановить на 10% средней базы.
- Подсчитайте клеток с использованием гемоцитометра.
- Регулировка концентрации клеток, что есть 100 клеток в 50 мкл 10% средней базы.
- Добавить 50 мкл равномерно приостановлено разбавленной суспензии клеток в каждую лунку 96 поли-НЕМА покрытием блюдо культуры.
- Инкубируйте 96 пластины в 37 ° C культуре клеток инкубатора в течение 16 часов (это время должно быть увеличено или уменьшено в зависимости от количества времени, необходимого длячастности клеточная линия для формирования многоклеточных сфероидов или желаемых условий эксперимента), что позволяет клеткам рака яичников в кластер вместе, образуя единый многоклеточный сфероид в каждую лунку. Некоторые раковые клетки могут подвергаться апоптозу в этот период, поэтому важно выбрать время до индукции апоптоза.
2. Мезотелиальной формирования монослоя сотовых
- В капоте культуре клеток, предварительно покрыть скважины 6 и стеклянным дном Маттек блюдо с фибронектин, добавив 2 мл 5 мкг фибронектина / мл PBS раствора в каждую лунку в блюдо и инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут. Оптическое качество стекла основания в блюдах Маттек позволяет с высоким разрешением микроскопических изображений.
- GFP-экспрессирующих мезотелиальной клетки культивируют в 10% средней базы. Trypsinize тарелку мезотелиальные клетки, спина вниз в настольные центрифуги (Heraeus) в 900RPM течение 3 минут, аспирации супернатант, и вновь приостановить на 10% средней базы.мезотелиальной клетки, используемые здесь уже выразил GFP, когда они были получены, но немеченого мезотелиальные клетки могут быть получены путем трансфекции плазмидой, содержащей кДНК GFP или preincubating клетки зеленым флуоресцентным красителем клетки трекер (Invitrogen).
- После 30-минутной инкубации фибронектина (в пункте 2.1), промыть лунки блюдо Маттек с 2 мл PBS.
- Аспирируйте PBS и пластина 6 x10 5 мезотелиальной клетка на лунку в каждую лунку 6 и Маттек блюдо. Инкубируйте блюдо Маттек в 37 ° C культуре клеток инкубатор ночь, чтобы мезотелиальной клетки придают блюду и образуют монослой.
3. Мезотелиальной Анализ оформление сотовых
- С помощью пипетки, чтобы собрать сфероидов рака яичников с 96 поли-НЕМА покрытие пластин.
- Аспирируйте среды от одной скважины из 6 и Маттек блюдо с мезотелиальной монослоя клеток. Промыть раз с 2 мл PBS. Добавить все сфероидов от 96 рпоздно одну лунку блюдо Маттек (~ 3 число сфероидов, которые собираются быть отображены на счет для посадки сфероидов со стороны блюда, которые не могут быть отображены).
- Поместите блюдо Маттек на сцене перевернутой широкопольных флуоресцентного микроскопа способна выполнять замедленную изображения на протяжении по крайней мере 8 часов. Использование моторизованных этапе изображение несколько позиций в блюдо, с несколькими сфероид событий интеркаляции, в одном эксперименте. Мы используем Nikon Ti-E Перевернутая моторизованный Широкоугольные флуоресценции покадровой микроскоп со встроенным совершенная система фокусировки и низкий [20x-0.75 числовой апертурой (NA)] увеличение / NA дифференциального интерференционного контраста (DIC) оптики, трансиллюминатор Nikon галогенные с 0,52 А. большое рабочее расстояние (LWD) конденсатор, Nikon быстро (<100 мс время переключения) возбуждения и испускания фильтры (GFP Ex 480/40, Em 525/50, ЗП-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Саттер быстро передается и эпифлуоресцентной свет путь Смарт ShutТерс, Nikon линейной кодировкой моторизованных этапе Hamamatsu ORCA-AG охлаждения прибор с зарядовой связью (ПЗС) камеры, заказ микроскоп инкубации камеру с температурой и CO 2 управления, Nikon NIS-Elements AR версии 3, и TMC виброизоляции таблице.
- Яичников сфероидов раковые клетки будут оседать на дно блюда и приложить к мезотелиальной монослоя клеток. Соберите GFP, ППП и фазовые изображения 20 + сфероид / монослоя взаимодействия, каждые 10 минут, в течение 8 часов.
- RFP-выражения яичников сфероидов раковые клетки могут вторгаться в GFP-экспрессирующих мезотелиальной монослоя клетки создания отверстий в монослое. После 8 часов, измерения размеров отверстий, прослеживая черных дыр в GFP изображений с использованием элементов программного обеспечения (или другого соответствующего программного обеспечения, такие как изображение J). Нормализовать размер отверстия в исходное сфероид размера путем деления размера отверстия в 8 часов по размеру сфероид в соответствующий образ ППП в нулевой момент времени. В этой бывшейпример, размер отверстия измеряется только один раз, но она может быть измерена несколько раз в течение восьми часов эксперимент, чтобы лучше понять динамику интеркаляции.
4. Представитель Результаты
В этом примере, мы сравнили мезотелиальной возможность оформления OVCA433 яичника раковые клетки сфероидов, которые имеют ослабленный выражение Талин-1 для контроля OVCA433 сфероидов. OVCA433 сфероидов из каждой группы были добавлены в блюдо Маттек содержащие ZT мезотелиальной монослоя клеток. Шесть сфероидов из каждой группы были обследованы через каждые 10 минут в течение восьми часов (рис. 4, фильм 3 фильм 4). Отверстий производится в монослое по распространению сфероидов были измерены и шесть позиций из каждой группы были усреднены. Рисунок 4 показывает, что средняя площадь оформление созданного Талин 1 сфероидов нокдаун был значительно меньше, чем средняя площадь созданного управления сфероидов, предполагая, что Таллин требуется для оформления мезотелиальной на OVCA433 сфероидов рака яичников.
Рисунок 1. Метастазы рака яичников. Первичные опухоли яичников или развиваться из эпителия яичников поверхности или фаллопиевых труб. Опухолевые клетки / кластеров оторваться от первичной опухоли и собирать в брюшной полости. Опухолевые клетки могут объединять для формирования многоклеточных сфероидов. Сфероидов затем приложить к мезотелиальной монослоя клетки, выстилающие брюшную полость. Мезотелиальной клеток исключены из под прилагаемой сфероид рака яичников, что позволяет сфероидов, чтобы получить доступ к основным базальной мембраны.
Фильм 1. Метастазы рака яичников. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Рисунок 2. мезотелиальной линии клеток поверхности человеческого перитонеальный ткани и исключены из яичников под имплантаты раковых клеток.
Рисунок 3. Мезотелиальной Анализ оформления. Сфероидов Рак яичника образуется путем инкубации 100 RFP-выражения рака яичников клеток на лунку в поли-НЕМА покрытием 96 круглых блюдо нижней культуры при 37 ° С в течение 16 часов. Поли-HEMA препятствует клеткам прикрепляться к культуре блюдо, позволяя клеткам оставаться во взвешенном состоянии и соблюдать друг с другом в единый кластер на лунку. Мезотелиальной монослоя клеток подготовленного нанесение 6x10 5 мезотелиальной клеток на лунку в фибронектина покрытием 6 хорошо блюдо Маттек и инкубирования пластин при 37 ° С в течение 16 часов. Сфероидов, которые затем передаются на блюдо с Маттек мезотелиальной монослоя и двух клеточных популяций загружаются через каждые 10 минут в течение 8 часов при использовании Nikon Ti-E Inverted моторизованный Широкоугольные флуоресценции покадровой микроскоп и элементы программного обеспечения.
Фильм 2. Мезотелиальной Анализ оформления. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Рисунок 4. Ослабление Талин 1 выражение в OVCA433 сфероидов уменьшается мезотелиальной возможность оформления. OVCA433 сфероидов (красный) и без ослабленного выражение Талин 1 было разрешено присоединиться к вторжению и в ZT мезотелиальной монослоя (зеленый). Эти две популяции клеток были обследованы через каждые 10 минут в течение 8 часов при использовании Nikon Ti-E Перевернутая моторизованный Широкоугольные флуоресценции покадровой микроскоп и элементы программного обеспечения. График показывает, что ослабление Талин 1значительно снижает мезотелиальной оформления ячейки (квантиль участок с зелеными полосами на средства).
Фильм 3. Управление OVCA433 сфероидов (красный) вторжение в мезотелиальной монослоя (зеленый). Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Фильм 4. Ослабление Талин 1 выражение в OVCA433 сфероидов (красный) уменьшается мезотелиальной (зеленый) оформление способности. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
"Анализ мезотелиальной просвет", представленные здесь используется замедленная микроскопии для наблюдения за взаимодействием рака яичников многоклеточных сфероидов и мезотелиальной монослоя клетки, в больших пространственных и временных деталей. Ранее несколько групп 8-14 использовал конечной анализы, чтобы показать, что клетки рака яичников придают и вторгнуться в мезотелиальной монослоя клеток. Этот тест уникален тем, что он использует флуоресцентно меченых клеток отличить опухолевые клетки от мез...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Nikon Imaging центр в Гарвардской медицинской школе, в частности, Дженнифер воды, Лара Петрак и Венди лосося, для обучения и использования их микроскопы Timelapse. Мы также хотели бы поблагодарить Роза Ng и Ахим Бессер за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана NIH Грант 5695837 (М. Iwanicki) и GM064346 к АБ, за счет гранта от доктора Мирьям и Шелдон Адельсон Г. Medical Research Foundation (для АБ).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| OVCA433 клеток рака яичников | Подарок от д-р Деннис Slamon | ||
| ZT мезотелиальные клетки | Подарок от доктора Тана Инс | ||
| Среды 199 | Гибко | 19950 | |
| MCDB105 | Сотовые Приложения Инк | 117-500 | |
| FBS-тепло инактивированная | Гибко | 10082 | |
| Пен-Strep | Гибко | 15070 | |
| 96 пластин | Corning Costar | 3799 | |
| Полигидроксиэтилметакрилат (поли-НЕМА) | Sigma Aldrich | 192 066-25G | Для поли-НЕМА решение растворить 6 мг поли-НЕМА порошок в 1 мл 95% этанола |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Разбавить до 95% в дН 2 0 |
| Капот клеточных культур | Nuaire | NU-425-300 | |
| Культуры ткани инкубатор | Thermo Scientific | 3110 | |
| инкубатор для поли-НЕМА пластин | Labline инструменты | Императорский III 305 | |
| Настольная центрифуга | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 хорошо стеклянным дном блюдо | Маттек корп. | P06G-1.5-20-F | |
| Фибронектин | Сигма | F1141-1 мг | |
| PBS | CellGro | 21-040-CV | |
| Timelapse микроскоп: | |||
| Микроскоп | Nikon | Ti-E Перевернутый Моторизованный флуоресцентный покадровой микроскоп со встроенным совершенная система фокусировки | |
| Объектив | Nikon | 20X-0.75 численного apeture | |
| Галогенные трансиллюминатор | Nikon | 0,52 NA долго конденсатора рабочее расстояние | |
| Возбуждение и излучение фильтры | Chroma одного фильтры проходят в Nikon жилья | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Передаются и Epifluoresce пути света | Саттер | Умные жалюзи | |
| Линейный кодировке моторизованных этапе | Nikon | ||
| Охлаждение с зарядовой связью камеры устройства | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Микроскоп инкубации камеру с температурой и CO 2, контроль | изготовленный на заказ | ||
| Таблица Виброизоляция | TMC | ||
| NIS-Elements программное обеспечение | Nikon | Версия 3 |
Ссылки
- Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 (2007).
- Burleson, K. M. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
- Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).
- Zhang, X. Y. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Ksiazek, K. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).
- Heyman, L. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).
- Heyman, L. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502 Forthcoming.
- Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).
- Leroy-Dudal, J. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).
- Iwanicki, M. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
- Roberts, P. C. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
- Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
- Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).
- Brandt, B. 3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).
- Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
- Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).
- Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
