Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Шаг за шагом метод для разведения Transporter ABC в Nanodisc липидных частиц

25.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3910

⸱

31 августа 2012 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

В этой статье

Краткое содержание

Nanodiscs малых дисковидные частицы, которые включают мембранных белков в небольшой патч фосфолипидного бислоя. Мы предоставляем визуальный протокол, который показывает, шаг за шагом включения MalFGK2 транспортера на диск.

Аннотация

Nanodisc является дисковидные частицы (~ 10-12 нм большой), что ловушка мембранных белков в небольшой патч фосфолипидного бислоя. Nanodisc является особенно привлекательным вариантом для исследования мембранных белков, особенно в контексте лиганд-рецепторных взаимодействий. Метод пионером Sligar и коллегами основана на амфипатическими свойства разработаны высоко-спиральной эшафот белок, полученный из аполипопротеина A1. Гидрофобные лица белка эшафот взаимодействовать с ацил боковых цепей липидного бислоя в то время как полярные регионы сталкиваются с водной средой. Анализы мембранных белков в nanodiscs имеют значительные преимущества по сравнению с липосомами, поскольку частицы мелкие, однородные и растворимые в воде. Кроме того, биохимических и биофизических методов обычно зарезервированы для растворимых белков могут быть применены, и по обе стороны от мембраны. В этой визуальной протокол, мы представляем шаг за шагом, восстановление и характеристикиризуется бактериальных транспортеров ABC, мужчины MalFGK 2 комплекса. Формирование диска процесса самосборки, что зависит от гидрофобных взаимодействий, происходящих в ходе постепенного устранения моющего средства. Мы опишем основные шаги, и мы подчеркиваем важность выбора правильного белок-липидного соотношения для того, чтобы ограничить образование агрегатов и больше полидисперсных липосомы частицы. Простой контроля качества, такие как гель-фильтрации хроматографии, родной гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света убедиться, что диски были должным образом восстановлена.

Протокол

Общий процесс разведения

Начнется процесс восстановления путем смешивания мембраны эшафот белка (MSP) с очищенной MalFGK 2 комплекса в присутствии детергента солюбилизированной фосфолипидов. Этот шаг последующим медленным удаления моющего средства по адсорбента материала полистирола называется Bio-Beads или Amberlite (рис. 1). Автоматический процесс сборки происходит, скорее всего, из-за аполярная взаимодействия между гидрофобными фосфолипидов, MalFGK 2 комплекса и поверхности MSP амфипатическими белка. Конечный продукт представляет собой дисковидные частицы состоят из двух молекул упаковки MSP вокруг MalFGK 2 комплекса. Частицы отделяются от аддуктов и агрегатов ультра-центрифугирования и аналитической гель-хроматографии. Частицы характеризуются родной-гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света.

Название "> 1. Подготовка мембранных белков леса, MSP

  1. Его с метками MSP (версия MSP1D1 1) производится из плазмиды pMSP1D1 в E. палочки BL21 (DE3), индуцированного на OD 600 ~ 0,5 с 0,5 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид в течение 3 часов при 37 ° C.
  2. Клетки собирают центрифугированием при 5000 х г в течение 10 мин при 4 ° C и ресуспендировали в TSG10 буфера, содержащего 100 мкМ phenylmethanesulfonyl фтора.
  3. Клетки лизируют с французской прессы (3x) в 8000 фунтов на квадратный дюйм и нерастворимые вещества удаляют центрифугированием при 5000 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Растворимые фракции, содержащей MSP выделяют ультра-центрифугирования при 125000 х г в течение 45 мин.
  4. MSP очищают никель-хелатирующей хроматографии с использованием ~ 1,5 мл Ni сефарозой HP в TSG10 буфера. Загрязняющие вещества вымываются с TSG10 буфера, содержащего 50 мМ имидазола. MSP элюируют TSG10 буфера, содержащего 600 мМимидазола. Очищенный белок диализовали в TSG10 буфер и хранится в -70 ° С при концентрации белка ~ 10-15 мг / мл.

2. Подготовка MalFGK 2 комплекс

  1. MalFGK 2 комплекса, его метками на С-конце Malk, выражается из плазмиды pBAD22-FGK в E. палочки BL21 (DE3) и индуцированные на OD 600 ~ 0,5 с 0,2% L-арабинозы в течение 3 часов при 37 ° C.
  2. После лизиса клеток и центрифугирования, как в пункте 1.3, мембраны осадок ресуспендируют в TSG20 буфера при конечной концентрации 5 мг / мл. Материал растворяется с 1% в / о N-додецил-β-maltopyranoside (DDM) в течение 3 ч при 4 ° С при осторожном встряхивании.
  3. Нерастворимый материал удаляется с помощью ультра-центрифугирования, как и в шаге 1.3 и супернатант, содержащий солюбилизированной MalFGK 2 комплекса собирают и очищают, как в пункте 1.4, но без диализа.
  4. FurtheГ очистка достигается путем гель-фильтрации в TSGD буфера на Superdex 200 HR 10/300 столбцов при скорости потока 0,5 мл / мин.

3. Подготовка Фосфолипиды

  1. E. палочки общего липидного экстракта растворяют в хлороформе отделяется в 1000 нмоль аликвоты в пробирках винтовой крышкой отцентрифугировать. Растворитель выпаривают при слабой струей азота и сушат дальнейшее течение ночи в вакуумном эксикаторе.
  2. Липидную пленку растворяли в буфере TS на 5 нМ конечной концентрации и встряхивали энергично и ультразвуком. Растворяют липиды появится слегка матовой из-за их общей неразрешимости в водном буфере TS, но они должны оставаться во взвешенном состоянии. DDM добавляют до конечной концентрации 0,5% (~ 10 мм), при которой раствор становится прозрачным.
  3. Липидов смесь помещают на водяную баню и пульс обрабатывали ультразвуком в течение 5 раз за 5 сек. Липидную смесь хранится при температуре 4 ° С в течение максимум 1 крошечныйк.

4. Подготовка Bio-Beads

  1. Примерно 10-15 мл (объем сухого) Bio-Beads помещают в 50 мл трубки.
  2. Бисер последовательно промывали 50 мл 100% метанола, 95% этанола, MilliQ H 2 O, и, наконец, TS буфера (два раза).
  3. Промытый бисером хранятся при температуре 4 ° C в ~ 10 мл буфера TS.

5. Восстановление Nanodisc

  1. MSP разводят в TSGD буфера при конечной концентрации ~ 7 мг / мл (~ 0,3 мм).
  2. ~ 2 нмоль очищенного MalFGK 2 комплекса смешивают при белка: MSP: липидный отношение 1:3:60 или 1:3:400 в TSGD буфера. Конечная концентрация составляет 6 мкм MalFGK 2, 18 мкМ MSP и 360 мкМ липидов (1:3:60) или 2,4 ммоль липидов (1:3:400). Конечный объем составляет 300 мкл. Конечная концентрация DDM составляет 0,08% (~ 1,6 мм). Конечная концентрация глицерина зависит от количества липидов добавил, но остается около 5-10% V / v
  3. ~ 50 мкл Bio-Bead суспензии добавляют в пробирку, и смесь инкубировали в течение ночи на качающейся таблицы при 4 ° C.
  4. Бисер осаждают тяжести и решения пипеткой через узкий наконечник, чтобы избегать, насколько Bio-Beads насколько это возможно.
  5. Большая осадка удаляются ультра-центрифугирования при 100000 х г в течение 20 мин. Диски очищают с помощью гель-фильтрации, как в пункте 2.4 в TSG10 буфера. Фракции, содержащие диски объединяются и аликвоты должны закачиваться на той же колонке гель-фильтрации для проверки стабильности препарата.
  6. Очищенные диски могут храниться при -70 ° C в течение длительного периода времени. После оттаивания на льду, диски должны быть подвергнуты ультра-центрифугирования, как и в шаге от 5,5 до устранения потенциальных осадков. Аликвоты должны быть проанализированы гель-фильтрации, чтобы гарантировать, что значительная агрегация или осадки не происходят во время оттаиванияпроцесса.

6. Родные гель-электрофореза

  1. 1 мкМ nanodiscs (~ 0,2 мг / мл) анализируют родной стр. 6, 7 (Трис-HCl, рН 8,8, 4-12%) для оценки качества восстановления (рис. 3А).
  2. Связывание мужчин (1 мкМ) в MalFGK 2-комплекса воссоздана в nanodiscs также оценивается по родным-PAGE (рис. 3А).
  3. После электрофореза гель окрашивали кумасси синим в течение 10 мин, и обесцвечивают в течение ~ 1 часа.

7. Динамического рассеяния света (DLS)

  1. Nanodiscs очищают гель-фильтрации, как в пункте 2.4 в TSG10 буфера, используя Superdex 200 HR 10/300 столбцов при скорости потока 0,1 мл / мин. Фракции, содержащие nanodiscs объединяют и концентрируют до ~ 10 мг / мл с Amicon центробежного фильтра.
  2. Образец фильтруют дважды (0,22 мкм) до анализа DLS использованияDynapro nanostar инструмента (Wyatt Technology) в 1 мкл внутреннего объема кварцевых кювет. Данные устанавливается с помощью динамика программного обеспечения (Wyatt Technology) для оценки диаметра и молекулярной массы частиц.

8. АТФазы Измерения

  1. АТФазы MalFGK 2-восстановленного nanodiscs определяется с использованием колориметрического анализа 8.
  2. 1 мкМ очищенных дисков и 1 мМ ATP смешивают с увеличением количества мужчин и инкубировали при 37 ° С в течение 20 мин. Освобождение неорганического фосфата измеряется при 660 нм.
  3. Количество высвобожденного фосфата по сравнению с стандартной кривой, полученной с раствором Стандартный фосфора.

9. Представитель Результаты

Nanodiscs очищают гель-фильтрации хроматографии (рис. 2А, слева). Хроматограмма показывает, что большинство из восстановленного DISCS (черный след) элюируются как единый пик, в то время как диски сделаны с избытком липидов (красный след) элюируются в свободном объеме и в серии широких пиков. Качество nanodiscs далее анализируются родной гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света (DLS). Правильно восстановленный диск миграцию как резкое полосы на геле в то время как те, восстановленный в присутствии избытка липидов мигрировать в мазке (рис. 2A, справа). Анализ показывает, что DLS диск население является однородным со средним диаметром 11,4 нм (рис. 2В). Восстановленные диски имеют молекулярную массу в 215 кДа на основе приближения DLS. Образцы воссоздана в присутствии избытка липидов дисплей широко распространены радиусы около 100 нм, что характерно для неоднородных образцов.

Качество MalFGK 2 комплекса оценивается по родным-гель-электрофореза и его деятельность АТФазыизмерений (рис. 3). Мальтоза обязательной мужской белок связывается с высоким сродством к MalFGK 2 транспортера 9, 10. Использование неденатурирующем гель-электрофореза, можно обнаружить сложную между мужчиной и MalFGK 2 (рис. 3А). Стимулирование Malk 2 АТФазы мужского показано на рисунке 3b.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Типичная схема для восстановления протокола.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Контроль качества nanodisc подготовки. A. Гель-фильтрация анализа (Superdex 200 HR 10/300 столбца) nanodiscs восстановленные при низком соотношении липидов (1/3/60, черный след) или высоким соотношением липидов (1/3/400, красный след). Родные гель-электрофореза одного и того же препарата диска. Молecular маркеров вес в кДа указаны. В. Динамические рассеяния света анализа одного и того же препарата диска. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

figure-protocol-3
Рисунок 3. Анализ MalFGK 2-nanodisc частиц. A. Гель сдвиг анализ мужской инкубировали с увеличением количества MalFGK 2-nanodisc частиц. B. АТФазы MalFGK 2-nanodisc частиц как функция мужчины концентрации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы опишем простую процедуру для разведения мальтоза транспортера в nanodiscs. Транспортер АТФазы активного и взаимодействия с растворимым обязательного партнера-мужчины могут быть воссозданы (рис. 3). Успешное восстановление транспортера в nanodiscs открыть путь для дополнительного биофизических и биохимических исследований. Особый интерес будут представлять систематический анализ Malk АТФазы и мальтозу транспортной деятельности в производстве моющих средств, липосомы и nanodiscs. ABC транспортеров изме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана Канадский институт исследований в области здравоохранения. CSC была профинансирована докторской стипендии с естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады. FD является Tier II Канада заведующая кафедрой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
Amicon Ультра-4 50K центробежный фильтр Millipore UFC805008 Следуйте протоколу производителя для надлежащего использования
Bio-Beads SM-2 Адсорбент Bio-Rad 152-3920
E.coli, общих липидов Avanti Polar Lipids 100500C Растворяют в хлороформе, обращаться по мере необходимости для органического растворителя
Ni сефарозе HP смолы GE Healthcare 17-5268-01
Решение фосфора стандартных Sigma-Aldrich P3869
pMSP1D1 Addgene 20061
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare 17-5172-01
Таблица I. Конкретные реагенты.
Имя Состав Комментарии
DDM складе 10% вес / объем DDM Ресуспендируют в MilliQ воду и хранят при -20 ° C
MalFGK 2 акции 1-2 мг / мл
50 мМ Трис-HCl, pH7.9
100 мМ NaCl
10% объем / объем глицерина
0,03% вес / объем DDM 		Хранить при температуре от -70 ° C после очистки
MSP складе 10-15 мг / мл
50 мМ Трис-HCl, pH7.9
100 мМ NaCl
10% объем / объем глицерина 		Хранить при температуре от -70 ° C после очистки в <1 мл аликвоты и избегать чрезмерного циклов замораживания / оттаивания
Фосфолипидов складе 5 нМ E. палочка общих липидов
0,5% м / о (10 мМ) DDM
50 мМ Трис-HCl, рН 7,9
50 мМ NaCl 		Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 недели
TS буфер 50 мМ Трис-HCl, рН 7,9
50 мМ NaCl 		Хранить при температуре 4 ° C
TSG10 буфер 50 мМ Трис-HCl, pH7.9
100 мМ NaCl
10% объем / объем глицерина 		Хранить при температуре 4 ° C
TSG20 буфер 50 мМ Трис-HCl, рН 8
100 мМ NaCl
20% объем / объем глицерина 		Хранить при температуре 4 ° C
TSGD буфер 50 мМ Трис-HCl, pH7.9
100 мМ NaCl
10% объем / объем глицерина
0,03% вес / объем DDM 		Хранить при температуре 4 ° С и добавить DDM непосредственно перед употреблением

Таблица II. Решение рецептов.

Ссылки

  1. Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).
  2. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).
  3. Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment. J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).
  4. Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA. EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).
  5. Mi, L. -Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs. Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).
  6. Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).
  7. Dalal, K., Duong, F. Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs. Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).
  8. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).
  9. Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).
  10. Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action. Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).
  11. Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).
  12. Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs. Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).
  13. Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies. Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).
  14. Wan, C. -P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks. Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).
  15. Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs. Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).
  16. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Cytochromes P450 in Nanodiscs. Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).
  17. Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome. J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Bio Beads
Шаг за шагом метод для разведения Transporter ABC в Nanodisc липидных частиц
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.