Мы описываем методологию быстрой, чтобы изолировать и культуры гиппокампе и коре нейроны от грызунов эмбрионов. Этот протокол позволяет проводить эксперименты, в которых почти чистой культуры нейронов не требуется.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и культуры крысы эмбриональных нервных клеток: Быстрый протокол
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мы описываем быстрый способ отделить и культуры гиппокампа и коры нейроны от E15-17 крысиных эмбрионов. Эта процедура может быть успешно применен для выделения мышиных и человеческих первичных нейронов и нейронных предшественников. Диссоциированных нейронов поддерживается в бессывороточной среде до нескольких недель. Эти культуры могут быть использованы для nucleofection, иммуноцитохимия, нуклеиновых кислот подготовки, а также электрофизиологии. Пожилые нейронов культуры можно трансфекции с хорошей скоростью эффективность лентивирусов трансдукции и менее эффективно, с фосфатом кальция или на основе липидов такие методы, как липофектамина.
Протокол
1. Поли-D-лизин (PDL): Подготовка
- Добавьте 5 мл стерильной DDH 2 O 5 мг PDL для получения маточного раствора 1 мг / мл.
- Смешайте маточного раствора с помощью пипетки несколько раз.
- Используйте сразу или хранить поли-D-лизин решения при температуре 2-8 ° C.
2. Поли-D-лизин (PDL): Покрытие пластиковой посуды культуре клеток
- Развести PDL маточного раствора стерильной DDH 2 O в конечной концентрации 10 мкг / мл.
- Внесите достаточно раствора в 60 мм блюдо для покрытия культуры поверхности (3 мл на 60 мм блюдо).
- Рок осторожно, чтобы обеспечить ровное покрыт....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод вскрытия и культуры гиппокампа крыс и корковых нейронов описаны здесь позволяет проводить эксперименты с использованием почти чистый нейронных культур, выращенных в химически определенной среде (рис. 3). Хотя протоколы для культивирования почти чистый нейронов в сыворотке крови, свободные средства массовой информации были ранее описаны 2,3,4, есть важные изменения, внесенные в наш метод. В отличие от традиционных протоколов (например, банкир и др.). 5, мы заменили трипсина с .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим Jonna Ellis за помощь в редактировании. Проект описан была поддержана премии Количество R01MH079751 (PI: Ф. Перуцци) из Национального института психического здоровья. Содержания несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института психического здоровья и Национального института здоровья.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент | Концентрация | ||
| Neurobasal | 98% | ||
| B27 | 2% | ||
| Glutamax | 0,5 мМ |
Таблица I. Neurobasal/B27 полной среде.
| Реагент | Концентрация |
|---|---|
| Глюкоза | 16 мм |
| Сахароза | 22 мм |
| HEPES | 10 мМ |
| NaCl | 160 мМ |
| KCl | 5 мМ |
| Na 2 HPO 4 | 1 мМ |
| KH 2 PO 2 | 0,22 мм |
| Гентамицин | 50 мкг / мл |
| Fungizone | 250 нг / мл |
| рН | 7,4 |
| Осмолярность | 320-330 мОсм |
Таблица II. Вскрытие среды.
| Реагент | Объем (мкл) |
|---|---|
| Neurobasal/B27 полной среде | 240 |
| Трипановый синевы 0,4% | 250 |
| Общий | 490 |
Таблица III. 50x Подсчет решение.
Таблица IV. Специальные реагенты.
| Реагент | Компания | Кат. номер |
|---|---|---|
| Hibernate E | Brainbits | 767171 |
| Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
| B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
| Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
| Гентамицина сульфат | Sigma Aldrich | G1264 |
| Glutamax 200 мМ | Gibco, Invitrogen | 35050 |
| TrypLE Экспресс без фенола красного | Gibco, Invitrogen | 12604 |
| Цитозин-β-D-арабинофуранозида гидрохлорид | Sigma Aldrich | C6645 |
| Поли-D-лизин | Sigma Aldrich | P6407 |
| Ламинин 1 мг / мл | Millipore | CC095 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
| Трипановый синевы 0,4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
| Оборудование | Компания | Кат. номер |
|---|---|---|
| Стерео микроскоп | Олимп | SZ61 |
| Большие щипцы | FST | 11022-14 |
| С острым концом щипцов | Мория | MC40B |
| Micro острым концом щипцов | Мория | MC31 |
| Razor-острыми ножницами | Roboz | RS-6820 |
| Micro Анатомический ножницы | FST | 91460-11 |
| Micro Анатомический изогнутые ножницы | FST | 14067-11 |
| Стекло 2-камерные слайды | Лаборатория-Tek | 154461 |
| 60 мм блюда | BD Сокол | 353002 |
| 100 мм блюда | Гранулирование | 430167 |
| 15 мл труб | BD Сокол | 352099 |
| 1,5 мл крио-трубка флакон | Nunc | 375353 |
Таблица V. Специальное оборудование.
Ссылки
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
