Использование робота для высокой пропускной кристаллизации мембранных белков в липидный Мезофазы

Краткое содержание

Здесь описан робот подход к высокой пропускной способности кристаллизации мембранных белков в липидный мезофаз для использования в составе определения макромолекулярных использованием рентгеновской кристаллографии. Три роботы способны справиться с вязкой и липкой белка-Ладена мезофазы интегрального метода вводятся.

Аннотация

Структурно-функциональных исследований мембранных белков значительно выиграют от наличия доступных высоким разрешением 3-D структур типа осуществляется через макромолекулярных рентгеновской кристаллографии (MX). Важным компонентом MX является стабильное снабжение идеально дифракционного качества кристаллов. В мезо или липидные кубической фазы (LCP) методом кристаллизации мембранных белков является одним из нескольких методов, доступных для кристаллизации мембранных белков. Это делает использование бинепрерывных мезофазы, в которых растут кристаллы. В качестве метода, он имел некоторые впечатляющие успехи в последнее время и привлекла много внимания со многими исследовательскими группами в настоящее время заинтересованы в ее использовании. Одна из проблем, связанных с методом является то, что мезофазы хостинга является чрезвычайно вязкий и липкий, напоминает толстую зубную пасту. Таким образом, распределяя его вручную в воспроизводимым образом в небольших объемах в кристаллизации скважин требует умения, терпения и твердая рука. Протокол для этого дзюго, который был разработан в мембране структурных и функциональных биологии (MS & FB) Группа ^1-3. Юпитер статьи видео с описанием способа доступны ^1,4.

Руководство подход к созданию в мезо испытаний имеет явные преимущества по специальности приложений, таких как оптимизация кристалла и производных. Она тем не менее страдают от того, низкий метод пропускную способность. Здесь мы демонстрируем протокол для проведения испытаний в мезо кристаллизации робота. Робот предлагает преимущества скорость, точность, миниатюризация и быть в состоянии работать непрерывно в течение длительного времени, при каких можно было бы рассматривать как враждебные условия, такие как в темноте, в восстановительной атмосфере или при низких или высоких температурах. В мезо-робот, при правильном использовании, может значительно улучшить производительность мембранной структуры и функции белка исследований, способствуя кристаллизации, которая является одним из самых медленных шагов вобщий трубопровод определения структуры.

В этом видео статье мы покажем, использование трех коммерчески доступных роботов, которые могут обойтись вязким и липким мезофазы неотъемлемой В кристаллогенезиса мезо. Первый робот был разработан в MS & FB Группа ^5,6. Два других недавно стали доступны и включены здесь для полноты.

Обзор протокола описаны в этой статье представлен на рисунке 1. Все манипуляции проводились при комнатной температуре (~ 20 ° C) в условиях окружающей среды.

Протокол

1. Подготовка к кристаллизации плиты

Настройка делать кристаллизации суда робота начинается с подготовки опорной плите кристаллизации стекла плита (рис. 2), подробно описанный в ссылке 2. Опорная плита должна быть сначала силанизированного и перфорированной двойной палки Spacer, который создает скважин, должны быть применены к пластине. Сырье и материалы, необходимые для этого классифицируются в соответствии материалы.

1. Поместите пластину на бумажное полотенце, нанесите несколько капель силанизирующий решения и распределять его равномерно по всей поверхности пластины с бумажной ткани.
2. Удалите излишки силанизирующий решения путем погружения пластины в стакане воды.
3. Возьмите пластину из стакана, положите его на сухой бумажной салфеткой, силанизированного стороной вверх, и высушите ее открытой поверхности, протирая слегка с бумажным полотенцем.
4. Снимите защитную крышку на перфорированные, двойной палки Spacerи применять прокладки, клейкой стороной вниз, в сухом, силанизированного поверхности стеклянной пластины. Убедитесь, что прокладка расположена правильно на опорной плите, с верхнего левого угла и двух смежных сторон прокладку и пластину, совпадают.
5. С помощью валика или осел выравниваться прокладку на опорной плите и создать герметичное уплотнение между ними.

Готовые пластины являются коммерчески доступными (HR3-151, Hampton исследований; MD11-55-100, молекулярных размеров, и LCP96T-UVP70U, Swissci). По соображениям экономии средств, мы предпочитаем, чтобы собрать наши собственные пластины после протоколе выше.

2. В мезо Робот 1

Первый в мезо-робот будет показано в этой статье видео является одним используемых в настоящее время в MS & FB Group (рис. 3). Полная информация о роботе можно найти в разделе Материалы и в справочном разделе ^5. Материалов и оборудоваNT, необходимые для создания кристаллизации испытание с использованием робота классифицируются в соответствии материалы.

1. Поместите основание пластины с проставками подготовлен в разделе 1 на палубе робота. Она имеет свою собственную платформу, отмеченные позиции также в целях опорная плита выравнивания. Пластины должны быть маркированы для идентификации.
2. Закрепите 96-а осадителя блок в своей собственной платформы на палубе робота рядом с кристаллизацией пластины.
3. Откройте блок тщательно отшелушивающим пластиковый колпачок.
4. Включите увлажнитель и направить поток влажного воздуха над и между опорной плитой на палубе робота. Увлажнитель было показано, чтобы уменьшить испарение осадителя решения и повысить воспроизводимость по кристаллизации пластин ^5. Это может быть включено до настройка предварительно увлажнить области при относительной влажности окружающего воздуха низкая, или иначе, незадолго до выдачи мезофазных начинается.
5. Инициализация робота в соответствии с инструкциями производителя. Инструмент конкретные инструкции не будут описаны здесь в деталях, потому что точные процедуры будут меняться с течением времени. По существу, то, что происходит во время инициализации является то, что мезофазы выдачи руку на робота обеспечивается со ссылкой позиции в трех ортогональных направлениях X, Y и Z.
6. Прикрепить белок-Ладена мезофазы в шприце Hamilton, в комплекте с иглой отпуска, чтобы Arm 1 из робота (рис. 3). Полная информация о том, как подготовить мезофазы и как загрузить его в шприце были описаны в литературе 3,7-10.
7. Снимите верхнюю защитную крышку с прокладкой на кристаллизацию опорной плитой и выровнять скважин на пластине с реперных на опорной плите платформы. Обратите внимание, что для целей этого видео, защитная крышка была оставлена ​​на месте, чтобы помочь просмотра во время выравнивания шаг.
8. Выровняйте кончик иглы из syring выдачие с нижней части верхней и в левом углу кристаллизации пластин (ну A1). Это делается на глаз регулировки высоты или Z-координаты выдачи руки, наблюдая, как близко кончике иглы доходит до дна ямы. То, что кончик слегка касаясь дна ямы, можно судить по движущейся пластиной из стороны в сторону на платформу, пока очень немного регулировки высоты руку выдачи.
9. Введите в компьютер Z-координаты выдачи руки, где кончик контактах пластины. Дозирование запрограммирован пройдет с кончика иглы 80 мкм от этой ссылкой Z-позиция, которая соответствует поверхности опорной плиты.
10. Позиция на глаз кончик иглы в центре ну A1. Хранить в управляющий компьютер ссылкой X, Y координаты выдачи руки, где чаевые по центру. Это координат используется для определения центра оставшиеся лунки на тарелку.
11. PrIME шприц, используя соответствующую команду роботу компьютера, чтобы свежие мезофазы заполняет выдачи иглы и, что первый и последующие скважины получают полный комплект мезофазы. Протрите экструдированного мезофазы на кончике иглы с тканью.
12. Начало Run Robot (X-AP) программы, чтобы начать раунд промывки шагов, где осадителя выдачи советов по 2 из рук робота промывают и готовят для аспирации решения от осадителя блока.
13. Активировать функцию отказаться от робота приводится в движение последовательной загрузки скважин с белком-Ладена мезофазы (обычно 50 NL) во-первых, колонна из восьми скважин на время, а затем осадителя решения (как правило, 800 п). Между загрузки колонны, мезофазы выдачи рука возвращается в парковочное положение, где конец иглы находится в увлажненной губкой, чтобы предотвратить мезофазы на кончике от высыхания. Процесс выдачи мезофазы и осадителя повторяется11 раз по всей пластине, пока тарелка не будет заполнена. Загрузка 96-луночный планшет с мезофазы и осадителя занимает 5 минут, чтобы закончить.
14. Как только пластина заполняется и манипуляторы вернулись на свои позиции парк, удалить пластину с палубы робота и разместить его на плоской твердой поверхности.
15. Сразу же, уплотнения пластины с крышкой стекла, чтобы минимизировать зависящие от времени изменения в хорошо композиции. Важно обеспечить, чтобы все 96 лунок полностью покрыты, что крышка стекла выравнивается площадь с опорной плитой и что ни один из кавер-стекло простирается за пределы след опорной плите. Валиком или осел используются для создания плотной и равномерной уплотнения между крышкой стекла и прокладки.
16. Осмотрите пластину, чтобы убедиться, настройка пошла как надо. Что он ищет это "жареное яйцо на сковороде" Появление в каждую лунку. Желток яйца жареные соответствует мезофазы. Белое яйцо осадителя solutiи на краю кастрюли периметру кристаллизации хорошо. В идеале, три концентрические.
17. Поместите пластину в контролируемой температурой хранения для роста кристаллов.
18. Если больше нет пластины следует создать, удалить осадителя блок с палубы робота, плотно заклейте его и положил его обратно в хранилище.
19. Удалите шприц, содержащий мезофазы от выдачи рука робота, разобрать его, и мыть ее части, включая выдачи иглы и наконечник, тщательно метанола и сухой в рамках подготовки к следующему использованию.

3. В мезо Робот 2. Mosquito LCP

Mosquito LCP робота (рис. 4) включает в себя дозатор мезофазы аналогичный тому, который используется Робот 1. В отличие от роботов 1, распределяет осадителя с помощью одноразовых наконечников. Программное обеспечение используется для настройки инструмента для работы с пластинами частности кристаллизации и осадковМуравей блоков и отказаться определяемых пользователем объемы мезофазы и осадка в указанной последовательности. Такая информация представлена ​​заводом-изготовителем и не будут описаны здесь.

1. Подготовка шприца Гамильтона, в комплекте с иглой и заполнить с белком-Ладена мезофазы, как описано выше в разделе Робот 1 и Юпитер в статье 1712 ^1.
2. Зажмите шприц в положении на дозирования руку робота.
3. Используйте палубе установлены лазерный датчик установить X и Y координаты иглу на шприц выдачи. Это является важным шагом, необходимым для того, чтобы мезофазы обойтись точно в центр каждой лунки на тарелку.
4. При нажатии кнопки на панели управления, премьер шприц изгнать мезофазы от иглы. Удалить экструдированный мезофазы от кончика иглы с тканью в рамках подготовки к помощи роботов для загрузки скважин.
5. Перед размещением кристаллизации пластин на палубе робота влажныхан поверхности платформы с несколькими каплями воды, чтобы помочь держать пластину в месте капиллярности.
6. Снимите защитную крышку с прокладкой на стекло опорной плиты и разместить его на своей платформе твердо, чтобы обеспечить хорошее сцепление. Используйте три реперных на платформу, чтобы выровнять 3 Corner скважин обеспечивая тем самым правильное положение скважин на тарелке в отношении выдачи кончике иглы. Прибор теперь приказал ввести цикла дозирования.
7. Цикл начинается со второй этап грунтовки, где мезофазы распределяется на небольшую стеклянную пластинку непосредственно перед переходом к загрузке скважин со свежим мезофазы. Робот первой загрузке с мезофазы вертикальная колонка 8 скважин на тарелку, а затем использует одноразовые наконечники для выдачи осадителя решение на верхней части мезофазы болюса. Процесс повторяется 11 раз по длине плиты, пока все скважины будут заполнены. Весь процесс занимает около 5 минут, чтобы закончить.
8. Удалениезаполненной пластины с платформы робота и запечатать его с крышкой стекла, как описано выше в разделе Робот 1.
9. Поместите пластину, соответствующую маркировку, при температуре контролируемой среды для роста кристаллов.

4. В мезо робота 3. Грифон LCP

Грифон LCP робота (рис. 5) включает в себя аналогичные мезофазы система дозирования, описанной выше для роботов 1 и 2. Что отличает его от двух других является то, что все 96 осадителя решения выдаются одновременно.

1. Подготовка белково-Ладена мезофазы и загрузить его в шприц дозирования, как описано выше, в соответствии роботы 1 и 2, а в Юпитер статье 1712 ^1.
2. Зажмите шприц в положении на дозирования руку робота.
3. Поместите блок осадителя раствора и кристаллизации пластин на палубе робота.
4. Загрузите 96-наконечник HEAD с осадителя решений. Определяемый пользователем время задержки при условии, чтобы облегчить аспирационных вязкая осадителей.
5. Команда инструмент для ввода цикла дозирования. Цикл начинается с мезофазы распыляемой последовательно в 96 лунок в процессе, который занимает около 1 минуты, чтобы закончить. 96-наконечник голове, после чего выдает все 96 осадителя решения сразу на верхнюю часть мезофазы болюсов в кристаллизации скважин. Весь процесс загрузки пластин закончена в 2 мин.
6. Удалите заполненный пластины с платформы робота и запечатать его с крышкой стекла, как описано выше в разделе Робот 1.
7. Поместите пластину, соответствующую маркировку, при температуре контролируемой среды для роста кристаллов.

5. Представитель Результаты

Цель этого видео статьи является показать, как настроить автоматическое испытаний кристаллизации с вязкой, мембранный белок-Ладена мезофазы в стеклянной сэндвич-ч 96-луночные кристаллизации. Основной упор делается на автоматизацию посредством использования специализированных роботов, которые требуют минимального вмешательства человека. Воспроизводимости и точности, с точки зрения объемов мезофазы и осадителя обойтись и размещения как внутри, так хорошо, как ожидается, когда робот используется. Это важно с точки зрения эффективного скрининга условий, которые поддерживают кристаллогенезиса. Они также имеют важное значение для следующего шага в анализе трубопровода, который заключается в оценке роста кристаллов часто делается с оборудованием изображений. Падение или болюс расположение ключа к визуализации процесса, и нерегулярное и неправильное размещение болюса в скважину обычно требует вмешательства пользователя для коррекции и требует времени. Для иллюстрации, примеры правильной и неправильной загрузки пластин показаны на рисунке 6.

Рисунок 1. Схеме приведены этапы производства, сбора и крио-охлаждение в мезо-выращенных кристаллов мембранного белка. Шаги окруженные красной пунктирной линии находятся в центре внимания этой статьи Юпитера. Роботы были использованы для выдачи мезофазы и осадителя решения в шагах 29-32. Из Ссылка 3. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 2. Полностью загружены и опечатаны 96-а стекло сэндвич кристаллизации пластин. Каждая лунка содержит 50 нл кубической фазы и 1 мкл осадка раствор. Для ясности, кубическая фаза была окрашенных Суданом Красное и осадителя решение включает в себя метиленовый синий. Из Ссылка 5.

_upload/4000/4000fig3.jpg "ALT =" Рисунок 3 "/>
Рисунок 3. В мезо-робота (Robot 1). Робот имеет две руки. Группа 1 обходится белково-липидных Ладена мезофазы. Группа 2 распределяет осадителя решений. Во время наполнения 96-луночный планшет остается фиксированной в положении на палубе робота, который сам является стационарным. Две руки двигаться доставить мезофазы и осадителя решений. Из Ссылка 3.

Рисунок 4. Mosquito LCP роботов (Robot 2). В отличие от роботов 1, палуба LCP Mosquito, на которых восседают 96-луночный планшет и осадителя блок решения, движется горизонтально, во время заправки.

Рисунок 5. Грифон LCP роботов (Robot 3). Во времяустановить, липидный кубических ТРК фаза перемещается для доставки белков-Ладена мезофазы на 96-луночный планшет. Палубе затем переводит горизонтали, пластины под осадителя головы чаевые решение. Все 96 осадителя решения выдаются одновременно. Фото получены от производителя ( http://www.artrobbins.com/ ) и маркировку.

Рисунок 6. Полностью загружены и опечатаны 96-а стеклянная плита (A) и колодцы правильно (B) и неправильно (C, D), заполненная использовании в мезо-робота (Robot 1). Этикетка со штрих-кодом на пластине в используется для отслеживания пластины в пластину инкубатор / устройство обработки изображений. В панели BD, осадка раствор и мезофазы отмечены P и M, соответственно. Ожидаемая 'жареное яйцо на сковороде'Появление же в B характерно загружена правильно и запечатаны хорошо. В C, осадителя был обойтись в колодец неправильно в офф-центре позиции и вошел в контакт с прокладкой. В C, казалось бы, тоже, что объем мезофазы меньше, чем она должна быть. Примером неполной загрузке с осадителя решение показано в D. Для масштабе, диаметр всех скважин составляет 6 мм.

Обсуждение

В этом видео статье мы показали, как использовать робота для автоматической настройки в испытаниях мезо кристаллизации в 96-и трехслойных пластин стекла используя белок-липидных Ладена мезофазы. Роботы используются в этой работе были специально разработаны, чтобы включить положительные стеклянный шприц смещения для точного и воспроизводимого доставки nanoliter объемы вязкой и липкой мезофазы, как первоначально описал ^7.

Точность и плавность важных особенностей роботов. Однако, эти характеристики только так хорошо, как степень и регулярность которых робот результаты оцениваются и калибровка. Само собой разумеется, что производительность робота должна быть оценена в то время как отдельные пластины создаются. Это не соответствующих предположить, что робот будет работать безупречно и оставить роботу без присмотра. Внимательны и наблюдательны оператора должна быть в посition отметить, звуком или внешний вид, когда что-то не работает должным образом, и чтобы исправить это немедленно. Кроме того, каждая пластина должна быть тщательно проверены глаза на однородность и содержание, как только пластина запечатаны и до его убрать для кристаллизации испытаний. Это должно всего лишь несколько секунд, чтобы выполнить и может быть сделано в то время как следующая пластинка загружается. Заметив, например, что особенно скважины не правильно заполнены может подчеркнуть тот факт, что определенные осадителя выдачи наконечником неисправной. Если доставка мезофазы видно, чтобы быть нерегулярными, соответствующих неисправных элементов должна быть немедленно исправлена. Отметив эти вопросы и сделать соответствующие корректировки в настройки позволит сэкономить время и материалы, в том числе ценных липидов и мембранных белков. Если тепловизор используется для отслеживания роста кристаллов, достоверность и точность можно также наблюдать во время съемки. Например, систематические проблемы с падением или болюсногоРасположение тепловизор показывает, что что-то не так, и что корректирующие действия где-то выше по течению в протокол не требуется.

В интересах надежной работы поэтому робот должен быть откалиброван на регулярной основе и по мере необходимости. Калибровка должна включать в себя объем осадка и мезофазы доставлен, а также болюса и осадителя размещения в скважине. Очевидно, по мере возможности калибровки должно быть сделано с помощью объемов и материалов, аналогичных тем, которые будут использованы в исследованиях, проведенных в период, охваченный осуществление контроля качества.

Как важно, как калибровка так тоже имея в наличии достаточный запас робота частей и расходных материалов. Катастрофическое и неожиданные сбои, завалов и аварий может и действительно происходят. В таком случае, располагая замены осадителя чаевые доставки, например, может означать, что чрезвычайно ценный препарат мембранного белка используется как следует ине зря.

Некоторые из преимуществ робота включают тот факт, что он будет работать непрерывно и по существу, что он не страдает от или "жалуются на" усталость. Робот также может быть использован в условиях, которые не считают человека с детьми, например, в темноте, под контролем освещения и условиями окружающей среды, и при экстремальных температурах. Роботы продемонстрировали в этой статье, были использованы в условиях окружающей среды при ~ 20 ° C. Однако, есть белки и проектов, которые требуют не-температура окружающей среды, контролируемых света ^11,12 и окислительной или восстановительной среде ^13. Все они могут быть обслужены, с относительной легкостью, при кристаллизации робота используется.

В более раннем Юпитера видео статье мы показали, как кристаллизация испытаний по методу В мезо созданы вручную ^1. Минимальный объем мезофазы, что можно обойтись без надежной рукой ограничено бУ остроты зрения и устойчивым беспристрастности человека создании испытаний. По нашему опыту, объемы мезофазы столь же низко как 100 нл легко обрабатывается. Мы знаем, что одной лаборатории, где по умолчанию количество, выданное вручную составляет около 40 нл. Тем не менее, значительно меньших объемах можно с помощью робота. Отдельно, мы показали, что объемы мезофазы как низко как 550 пиколитра можно обойтись робота ^14. С этой работы стало ясно, что дальнейшая миниатюризация роботом можно, которые, если реализуется, приведет к значительному сокращению количества полноценного белка мембраны, необходимых для осуществления кристаллизации суда.

В этом видео статье, три коммерчески доступные роботы были использованы для демонстрации высокой пропускной способности мембранных белков кристаллизации использованием липидных мезофаз. Первая из них была разработана в MS & FB группы основаны на нашем опыте создания испытания вручную, как описано в Юпитеру 1712 ^1. Это инструментния у нас есть самое знакомство с и большую часть текущего статья посвящена его использования. Два других роботов были на демонстрации в MS & FB группы в то время, статья была написана и соответствующие кадры включены в интересах полноты. Все три роботы используют почти так же мезофазы выдачи системы, существенной особенностью которой является положительным стеклянный шприц смещением ^5,7. Они отличаются наиболее значительно в связи с осадителя доставки. Роботы 1 и 2 может обойтись осадителя одновременно в 8 скважин, одна колонка кристаллизации пластин одновременно. В отличие от Robot 3 распределяет все 96 осадителя решения в одном действии. Робот 2 является единственным инструментом, с одноразовыми осадителя выдачи советов. Есть плюсы и минусы, связанные с различными инструментами, которые зависят от конкретного применения, они не будут разработаны здесь. Достаточно сказать, что все три работы и дали кристаллы меняmbrane белков в методе мезо.

Следующим шагом в общем процессе определения структуры по кристаллографии макромолекул являются сбор и крио-прохладный кристаллов из пластин создан как описано в этой статье и видео для записи и обработки рентгеновской дифракции от них. Эти темы рассматриваются в отдельном Юпитер статьи этой серии ^1,15.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Компоненты
Брейер (ролик)	Fisher Scientific	50820937	Инструмент
Газонепроницаемый шприцы	Гамильтон	81030	Инструмент
Стекло покровные	Marienfeld	01029990911	Одноразовый
Стеклянные пластины	Marienfeld	1527127092	Одноразовый
Грифон LCP робот	Искусство Robbins	Не Доступно	Инструмент
В мезо-робота	Anachem / Gilson	Не Доступно	Инструмент
Лаборатория ноутбуков	Различный	Не Доступно	Инструмент
Mosquito LCP робот	TTP Labtech	Не Доступно	Инструмент
Перфорированные двойной палки Spacer ленты	Saunders Corporation (отверстий перфорированной)	настроить	Одноразовый
Осадителя решения	Различный	Различный	Реагент
Дистиллированная вода	Millipore	Не Доступно	Реагент
Дождь-X	Shell Car Care	80199200	Реагент
Шприц советы	Гамильтон	7770-020 (манометрическое 22)	Инструмент
Ткани	Различный	Различный	Одноразовый
Фляга	различный	Не Доступно	Реагент