Сборки геномов, основанные на технологиях массивно-параллельного секвенирования ДНК, обычно сильно фрагментированы. Разработка физических карт хромосом может потенциально улучшить сборки геномов. В данной работе мы демонстрируем инновационные подходы к подготовке хромосом, флуоресцентной гибридизации in situ и визуализации, которые значительно увеличивают пропускную способность процесса создания физических карт.
Методическая статья
Высокая пропускная способность физического картирования хромосом использованием автоматизированных
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ожидается, что в ближайшие 5 лет будут реализованы проекты по получению полногеномных последовательностей для 10 000 видов позвоночных1, а также для 5 000 видов насекомых и родственных им членистоногих2. Например, в настоящее время на платформе Illumina проводится секвенирование геномов 15 видов малярийных комаров3,4. Данный кластер видов Anopheles включает как переносчиков малярии, так и виды, не являющиеся переносчиками. После того как сборки геномов станут доступны, исследователи получат уникальную возможность провести сравнительный анализ для выявления эволюционных изменений, связанных со способностью к передаче инфекции. Однако использование ридов секвенирования следующего поколения для создания высококачественных сборок генома de novo оказалось затруднительным5. Более того, существующие сборки генома Anopheles gambiae, несмотря на то что они были получены методом Сэнгера, содержат пропуски или фрагментированы4,6.
Эффективность сравнительного геномного анализа будет ограничена, если исследователи будут работать с многочисленными контигами секвенирования, а не со сборками геномов на основе хромосом. Фрагментированные, некартированные последовательности создают проблемы для геномного анализа, поскольку: (i) неидентифицированные пробелы приводят к некорректной или неполной аннотации геномных последовательностей; (ii) некартированные последовательности вызывают путаницу между паралогичными генами и генами из разных гаплотипов; и (iii) отсутствие привязки к хромосомам и ориентации контигов секвенирования не позволяет реконструировать филогению перестроек и изучать эволюцию хромосом. Разработка физических карт высокого разрешения для видов с недавно секвенированными геномами является своевременной и экономически эффективной инвестицией, которая облегчит аннотацию генома, эволюционный анализ и повторное секвенирование отдельных геномов из природных популяций7,8.
В данной работе мы представляем инновационные подходы к подготовке хромосом, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и визуализации, которые способствуют быстрому созданию физических карт. На примере An. gambiae мы демонстрируем, что построение физических карт хромосом может потенциально улучшить сборки генома и, следовательно, повысить качество геномного анализа. Во-первых, мы используем метод высокого давления для подготовки препаратов политенных хромосом. Этот метод, первоначально разработанный для Drosophila9, позволяет визуализировать больше деталей структуры хромосом, чем стандартный метод раздавливания10. Во-вторых, для высокопроизводительного физического картирования генома используется полностью автоматизированная система подготовки к FISH. Эта автоматическая система окрашивания предметных стекол позволяет проводить несколько анализов одновременно и значительно сокращает время непосредственной работы оператора11. В-третьих, автоматическая система флуоресцентной визуализации, оснащенная моторизованным предметным столиком, автоматически сканирует и фотографирует меченные хромосомы после проведения FISH12. Данная система особенно полезна для идентификации и визуализации нескольких хромосомных препаратов на одном предметном стекле. Кроме того, процесс сканирования обеспечивает получение более однородных результатов FISH. В целом, автоматизированный протокол высокопроизводительного физического картирования является более эффективным, чем стандартный ручной протокол.
Протокол
1. Приготовление политенных хромосом из трофоцитов яичников методом высокого давления
- Проведите диссекцию полугравидных самок Anopheles через 25 часов после кровососания под диссекционным микроскопом и зафиксируйте яичники в свежем модифицированном растворе Карноя с метанолом (100% метанол : ледяная уксусная кислота, 3:1). На этом этапе яичники находятся на III стадии развития по Кристоферу, когда фолликулы имеют овальную форму, а прозрачная область с трофоцитами внутри фолликулов имеет круглую форму13. Поместите яичники примерно пяти самок в 500 μl модифицированного раствора Карноя в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл и выдержите их при комнатной температуре в течение 24 часов. Перенесите яичники при температуре -20 °C для длительного хранения.
- Непосредственно перед приготовлением препаратов prepare модифицированный раствор Карноя с этанолом (100% этанол : ледяная уксусная кислота, 3:1) и 50% пропионовую кислоту. Поместите одну пару яичников на безпылевое предметное стекло в одну каплю модифицированного раствора Карноя. Разделите яичники примерно на 6 секций с помощью диссекционных игл и перенесите их в капли 50% пропионовой кислоты на чистые предметные стекла под стереомикроскопом Leica MZ6. Используйте отдельное стекло для каждой секции.
- Отделите фолликулы с помощью игл и удалите остатки тканей фильтровальной бумагой или бумажным полотенцем под диссекционным микроскопом. Добавьте к фолликулам новую каплю 50% пропионовой кислоты и оставьте их на 3-5 минут при комнатной температуре. Накройте каплю 50% пропионовой кислоты покровным стеклом. Выдержите препарат примерно 1 минуту.
- Оберните предметное стекло фильтровальной бумагой и пластиком. Используя роторный инструмент Dremel 200 с гибким валом и мягким пластиковым наконечником при скорости 3000-5000 RPM, раздавите фолликулы, совершая наконечником круговые движения и слегка нажимая на покровное стекло для равномерного распределения ядер. Этот этап должен занять примерно 1 минуту. Проверьте качество распределения ядер с помощью фазово-контрастного микроскопа Olympus CX41 с объективом 20x.
- Сформируйте «сэндвич», поместив дополнительное покровное стекло рядом с тем, что закрывает хромосомы, и накрыв их вторым предметным стеклом. Это снижает вероятность раздавливания стекла в тисках. Оберните стекла пластиковой пленкой (из контейнеров для предметных стекол) и фильтровальной бумагой, чтобы зафиксировать «сэндвич» и защитить стекло от царапин при сжатии в тисках.
- Окажите давление на стекла с помощью механических тисков. Достаточного является давление 85-120 inch-lbs, которого можно добиться с помощью динамометрического ключа. Этот этап необходим для максимального распластывания хромосом.
- Удалите второе предметное стекло и дополнительное покровное стекло. Нагрейте стекло с покровным стеклом, закрывающим хромосомы, до 55 °C в системе для денатурации/гибридизации в течение 10-15 минут для дальнейшего распластывания хромосом. Погрузите стекло в жидкий азот минимум на 15 секунд и, когда пузырьки перестанут выделяться, быстро снимите покровное стекло лезвием бритвы. Немедленно поместите стекла в холодный 50% этанол на 5 минут. Дегидрируйте стекла в 70%, 90% и 100% этаноле по 5 минут в каждом. Высушите стекла на воздухе.
2. FISH с использованием автоматизированной системы окрашивания предметных стекол
Программа в автоматизированной системе окрашивания предметных стекол Xmatrx настроена на выполнение следующих этапов, за исключением маркировки зонда. Подробный протокол маркировки методом ник-трансляции описан в документации, прилагаемой к ДНК-полимеразе от Fermentas.
- Перед проведением FISH подготовьте флуоресцентные зонды, пометив геномную ДНК BAC флуорохромом с помощью протокола ник-трансляции. Смешайте 1 μg ДНК, по 0,05 mM немеченых dATP, dCTP и dGTP, 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- или Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml BSA, 5 μl 10x буфера для ник-трансляции, 20 единиц ДНК-полимеразы I, 0,0012 единиц DNase I и доведите объем до 25 μl водой, свободной от нуклеаз. Соотношение ДНК-полимеразы I/DNase I подбирается эмпирически для получения зондов с диапазоном размеров от 300 до 500 bp. Инкубируйте смесь при 15 °C в течение 1 часа.
- Поместите предметные стекла и реагенты в автоматизированную систему окрашивания стекол Xmatrx и запустите программу для выполнения следующих этапов. Нанесите 800 μl 1x PBS на 20 мин. Обдуйте стекла воздухом. Выполните фиксацию формалином, нанеся 450 μl 4% формалина в 1x PBS на 1 мин с последующей промывкой 100% этанолом дважды по 1 сек и один раз в течение 2 мин. Обдуйте стекла воздухом.
- Нагрейте стекла при 45 °C в течение 2 мин, чтобы избежать образования пузырьков при нанесении зондов. Нанесите 20 μl ДНК-зондов, добавьте капли минерального масла для предотвращения испарения гибридизационного раствора и накройте покровным стеклом. Денатурируйте хромосомы и ДНК-зонды, нагревая стекла при 90 °C в течение 10 мин.
- Для гибридизации инкубируйте стекла при 42 °C в течение 14 часов под покровными стеклами. Гибридизационный раствор состоит из 2x SSC, 100 mM фосфата натрия, 1x раствора Денхардта, 100 μg/ml азида натрия и 10% декстрансульфата в формамиде.
- Для промывок при строгих условиях нагрейте стекла при 42 °C в течение 2 мин, снимите покровные стекла и промойте стекла в 2x SSC по 1 сек 4 раза. Обдуйте стекла воздухом. Нанесите 800 μl 0,4x SSC при 42 °C на 10 мин 2 раза. Промойте стекла в 2x SSC при 25 °C в течение 10 мин.
- Выполните окрашивание хромосом, нанеся 50 μl 1 μM YOYO-1 в 1x PBS. Добавьте капли минерального масла для предотвращения испарения раствора для окрашивания, накройте покровными стеклами и инкубируйте при 25 °C в течение 10 мин. Снимите покровные стекла, промойте стекла в 2x SSC по 1 сек 4 раза. Обдуйте стекла воздухом. Нанесите 15 μl антифейдингового реагента ProLong Gold. Накройте покровными стеклами.
3. Считывание препаратов с помощью автоматической системы флуоресцентной визуализации
В данном разделе подробно описывается использование программного обеспечения Duet, которое входит в стандартную комплектацию автоматизированной сканирующей системы ACCORD PLUS. Инструкции начинаются с включения устройств в следующем порядке: блока питания Olympus U-RFL-T для галогенной лампы, компьютера Dell precision T3500, микроскопа Olympus BX61 с подключенной камерой Olympus U-CMAD3.
- Для настройки предварительного сканирования 10x откройте программное обеспечение Duet в автоматизированной системе сканирования ACCORD PLUS. Нажмите кнопку «Online». Введите новый Case ID и назначьте Slide ID. Нажмите на точку с пометкой «BF» — это вариант сканирования в светлом поле. В поле выбора сканирования установите «10x Prescan». Выберите «2500x circle», «10000x circle» или «rectangle». Нажмите «Set&run» для запуска предварительного сканирования 10x.
- Нажмите кнопку «OK» для выполнения предварительного сканирования 10x. Следуйте подсказкам для правильной настройки сканирования. Нажмите «Finish», чтобы начать сканирование. Перейдите на вкладку «Main», чтобы вернуться на главный экран. Нажмите кнопку «Offline». Найдите назначенные Case ID и Slide ID и нажмите «Offline Scan». В черном окне в левом верхнем углу нажмите на стрелку и выберите «10x Prescan». Используя стрелки (< || Δ >, т. е. кнопки «назад», «пауза», «воспроизведение», «вперед»), просмотрите отсканированные изображения.
- После нахождения интересующего изображения дважды щелкните по центру целевой области на экране и нажмите «Snap». Это пометит изображение для последующего захвата. После выбора всех целей нажмите «Classify». Выберите «10x Prescan». Щелкните правой кнопкой мыши по изображению, чтобы классифицировать его. Выберите «Polytene».
- Настройте предварительное сканирование 40x в программном обеспечении Duet. Нажмите «Main», чтобы вернуться в главное меню. Снова выберите «Online». Выберите препарат. Измените «BF» на «FL». Измените название задачи на «Revisit-X40-RG». В разделе сразу под последней настройкой выберите «Revisit-ALL». Нажмите «Set&Run». Нажмите «OK». Снова следуйте подсказкам для настройки автоматизации. Нажмите кнопку «Start matching views» для сопоставления изображений 10x и 40x. Нажмите «Finish», чтобы начать сканирование. По завершении нажмите «Classify» и просмотрите изображения.
4. Репрезентативные результаты
Рисунок 1 графически представляет схему подготовки хромосом под высоким давлением. Этот этап включает процесс раздавливания и распластывания хромосом с помощью инструмента Dremel и механического тисков, а также визуализацию хромосом с использованием фазово-контрастного микроскопа. Рисунок 2 иллюстрирует гибридизацию флуоресцентно меченого зонда с целевой ДНК в препаратах хромосом на предметных стеклах с использованием автоматизированной системы окрашивания стекол, применение автоматического сканирующего микроскопа для визуализации и картирования зондов после эксперимента FISH, а также размещение и ориентацию геномных скаффолдов на хромосомах.
Препараты политенных хромосом трофоцитов яичников самок An. gambiae были изготовлены с использованием метода высокого давления. Этот метод не повреждает и не изменяет большую часть структуры хромосом (Рисунок 3). Он расправляет изогнутые хромосомы и, таким образом, выявляет скрытые тонкие полосы, которые не видны на обычных препаратах (Рисунок 4).
Зонды, используемые в данном протоколе, представляют собой геномные BAC-клоны ДНК, полученные из библиотеки BAC ND-TAM, созданной на основе ДНК штамма PEST An. gambiae. Геномная ДНК для этой библиотеки была экстрагирована из только что вылупившихся личинок первого возраста обоих полов. На рисунке 5 представлены результаты FISH с использованием BAC-клонов, гибридизованных с политенными хромосомами An. gambiae. Эта процедура была выполнена с помощью автоматизированной системы окрашивания предметных стекол Xmatrx. С использованием цитогенетической фотокарты An. gambiae10 два BAC-клона, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) и BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), были локализованы в подрайонах 16C и 16D плеча 2R соответственно. Однако поиск BLAST по сборке AgamP3 штамма PEST An. gambiae14 выявил последовательности, гомологичные 102B24 и 142O19, в подрайонах 16B и 17A плеча 2R соответственно (Таблица 1). Таким образом, соответствие между геномными координатами и цитогенетическими подрайонами теперь может быть скорректировано согласно нашим данным картирования. Поиск BLAST по сборкам геномов M-формы и S-формы An. gambiae показал, что два BAC-клона расположены в разных контигах, но в одних и тех же скаффолдах внутри каждой формы (Таблица 1). Теперь идентифицированные контиги могут быть соотнесены с конкретными хромосомными локусами. Более того, идентифицированные скаффолды теперь могут быть правильно ориентированы внутри цитологических подрайонов 16CD. Интересно, что расстояния между последовательностями 102B24 и 142O19 в скаффолдах составляют 1,892,981 bp, 1,658,391 bp и 1,688,426 bp в сборках геномов штамма PEST, M-формы и S-формы соответственно. Поскольку штамм PEST является гибридом M- и S-форм, эта разница, вероятно, обусловлена некорректной сборкой генома PEST.
| БАК (бактериальная искусственная хромосома) (номер доступа) | штамм PEST AgamP3 Координаты | М-форма контиги Координаты | М-форма скаффолды Координаты | S-форма контиги Координаты | S-форма скаффолды Координаты |
| 102B24 (BH372694) | 2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43,681,342- 43,681,874 | ABKP020247 53.1 32,513- 33,045 | EQ090167.1 1,858,377- 1,858,909 | ABKQ010123 32.1 4,299- 4,832 | EQ099711.1 215,891- 216,424 |
| 102B24 (BH372701) | 2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43,788,213- 43,788,969 | ABKP020247 51.1 24,816- 25,575 | EQ090167.1, 1,772,683- 1,773,442 | ABKQ010123 35.1 27,782- 28,540 | EQ099711.1, 305,514- 306,272 |
| 142O19 (BH368698) | 2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45,428,580- 45,429,264 | ABKP020247 01.1 2,499- 3,185 | EQ090167.1 315,806- 316,492 | ABKQ010123 76.1 49,242- 49,942 | EQ099711.1 1,791,625- 1,792,325 |
| 142O19 (BH368703) | 2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45,560,099- 45,574,323 | ABKP020220 17.1 30,971- 32,469 | EQ090167.1 200,518- 202,016 | ABKQ010123 79.1 27,760- 28,508 | EQ099711.1 1,903,569- 1,904,317 |
Таблица 1. Результаты BLAST-анализа последовательностей концов BAC по сборкам генома An. gambiae.
Рисунок 1. Схематическое изображение метода подготовки хромосом под высоким давлением. Показаны яичники комара на соответствующей стадии развития.
Рисунок 2. Схема автоматизированного FISH-анализа, сканирования предметных стекол и картирования геномных скаффолдов на хромосомах.
Рисунок 3. Препарат политенной хромосомы 3 An. gambiae, полученный с помощью метода высокого давления. 3L и 3R обозначают левое и правое плечи на уровне их теломер. PH и IH указывают на перицентрический и интеркалярный гетерохроматин соответственно.
Рисунок 4. Сравнение политенных хромосом An. gambiae, приготовленных с использованием традиционного (сверху) и метода высокого давления (снизу). На изображениях представлены подразделы 29A-30E плеча 3R (A) и 43D-46D плеча 3L (B).
Рисунок 5. FISH-анализ BAC-клонов на политенных хромосомах An. gambiae. A) Гибридизация 102B24 (красный сигнал) с плечом 2R. B) Двухцветная FISH-гибридизация 102B24 (красный сигнал) и 142O19 (синий сигнал) с подразделениями 16C и 16D растянутого плеча 2R соответственно. Стрелками указаны сигналы гибридизации BAC-клонов, меченных Cy3 (красный) и Cy5 (синий). C — центромерная область. a/+ обозначает гетерозиготу по инверсии 2La. Хромосомы были подвергнуты контрастированию флуорофором YOYO-1.
Обсуждение
Наиболее критическим этапом процедуры высокого давления является правильное раздавливание трофоцитов яичников, выделенных на III стадии развития по Кристоферсу13. Неправильное раздавливание может привести к недостаточному распластыванию хромосом, что затрудняет определение локализации зондов после FISH. При чрезмерном раздавливании хромосомы могут разорваться или вытянуться до такой степени, что паттерны полос станут неразличимы. Изготовление большого количества препаратов позволяет добиться единообразия при раздавливании предметных стекол с помощью инструмента Dremel, что повышает общую эффективность подготовки образцов. Метод высокого давления был впервые разработан для свежевыделенных слюнных желез D. melanogaster9. Однако яичники комаров обычно фиксируют в модифицированном растворе Карноя (3 части метанола : 1 часть ледяной уксусной кислоты по объему) перед приготовлением хромосомных препаратов. Поэтому мы модифицировали существующий протокол высокого давления, чтобы адаптировать его для политенных хромосом фиксированных трофоцитов яичников малярийного комара An. gambiae. Поскольку высокое давление прикладывается с помощью прецизионных тисков, имеющих строго параллельную рабочую поверхность по всей площади предметного стекла, подготовка раздавливания хромосом занимает значительно меньше времени, чем при использовании традиционного метода постукивания ластиком карандаша.
Другие важные этапы включают достаточноее замачивание фолликулов в 50% пропионовой кислоте и нагревание предметного стекла. Оба этих этапа необходимы для того, чтобы помочь распластать хромосомы. Если пренебречь ими, хромосомы после дегидратации могут выглядеть глянцевыми, что потенциально приводит к избыточному фону, который можно ошибочно принять за сигнал при FISH. Метод раздавливания под высоким давлением также хорошо работает с использованием тех же растворов при подготовке препаратов митотических хромосом. Дополнительное распластывание и выравнивание помогают лучше высвободить хромосомы из их ядер. Равномерное давление должно соответствующим образом распластать их, что позволит проводить измерения и, возможно, обеспечит лучшее разрешение полос, видимых при окрашивании. Подробности о выделении митотических хромосом из комаров приведены в другом источнике15. Хотя обычных препаратов, полученных методом раздавливания, достаточно для многих целей, включая FISH 16 и иммуноокрашивание17, метод высокого давления не только снижает потенциальную вариабельность между стеклами, но и повышает общее качество хромосом, что обеспечивает более высокую детализацию при картировании хромосом. Эту процедуру также можно использовать для подготовки мембранных стекол с политенными хромосомами для лазерной микродиссекции.
Ограничения метода высокого давления включают повреждение предметного стекла и чрезмерное растяжение хромосом. Возможно повреждение стекла из-за слишком сильного сжатия в тисках, однако использование значений давления, указанных в статье, сводит этот риск к минимуму. Что касается чрезмерного растяжения хромосом, при слишком длительном воздействии инструмента Dremel на стекло существует вероятность того, что хромосомы растянутся слишком сильно, что приведет к потере разрешения. Это можно предотвратить, воздействуя инструментом в течение короткого промежутка времени, проверяя результат под микроскопом и при необходимости увеличивая время обработки инструментом Dremel, если хромосомы недостаточно разнесены.
Традиционный протокол FISH включает ряд стадий промывки и инкубации, которые обычно длятся от 5 до 20 min и требуют почти постоянного внимания исследователя на протяжении всего эксперимента. Более того, количество предметных стекол, которые можно обрабатывать вручную, обычно ограничено несколькими образцами в рамках одного эксперимента. В отличие от этого, автоматизированная система окрашивания стекол выполняет все этапы (включая промывку, инкубацию, нанесение зонда, денатурацию, гибридизацию, наложение и снятие покровного стекла) автоматически. Это освобождает исследователю до 6-8 рабочих часов при проведении эксперимента FISH. Кроме того, автоматизированная система FISH может значительно повысить производительность. Например, система Xmatrx способна одновременно обрабатывать до 40 анализов на стеклах с одной препарацией и до 80 анализов на стеклах с двойной препарацией. Среди ограничений этой системы заключается то, что она неэффективна для небольшого количества экспериментов FISH, так как требует приготовления больших объемов растворов. Кроме того, протокол FISH, запрограммированный в системе, может потребовать модификаций и корректировок для новых областей применения.
Система сканирования препаратов представляет собой автоматизированную версию флуоресцентного микроскопа. Автоматизированное перемещение предметного столика и простая панель управления микроскопом освобождают время исследователя и предельно упрощают эксплуатацию прибора. Например, программное обеспечение системы сканирования ACCORD PLUS позволяет легко регистрировать несколько каналов флуоресценции и удобно управлять процессом получения изображений. Примером может служить функция захвата z-стека вместо получения одного снимка; программное обеспечение делает серию изображений по настраиваемому z-стеку, чтобы гарантировать, что хотя бы один снимок останется в фокусе. Хотя данная система больше предназначена для массового получения изображений (большого количества клеток на одном предметном стекле), она всё равно значительно облегчает поиск хромосом на стекле по сравнению с ручным перемещением по препарату.
Как автоматизированная система окрашивания предметных стекол, так и сканирующая система регулярно используются цитогенетическими клиниками для FISH-диагностики хромосомных аномалий в клетках человека. В данном исследовании мы разработали протокол, использующий эти автоматизированные системы для фундаментальных научных исследований. Автоматизированный протокол высокопроизводительного физического картирования может способствовать быстрому созданию физических карт хромосом для любого интересующего вида. Хотя в настоящем отчете для физического картирования использовались политенные хромосомы, с помощью этих систем можно использовать и митотические хромосомы. Было бы полезно адаптировать протокол для митотических хромосом, так как у большинства организмов не развиваются читаемые политенные хромосомы. Однако политенные хромосомы, при их наличии, могут предоставить ценную информацию о соответствии функциональных доменов генома структуре хромосомы с наивысшим разрешением. Принципы организации политенных хромосом, такие как паттерны полос и интерполос, недавно были приравнены к принципам организации обычных неполитенных (интерфазных) хромосом18. Таким образом, детальное физическое картирование, проведенное на препаратах хромосом высокого давления, обладает потенциалом для связывания последовательностей ДНК с конкретными хромосомными структурами, такими как полосы, интерполосы, паффы, центромеры, теломеры и гетерохроматин, что позволяет создавать сборки генома на основе хромосом.
Раскрытие информации
Конфликт интересов не заявлен.
Благодарности
Данная работа была поддержана грантом Национальных институтов здоровья 1R21AI094289, предоставленным Игорю В. Шарахову. Система автоматического окрашивания предметных стекол Xmatrx и система автоматического сканирования ACCORD PLUS были приобретены при поддержке программы Equipment Trust Fund Института наук о жизни Фралина, кафедры энтомологии и кафедры биохимии Виргинского политехнического института (Virginia Tech).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Стекла покровные для микроскопа 22x22 mm | Fisher | 12-544-10 | |
| Стекла покровные для микроскопа 18x18 mm | Fisher | 12-553-402 | |
| Уксусная кислота | Fisher | A491-212 | |
| Метанол | Fisher | A412-4 | |
| Пропионовая кислота | Sigma-Aldrich | 402907 | |
| Роторный инструмент Dremel 200 с гибким валом | Rand | 3" многоцелевой мини-настольный шлифовальный станок (с ограничителем скорости) | |
| Специально разработанные пластиковые наконечники объемом 200 μl (с бисерированными краями) для инструмента Dremel | Pipetman | F171300 | Обрезать и нагреть широкий конец наконечников для пипеток |
| Быстрозажимной тис со свинцовым покрытием | Avenger Gold Toolmaker | MTC-200-1 | Прецизионная шлифовка квадрата и параллельности с точностью до 0.00025 |
| Динамометрический ключ | Craftsman | 44593 | |
| Система денатурации/гибридизации предметных стекол ThermoBrite | Abbott Molecular | 30-144110 | |
| Барьерные предметные стекла 25 mm | Abbott Molecular | XT108-SL | |
| Покровные стекла 25 mm | Abbott Molecular | XT122-90X | |
| Автоматизированная система окрашивания предметных стекол Xmatrx | Abbott Molecular | 08L46-001 | |
| Стереомикроскоп Leica MZ6 | Leica | VA-OM-E194-354 | Можно использовать другой стереомикроскоп |
| Фазовый микроскоп Olympus CX41 | Olympus | CX41RF-5 | Можно использовать другой фазовый микроскоп |
| Автоматизированная система сканирования ACCORD PLUS | BioView (USA) | BV-5000-ACCP | |
| 10x PBS | Invitrogen | P5493 | |
| 10% NBF (нейтрально буферизованный формалин) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 99% формамид | Fisher Scientific | BP227500 | |
| Декстрансульфат натрия | Sigma | D8906 | |
| 20x SSC буфер | Invitrogen | AM9765 | |
| Фосфат натрия | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| 50x раствор Денхардта | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| Азид натрия | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 1 mM раствор йодида YOYO-1 (491/509) в DMSO | Invitrogen | Y3601 | |
| Средство для предотвращения выцветания ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Fermentas | R0141, R0151, R0161, R0171 | |
| Cy3-dUTP, Cy5-dUTP | GE Healthcare | PA53022, PA55022 | |
| BSA | Sigma | A3294 | |
| ДНК-полимераза I | Fermentas | EP0041 | |
| ДНКаза I | Fermentas | EN0521 |
Ссылки
- Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species. J. Hered. 100, 659-674 (2009).
- Robinson, G. E., et al. Creating a Buzz About Insect Genomes. Science. 331, 1386-1386 (2011).
- Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from: http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/ (2012).
- Besansky, N. Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites. White Paper. , 1-15 (2008).
- Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. Limitations of next-generation genome sequence assembly. Nature. 8, 61-65 (2011).
- Sharakhova, M. V., et al. Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly. Genome Biol. 8, R5(2007).
- Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. Every genome sequence needs a good map. Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).
- Bhutkar, A., et al. Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes. Genetics. 179, 1657-1680 (2008).
- Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nature. 4, 483-485 (2007).
- George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).
- FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from: http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html (2012).
- The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from: http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332 (2012).
- Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction. , Chapman & Hall. (1992).
- BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from: http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/ (2012).
- Sharakhova, M. V., et al. Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).
- Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis. J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).
- Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling. J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).
- Vatolina, T. Y., et al. Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 6, (2011).
Перепечатки и разрешения
