Высокая пропускная способность физического картирования хромосом использованием автоматизированных На месте Гибридизация

Краткое содержание

Сборки генома, основанные на технологиях массового параллельного секвенирования ДНК, обычно сильно фрагментированы. Разработка физических хромосомных карт потенциально может улучшить сборку генома. В этой статье мы демонстрируем инновационные подходы к подготовке хромосом, флуоресцентной гибридизации in situ и визуализации, которые значительно увеличивают производительность разработки физической карты.

Аннотация

Ожидается, что в течение следующих 5 лет будут реализованы проекты по получению полногеномных последовательностей для 10 000 видов позвоночных¹ и для 5 000 насекомых и родственных видов членистоногих2. Например, секвенирование геномов 15 видов малярийных комаров в настоящее время проводится с помощью платформы Illumina^3,4. Этот видовой кластер Anopheles включает как переносчиков, так и непереносчиков малярии. Когда сборки генома станут доступны, у исследователей появится уникальная возможность провести сравнительный анализ для вывода об эволюционных изменениях, имеющих отношение к способностям переносчиков. Тем не менее, оказалось трудно использовать чтения секвенирования нового поколения для создания высококачественных сборок генома de novo ⁵. Более того, существующие сборки генома Anopheles gambiae, хотя и получены с использованием метода Сэнгера, представляют собой разрывы или фрагменты^4,6.

Успех сравнительного геномного анализа будет ограничен, если исследователи будут иметь дело с многочисленными контигами секвенирования, а не с сборками генома на основе хромосом. Фрагментированные, некартированные последовательности создают проблемы для геномного анализа, поскольку: (i) невыявленные пробелы приводят к неправильной или неполной аннотации геномных последовательностей; (ii) некартированные последовательности приводят к путанице между паралогичными генами и генами различных гаплотипов; и (iii) отсутствие распределения хромосом и ориентации контигов секвенирования не позволяет реконструировать филогению перестройки и изучить эволюцию хромосом. Разработка физических карт с высоким разрешением для видов с недавно секвенированными геномами является своевременным и экономически эффективным вложением, которое облегчит аннотирование генома, эволюционный анализ и повторное секвенирование отдельных геномов из природных популяций^7,8.

Здесь мы представляем инновационные подходы к подготовке хромосом, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и визуализации, которые способствуют быстрой разработке физических карт. Используя An. gambiae в качестве примера, мы демонстрируем, что разработка физических хромосомных карт потенциально может улучшить сборки генома и, следовательно, качество геномного анализа. Во-первых, мы используем метод высокого давления для получения разбросов политенных хромосом. Этот метод, первоначально разработанный для Drosophila⁹, позволяет пользователю визуализировать больше деталей на хромосомах, чем обычная техника сжатия¹⁰. Во-вторых, полностью автоматизированная система для FISH используется для высокопроизводительного физического картирования генома. Автоматизированная система окрашивания предметным стеклом выполняет несколько анализов одновременно и значительно сокращает время ручной работы¹¹. В-третьих, автоматическая система флуоресцентной визуализации, которая включает в себя моторизованный предметный столик, автоматически сканирует и фотографирует помеченные хромосомы после FISH¹². Эта система особенно полезна для идентификации и визуализации нескольких хромосомных пластин на одном предметном стекле. Кроме того, в процессе сканирования фиксируется более однородный результат FISH. В целом, автоматизированный протокол физического сопоставления с высокой пропускной способностью более эффективен, чем стандартный ручной протокол.

Протокол

1. Получение политеновой хромосомы высокого давления из клеток-кормилиц яичников

1. Препарировать полугравидных самок Anopheles через 25 часов после кормления кровью под микроскопом и зафиксировать яичники в свежем модифицированном растворе Карноя с метанолом (100% метанол: ледяная уксусная кислота, 3:1). На этой стадии яичники находятся на III стадии развития по Кристоферсу, когда фолликулы имеют овальную форму, а прозрачная область с клетками-медсестрами внутри фолликулов имеет круглую форму¹³. Поместите яичники примерно пяти самок в 500 μл модифицированного раствора Карноя в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл и держите их при комнатной температуре в течение 24 часов. Перенесите яичники до -20 °C для длительного хранения.
2. Приготовьте модифицированный раствор Карноя с этанолом (100% этанол: ледяная уксусная кислота, 3:1) и 50% пропионовой кислотой непосредственно перед изготовлением предметных стекол. Поместите одну пару завязей на непыльное предметное стекло в одну каплю модифицированного раствора Карноя. Разделите яичники примерно на 6 срезов с помощью препарирующих игл и поместите их в капли 50% пропионовой кислоты на чистые предметные стекла под стереомикроскопом MZ6 Leica. Используйте отдельный слайд для каждого раздела.
3. Отделите фолликулы, рассекая с помощью игл, и протрите остатки тканей фильтровальной бумагой или бумажным полотенцем под микроскопом для вскрытия. Добавьте новую каплю 50% пропионовой кислоты в фолликулы и дайте им постоять 3-5 минут при комнатной температуре. Поместите защитный лист поверх капли 50% пропионовой кислоты. Дайте слайду постоять примерно 1 минуту.
4. Оберните предметное стекло фильтровальной бумагой и полиэтиленом. С помощью вращающегося инструмента Dremel 200 с насадкой Flex-Shaft и мягким пластиковым наконечником с частотой вращения 3000–5000 об/мин сцеживайте фолликулы, вращая кончик по кругу и слегка нажимая на покровное стекло, чтобы равномерно распределить ядра. Этот шаг должен занять примерно 1 минуту. Проверьте качество распространения с помощью фазового микроскопа Olympus CX41 с 20-кратным объективом.
5. Приготовьте бутерброд, положив рядом с покровным стеклом дополнительный покровный листок, закрывающий хромосомы, и накройте их вторым предметным стеклом микроскопа. Это снижает вероятность раздавливания ползуна в тисках. Оберните слайды пластиковым листом, который поставляется в стеклянных контейнерах для слайдов и фильтровальной бумаге, чтобы удерживать бутерброд и защитить слайд от царапин из-за тисков.
6. Надавите на направляющие с помощью механических тисков. Давление в 85-120 дюймов-фунтов является достаточным и достигается за счет использования динамометрического ключа. Этот этап необходим для того, чтобы хромосомы были максимально сплющены.
7. Снимите второе предметное стекло микроскопа и дополнительное покровное стекло. Нагрейте предметное стекло с покровным стеклом, охватывающим хромосомы, до 55 °C на системе денатурации/гибридизации предметного стекла в течение 10-15 минут для дальнейшего сглаживания хромосом. Опустите предметное стекло в жидкий азот не менее чем на 15 секунд, а когда пузыри прекратятся, приступайте к быстрому снятию покровного стекла лезвием бритвы. Немедленно поместите предметные стекла в холодный 50% этанол на 5 минут. Обезвоживайте в 70%, 90%, 100% этаноле на 5 минут каждый. Сухие горки на воздухе.

2. FISH с использованием автоматизированной системы окрашивания предметного стекла

Программа настроена с помощью автоматизированной системы окрашивания предметных стекол Xmatrx для выполнения следующих шагов, кроме маркировки щупа. Подробный протокол маркировки nick-translation описан в документации, прилагаемой к ДНК-полимеразе от Fermentas.

1. Перед проведением FISH подготовьте флуоресцентные зонды путем мечения геномной ДНК BAC флуорохромом с использованием протокола ник-трансляции. Смешайте 1 мкг ДНК, по 0,05 мМ немеченых dATP, dCTP и dGTP и 0,015 мМ dTTP, 1 мкл Cy3- или Cy5-dUTP, 0,05 мг/мл BSA, 5 мкл 10-кратного буфера для ник-трансляции, 20 единиц ДНК-полимеразы I, 0,0012 единиц ДНКазы I и воды, не содержащей нуклеаз, до 25 μл. Соотношение ДНК-полимераза I/ДНКаза I подобрано опытным путем для получения зондов с диапазоном размеров от 300 до 500.о. Инкубируйте смесь при 15 °C в течение 1 часа.
2. Поместите предметные стекла и реагенты в автоматизированную систему окрашивания предметных стекол Xmatrx и запустите программу, чтобы выполнить следующие шаги. Нанесите 800 мкл 1x PBS в течение 20 минут. Продуйте горки воздухом. Выполните фиксацию формалина путем введения 450 мкл 4% формалина в 1x PBS в течение 1 минуты с последующим промыванием 100% этанолом в течение 1 секунды дважды и в течение 2 минут один раз. Продуйте горки воздухом.
3. Нагрейте при температуре 45 °C в течение 2 минут, чтобы избежать образования пузырей при нанесении щупов. Нанесите 20 μл зондов ДНК, добавьте капли минерального масла, чтобы избежать испарения гибридизационного раствора, и поместите сверху покровную крышку. Денатурируют хромосомы и зонды ДНК путем нагревания предметных стекол при температуре 90 °C в течение 10 мин.
4. Для гибридизации инкубируйте предметные стекла при температуре 42 °C в течение 14 часов с покровными стеклами. Гибридизационный раствор состоит из 2x SSC, 100 мМ фосфата натрия, 1x раствора Денхардта, 100 мкг/мл азида натрия и 10% сульфата декстрана в формамиде.
5. Для стирки с высокой прочностью нагрейте предметные стекла при температуре 42 °C в течение 2 минут, снимите покровные стекла, постирайте предметные стекла в 2 раза SSC в течение 1 секунды 4 раза. Продуйте горки воздухом. Нанесите 800 мкл 0,4x SSC при 42 °C в течение 10 мин 2 раза. Промыть предметные стекла в 2x SSC при температуре 25 °C в течение 10 минут.
6. Выполните хромосомное окрашивание, нанеся 50 мкл 1 мкМ YOYO-1 в 1x PBS. Нанесите капли минерального масла во избежание испарения раствора для окрашивания, наденьте покровные стекла и выдерживайте при температуре 25 °C в течение 10 минут. Снимите покровные стекла, промойте предметные стекла в 2x SSC в течение 1 сек 4 раза. Продуйте горки воздухом. Нанесите 15 μл реагента ProLong Gold antifade. Наденьте покровные листы.

3. Чтение слайдов с помощью автоматической системы флуоресцентной визуализации

В этом разделе подробно описывается использование программного обеспечения Duet, которое входит в стандартную комплектацию автоматизированной системы сканирования ACCORD PLUS. Инструкции начинаются после включения в таком порядке: Olympus U-RFL-T блок питания для галогенной лампы, компьютер Dell precision T3500, микроскоп Olympus BX61 с подключенной камерой Olympus U-CMAD3.

1. Для настройки 10-кратного предварительного сканирования откройте программное обеспечение Duet в автоматизированной системе сканирования ACCORD PLUS. Нажмите кнопку "Онлайн". Введите новый идентификатор случая и назначьте идентификатор слайда. Нажмите на точку с надписью «BF». Это вариант светлого поля. Установите для параметра сканирования значение «10-кратное предварительное сканирование». Используйте «круг 2500x», «круг 10000x» или «прямоугольник». Нажмите «Установить и запустить» для 10-кратного предварительного сканирования.
2. Нажмите кнопку «ОК», чтобы запустить 10x Pre-Scan. Следуйте инструкциям, чтобы правильно настроить сканирование. Нажмите «Готово», чтобы начать сканирование. Нажмите на вкладку "Основные", чтобы вернуться на главный экран. Нажмите кнопку "Офлайн". Найдите идентификатор случая и идентификатор слайда, которые были назначены, и нажмите «Автономное сканирование». В черном поле в верхней левой области нажмите на стрелку и выберите «10x Prescan». С помощью стрелок (< || Δ > также известных как кнопки «назад», «пауза», «воспроизведение», «вперед») пройдитесь по отсканированным изображениям.
3. Найдя интересующее изображение, дважды кликните по экрану посередине целевой области и нажмите «Snap». При этом изображение будет нацелено на последующий захват. После выбора всех целей нажмите «Классифицировать». Выберите «10-кратное предварительное сканирование». Щелкните правой кнопкой мыши по изображению и получите возможность классифицировать изображения. Выберите «Polytene».
4. Настройте 40-кратное предварительное сканирование в программе Duet. Нажмите «Основные», чтобы вернуться в главное меню. Снова выберите «Онлайн». Выберите слайд. Замените "BF" на "FL". Измените имя задачи на "Revisit-X40-RG". Измените раздел прямо под последней настройкой на "Повторить-ВСЕ". Нажмите «Установить и запустить». Нажмите «ОК». Следуйте инструкциям еще раз, чтобы настроить автоматизацию. Нажмите кнопку «Начать сопоставление просмотров», чтобы сопоставить изображения 10x и 40x. Нажмите «Готово», чтобы начать сканирование. Как только это будет сделано, нажмите «Классифицировать» и посмотрите на изображения.

4. Репрезентативные результаты

На рисунке 1 графически изображена схема получения хромосомы высокого давления. Этот этап включает в себя процесс сжатия и сплющивания хромосом с помощью инструмента Dremel и механических тисков, а также визуализацию хромосом с помощью фазово-контрастного микроскопа. На рисунке 2 показана гибридизация флуоресцентно меченного зонда для таргетирования ДНК на препаратах предметного стекла хромосом с использованием автоматизированной системы окрашивания предметного стекла, использование автоматизированного сканирующего микроскопа для визуализации и картирования зондов после эксперимента FISH, а также размещение и ориентация геномных скаффолдов на хромосомах.

Препараты политеновых хромосом клеток яичников-нянь от самок An. gambiae были получены с использованием метода высокого давления. Этот метод не повреждает и не изменяет большую часть структуры хромосом (Рисунок 3). Он сплющивает изогнутые хромосомы и, таким образом, обнажает скрытые тонкие полосы, которые не видны на обычных препаратах (рис. 4).

Зонды, используемые в этом протоколе, являются клонами геномной ДНК BAC, полученными из библиотеки ND-TAM BAC, созданной из ДНК штамма An. gambiae PEST. Геномная ДНК для этой библиотеки была выделена из только что вылупившихся личинок первого возраста обоих полов. На рисунке 5 показаны результаты исследования FISH с использованием клонов BAC, гибридизированных с политенными хромосомами An. gambiae. Данная процедура была выполнена с помощью автоматизированной системы окрашивания предметных стекол Xmatrx. Используя цитогенетическую фотокарту An. gambiae¹⁰, два клона BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) и BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), были локализованы в подразделах 16C и 16D группы 2R соответственно. Тем не менее, поиск BLAST в отношении штамма An. gambiae PEST AgamP3 сборки ¹⁴ идентифицировал последовательности, гомологичные 102B24 и 142O19 в подразделах 16B и 17A плеча 2R соответственно (табл. 1). Таким образом, соответствие между геномными координатами и цитогенетическими подразделениями теперь может быть скорректировано в соответствии с данными нашего картирования. Поиск BLAST по сборкам генома An. gambiae M и S form показал, что два клона BAC расположены в разных контигах, но в одних и тех же скаффолдах внутри каждой формы (табл. 1). Идентифицированные контиги теперь могут быть связаны с определенными хромосомными участками. Кроме того, идентифицированные скаффолды теперь могут быть правильно ориентированы в пределах цитологических подразделений 16CD. Интересно, что расстояния между последовательностями 102B24 и 142O19 в скаффолдах составляют 1 892 981.о., 1 658 391.о. и 1 688 426.о. в сборках генома штамма PEST, M-формы и S-формы соответственно. Поскольку штамм PEST является гибридом между формами M и S, эта разница, вероятно, связана с неправильной сборкой генома PEST.

BAC (присоединение)	PEST-штамм AgamP3 Координаты	M-форма contigs Координаты	M-форма леса Координаты	S-форма contigs Координаты	S-форма леса Координаты
102В24<бр /> (BH372694)	2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43,681,342-<чел./> 43 681 874	ABKP020247 53.1<бр /> 32 513-< руб. /> 33 045	EQ090167.1 1,858,377-<чел./> 1 858 909	ABKQ010123 32,1<чел. /> 4 299-< руб. /> 4 832	EQ099711.1 215 891-< руб. /> 216 424
102В24<бр /> (BH372701)	2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43,788,213-<чел./> 43 788 969	ABKP020247 51.1<бр /> 24 816-< руб. /> 25 575	EQ090167,1,< руб. /> 1,772,683-<чел./> 1 773 442	ABKQ010123 35,1<чел. /> 27 782-< руб. /> 28 540	EQ099711,1,< руб. /> 305 514-< руб. /> 306 272
142O19<бр /> (BH368698)	2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45,428,580-<чел./> 45 429 264	ABKP020247 01.1<бр /> 2 499-< руб. /> 3 185	EQ090167.1 315 806-< руб. /> 316 492	ABKQ010123 76.1 49 242-< кобр. /> 49 942	EQ099711.1 1,791,625- 1 792 325
142O19<бр /> (BH368703)	2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45,560,099- 45 574 323	ABKP020220< чел. /> 17.1<чел. /> 30,971- 32 469	EQ090167.1 200 518-< руб. /> 202 016	ABKQ010123 79,1< чел. /> 27 760-< руб. /> 28 508	EQ099711.1 1,903,569-<чел./> 1 904 317

Таблица 1. Результаты BLAST последовательностей BAC-конца против сборок генома An. gambiae.

Рисунок 1. Схематическое изображение получения хромосом высокого давления. Завязи комаров показаны на правильной стадии развития.

Рисунок 2. Схема, представляющая собой автоматизированную FISH, сканирование слайдов и хромосомное картирование геномных скаффолдов.

Рисунок 3. Распространение политеновой хромосомы 3 An. gambiae, полученное с помощью метода высокого давления. 3L и 3R обозначают левую и правую руки на теломерах. PH и IH указывают на перицентрический и интеркалярный гетерохроматин соответственно.

Рисунок 4. Сравнение политенных хромосом An. gambiae, полученных с использованием традиционной (сверху) и высокой (снизу) техники. Изображения охватывают подразделения 29A-30E рукава 3R (A) и 43D-46D рукава 3L (B).

Рисунок 5. РЫБЫ BAC клонируют политенные хромосомы An. gambiae. А) Гибридизация 102B24 (красный сигнал) с плечом 2R. B) Двухцветные FISH 102B24 (красный сигнал) и 142O19 (синий сигнал) в подразделы 16C и 16D растянутого плеча 2R соответственно. Стрелками обозначены сигналы гибридизации клонов BAC, помеченных Cy3 (красный) и Cy5 (синий). С – центромерная область. a/+ показывает инверсию гетерозиготы 2La. Хромосомы противостояли флуорофору YOYO-1.

Обсуждение

Наиболее важным этапом процедуры высокого давления является надлежащее раздавливание клеток-кормилиц яичников, выделенных на III стадии развития яичников по методу Кристоферса¹³. Неправильное сдавливание может привести к недостаточному распространению хромосом, что может вызвать проблемы при попытке определить местоположение зонда после FISH. Если хромосомы чрезмерно сжаты, они могут быть сломаны или удлинены до такой степени, что полосатые узоры будут утрачены. Создание нескольких слайдов должно привести к согласованности при попытке сжатия слайдов с помощью инструмента Dremel, что повысит общую эффективность производства слайдов. Метод высокого давления был впервые разработан для недавно выделенных слюнных желез D. melanogaster⁹. Тем не менее, яичники комаров обычно консервируют в модифицированном фиксирующем растворе Карноя (3 метанола: 1 ледяная уксусная кислота по объему) перед тем, как они используются для хромосомных препаратов. Поэтому мы модифицировали существующий протокол измерения высокого давления, чтобы сделать его подходящим для неподвижных политенных хромосом клеток яичников-кормилиц малярийного комара An. gambiae. Поскольку высокое давление применяется с помощью прецизионных тисков, обладающих высокопараллельной рабочей поверхностью всего предметного стекла, для подготовки хромосомного сквоша требуется значительно меньше времени, чем при использовании традиционной техники постукивания ластиком карандаша.

К другим важным этапам можно отнести достаточное замачивание фолликулов в 50% пропионовой кислоте и нагрев предметного стекла. Оба эти шага необходимы для выравнивания хромосом. Если ими пренебречь, хромосомы могут казаться блестящими после обезвоживания, что потенциально приводит к переизбытку фона, который можно принять за сигнал в FISH. Техника сжатия под высоким давлением также хорошо работает при использовании тех же растворов при изготовлении препаратов митотических хромосом. Дополнительное растяжение и уплощение помогает лучше экспрессировать хромосомы из их ядер. Добавление равного давления должно соответствующим образом сгладить их, чтобы обеспечить измерения и потенциально лучшее разрешение полос, видимых от окрашивания. Подробности об выделении митотических хромосом у комаров приведены в другом месте¹⁵. Несмотря на то, что обычных препаратов для приготовления кабачков достаточно для многих целей, включая FISH ¹⁶ и иммуноокрашивание¹⁷, метод высокого давления не только снижает потенциальную дисперсию от одного слайда к другому, но и повышает общее качество хромосом, что приводит к более высокой детализации при картировании хромосом. Эта процедура также может быть использована для подготовки политенных хромосомных мембранных стекол для лазерной микродиссекции.

К ограничениям метода высокого давления относятся поломка предметного стекла и чрезмерное растяжение хромосом. Поломка ползуна, вызванная слишком большим напряжением на предметное стекло через тиски, возможна, но ограничена использованием давления, указанного в статье. При чрезмерном растяжении хромосом, если инструмент Dremel прикладывается к предметному стеклу в течение длительного периода времени, существует вероятность того, что хромосомы могут стать слишком растянутыми и потерять разрешение. Это можно исправить, применяя инструмент в течение короткого периода времени, проверяя под микроскопом и уделяя больше времени с помощью инструмента Dremel, если хромосомы недостаточно распределены.

Традиционный протокол FISH включает в себя ряд этапов промывки и инкубации, которые обычно длятся 5-20 минут и требуют почти полного внимания исследователя на протяжении всего эксперимента. Более того, количество слайдов, которые можно обрабатывать вручную, обычно ограничено несколькими слайдами в данном эксперименте. В отличие от этого, автоматизированная система окрашивания предметным стеклом выполняет все этапы (включая промывку, инкубацию, нанесение зонда, денатурацию, гибридизацию, нанесение покровного стекла и удаление) автоматически. Это освобождает до 6-8 рабочих часов для исследователя в эксперименте FISH. Кроме того, автоматизированная система FISH позволяет значительно увеличить пропускную способность. Например, система Xmatrx способна обрабатывать до 40 анализов на предметных стеклах с одним препаратом и до 80 анализов на предметных стеклах с двумя препаратами одновременно. Одним из недостатков этой системы является то, что она не эффективна для небольшого числа экспериментов FISH, так как требует приготовления больших объемов растворов. Кроме того, запрограммированный в системе протокол FISH может потребовать модификации и корректировки для новых приложений.

Система сканирования предметного стекла представляет собой автоматизированную версию флуоресцентного микроскопа. Автоматизированное перемещение предметного столика и простая панель управления микроскопом освобождают время исследователя и делают работу с микроскопом предельно простой. Например, программное обеспечение в сканирующей системе ACCORD PLUS позволяет легко захватывать несколько каналов флуоресценции и легко управлять получением изображений. Примером этого является включение захвата z-стека, а не съемки одного изображения; Программное обеспечение захватывает настраиваемый Z-стек изображений, чтобы гарантировать, что по крайней мере одно изображение остается в фокусе. Хотя эта система больше предназначена для получения нескольких изображений (много клеток на одном слайде), она все же делает поиск хромосом на слайде намного проще, чем навигация по слайду вручную.

Как автоматизированная система окрашивания предметными стеклами, так и система сканирования регулярно используются в цитогенетических клиниках для FISH-диагностики хромосомных аномалий в клетках человека. В этом исследовании мы разработали протокол, который использует эти автоматизированные системы для базового исследовательского приложения. Автоматизированный протокол физического картирования с высокой пропускной способностью может способствовать быстрой разработке физических хромосомных карт для любых видов, представляющих интерес. Хотя в этом отчете мы использовали политенные хромосомы для физического картирования, митотические хромосомы также могут быть использованы с этими системами. Было бы полезно, чтобы протокол был адаптирован к митотическим хромосомам, потому что большинство организмов не развивают читаемые политенные хромосомы. Тем не менее, политенные хромосомы, когда они доступны, могут предоставить полезную информацию о соответствии доменов функционального генома структуре хромосомы с самым высоким разрешением. Организационные принципы политенных хромосом, такие как узоры полос и межполосных зон, в последнее время были уподоблены принципам организации регулярных неполитенных (интерфазных) хромосом¹⁸. Таким образом, детальное физическое картирование, выполненное на хромосомных препаратах высокого давления, может связать последовательности ДНК со специфическими хромосомными структурами, такими как полосы, межполосы, пуховки, центромеры, теломеры и гетерохроматин; Таким образом, создаются сборки генома на основе хромосом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Покровные накладки для микроскопа 22x22 мм	Fisher	12-544-10
18x18 мм Покровные накладки для микроскопа	Fisher	12-553-402
Уксусная кислота	Fisher	A491-212
Метанол	Fisher	A412-4
Пропионовая кислота	Sigma-Aldrich	402907
Dremel 200 вращающийся инструмент с гибким валом насадка	Rand		3" Многоцелевая мини-настольная шлифовальная машина (с ограничителем скорости)
Специально разработанная 200 μ l пластиковые наконечники (пластиковые края с бусинами) для инструмента Dremel	Pipetman	F171300	Режьте и нагревайте толстый конец наконечников пипеток
Быстрые тиски с оловянным покрытием	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	Прецизионная шлифовка квадратная и параллельная с точностью до 0,00025
Динамометрический ключ	Craftsman	44593
ThermoBrite Slide Система денатурации/гибридизации	Abbott Molecular	30-144110
Барьерные предметные стекла 25 мм	Abbott Molecular	XT108-SL
25 мм покровные стекла	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx Автоматизированная система окрашивания предметных стекол	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 Стереомикроскоп Leica		Leica VA-OM-E194-354	Можно использовать другой стереомикроскоп
Olympus CX41 Фазовый микроскоп Olympus		CX41RF-5	Можно использовать другой фазовый микроскоп
ACCORD PLUS Автоматизированная сканирующая система	BioView (США)	BV-5000-ACCP
10x	PBS Invitrogen	P5493
10% NBF (нейтральный буферизованный формалин)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% формамид	Fisher Scientific	BP227500
Декстрана сульфат натрия соль	Sigma	D8906
20x SSC буфер	Invitrogen	AM9765
Фосфат натрия	Sigma-Aldrich	S3264
50x Раствор Денхардта	Sigma-Aldrich	D2532
Азид натрия	Sigma-Aldrich	S2002
1 мМ YOYO-1 йодид (491/509) раствор в DMSO	Invitrogen	Y3601
ProLong Gold антифадерный реагент	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE	Healthcare PA53022, PA55022
BSA	Sigma	A3294
ДНК-полимераза I	Fermentas	EP0041
DNase I	Fermentas	ЕН0521