Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство лентивирусов векторов для трансдукции клетки из центральной нервной системы

36.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4031

⸱

24 мая 2012 г.

 ,  ,  , 
1Department of Neurology and Hope Center for Neurological Disorders, Washington University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описываются производства, очистки и титрования лентивирусов векторов. Мы приведем пример того, лентивирусов вектор-опосредованной доставки генов в первичных культивируемых нейронов и астроцитов. Наши методы могут применяться и к другим типам клеток В пробирке И В естественных условиях.

Аннотация

Эффективная доставка генов в центральную нервную систему (ЦНС) имеет важное значение для изучения функций генов, моделирования неврологических заболеваний и разработки терапевтических подходов. Лентивирусные векторы являются привлекательными инструментами для трансдукции нейронов и других типов клеток ЦНС, поскольку они способны трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, обеспечивают устойчивую экспрессию трансгенов, обладают относительно большой упаковочной емкостью и низкой токсичностью 1-3. Лентивирусные векторы были успешно использованы для трансдукции многих типов нервных клеток in vitro 4-6 и в живых организмах 7-10.

Были приложены значительные усилия для разработки лентивирусных векторов с повышенной биобезопасностью и эффективностью доставки генов. Современные репликативно-дефектные и самоинактивирующиеся (SIN) лентивирусные векторы третьего поколения показаны на Рисунке 1. Необходимые элементы для упаковки вектора разделены на четыре плазмиды. В лентивирусной трансферной плазмиде область U3 в 5'-длинном концевом повторе (LTR) заменена сильным промотором другого вируса. Эта модификация позволяет осуществлять транскрипцию последовательности вектора независимо от белка Tat ВИЧ-1, который обычно необходим для экспрессии генов ВИЧ 11. Сигнал упаковки (Ψ) имеет важное значение для инкапсидации, а Rev-отклик элемент (RRE) необходим для получения векторов с высоким титром. Центральный полипуриновый тракт (cPPT) важен для ядерного импорта ДНК вектора, что необходимо для трансдукции неделящихся клеток 12. В 3'-LTR цис-регуляторные последовательности полностью удалены из области U3. Эта делеция копируется в 5'-LTR после обратной транскрипции, что приводит к транскрипционной инактивации обоих LTR. Плазмида pMDLg/pRRE содержит гены gag/pol ВИЧ-1, которые кодируют структурные белки и обратную транскриптазу. pRSV-Rev кодирует Rev, который связывается с RRE для эффективного экспорта РНК из ядра. pCMV-G кодирует гликопротеин вируса везикулярного стоматита (VSV-G), который заменяет белок Env ВИЧ-1. VSV-G расширяет тропизм векторов и позволяет концентрировать их методом ультрацентрифугирования 13. Все гены, кодирующие вспомогательные белки, включая Vif, Vpr, Vpu и Nef, исключены из системы упаковки. Производство и манипуляции с лентивирусными векторами должны проводиться в соответствии с рекомендациями NIH по исследованиям с использованием рекомбинантной ДНК (http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf). Перед использованием лентивирусных векторов может потребоваться разрешение соответствующего институционального комитета по биологической и химической безопасности. Лентивирусные векторы обычно производят путем котрансфекции клеток 293T лентивирусной трансферной плазмидой и хелперными плазмидами, кодирующими белки, необходимые для упаковки вектора. Многие лентивирусные трансферные и хелперные плазмиды можно получить из Addgene, некоммерческого репозитория плазмид (http://www.addgene.org/). Были разработаны некоторые стабильные клеточные линии для упаковки, однако такие системы менее гибкие, и их эффективность упаковки обычно снижается со временем 14, 15. Коммерчески доступные наборы для трансфекции могут обеспечивать высокую эффективность трансфекции 16, но они могут быть очень дорогими при крупномасштабном приготовлении векторов. Методы осаждения фосфатом кальция обеспечивают высокоэффективную трансфекцию клеток 293T и, таким образом, представляют собой надежный и экономически выгодный подход к производству лентивирусных векторов.

В данном протоколе мы создаем лентивирусные векторы путем котрансфекции клеток 293T четырьмя плазмидами на основе принципа осаждения фосфатом кальция с последующей очисткой и концентрированием методом ультрацентрифугирования через 20% подушку сахарозы. Титры векторов определяют с помощью анализа методом сортировки клеток с помощью флуоресцентно-активированного сепаратора (FACS) или с помощью qPCR в реальном времени. Производство и определение титра лентивирусных векторов по данному протоколу могут быть завершены в течение 9 дней. Мы приводим пример трансдукции этих векторов в культуры неокортекса мыши, содержащие как нейроны, так и астроциты. Мы демонстрируем, что лентивирусные векторы обеспечивают высокую эффективность трансдукции и селективную экспрессию генов в зависимости от типа клеток в первичных культурах клеток ЦНС.

Протокол

1. Упаковка лентивирусов векторов

Лентивирусов векторов производятся котрансфекции из лентивирусов вектор передачи и другие плазмиды, необходимые для упаковки в 293T клеток кальцием метод трансфекции фосфатом. Мы используем 10 100-мм культуры тканей блюда в этом протоколе. Он может быть увеличен или уменьшен в зависимости от приложения. 293T клеточной линии сохраняется в модифицированной орлы Дульбекко среде (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг / л), с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.

  1. Семенной 293T клеток на 30-40 слияния% до 10 100-мм культуры тканей блюд (3 х 10 6 клеток / блюдо) в культуральной среде. Вернуться клетки инкубатора.
  2. После 20-24 ч культуре, проверьте плотность клеток. Клетки должны быть около 80% слияния во время трансфекции.
  3. Подготовьте 50 мл трубку. Добавить 4,4 мл TE79/10 (1 мМ TrisHCl, 0,1 мМЭДТА, рН 7,9) за вычетом общего объема следующие плазмидной ДНК. Добавить 100 мкг лентивирусов передача плазмиды (рис. 1), 58 мкг pMDLg / pRRE 31 мкг pCMV-G, 25 мкг pRSV-Rev, 600 мкл 2М CaCl 2. Аккуратно перемешайте.
  4. Подготовка еще 50 мл трубку. Добавьте 5 мл 2x HBS (0,05 М HEPES, 0,28 М NaCl, 1,5 мМ Na 2 HPO 4, рН 7.12).
  5. Возьмите ДНК-CaCl 2 смеси 10 мл пипетки и добавить в пробирку с 2 х HBS, по каплям при встряхивая трубку.
  6. Держите осадков реакции при комнатной температуре (RT) в течение 30 мин.
  7. Удалить культуры блюда из инкубатора. Смешать осадков реакции хорошо встряхивая. Добавьте 1 мл суспензии на каждые 100 мм блюдо содержащих клетки. Подвеска должна быть добавлена ​​медленно, по капле, осторожно вращая среды в блюдо. Возвращение этих блюд в инкубатор и оставить на 5 часов.
  8. Удаление среды от культуры. Добавить 6 мл свежей питательной среде, содержащей 6 ммоль натрия буtyrate к каждому блюду. Вернуться культуры в инкубатор. После ночной культуры, если есть люминесцентные репортером в конструкцию, проверьте выражение гена-репортера под флуоресцентным микроскопом. Как правило, более 80% клеток выразить ген-репортер, если это обусловлено повсеместным промоутер (например, ЦМВ промотор).
  9. Через два дня (40-44 ч) после трансфекции, собирают супернатант из 10 блюд на 2 50 мл пробирки (около 30 мл каждая трубка). Замораживание супернатант в -80 ° C морозильник или перейти к следующему шагу.

2. Концентрация и очистка векторы

  1. Центрифуга недавно собранных или талой супернатант на 900 г (около 2000 оборотов в минуту) в течение 10 минут, чтобы удалить все клетки мусора в супернатант.
  2. Прикрепите 60-мл шприц 0,2-мкм фильтр SFCA шприц. Передача супернатант из 50 мл трубки шприц. Фильтр супернатант в пробирку центрифуги polyallomer.
  3. Возьмите 5 мл 20% сахарозы (подготовлен в PBS) в 5 мл пипетки. Вставитьпипетки на дно пробирки, содержащие центрифуги супернатант. Медленно добавить раствор сахарозы в соответствии с вектором супернатант. Повторите эти действия для супернатант из другой трубы.
  4. Центрифуга супернатанта в 11 000 оборотов в минуту и ​​4 ° C в течение 4 часов с Beckman ЮЗ28 качели ротора.
  5. Удалить супернатант. Добавить 150 мкл 4% лактозы (подготовлен в PBS) для каждой центрифуге трубки. Ресуспендируют гранул.
  6. Передача концентрированной вектор из всех пробирок на 1,5 мл трубки. Оставьте пробирку на льду в течение 15 мин.
  7. Смешать вектор подвески с помощью пипетки. Спина с микроцентрифужных на полной скорости (около 16000 г) в течение 1 мин.
  8. Передача супернатант в новую 1.5-мл трубку. Разделите окончательного образца в 20 мкл аликвоты и хранить их в -80 ° C морозильник.

3. Титрование векторы

  1. Семенной 5 х 10 4 / лунку HT1080 клеток в 12-луночного планшета в 1 мл DMEM среде с 10% ЭТС.
  2. После overnigHT культуры, рассчитывать клеток из одной ямы и набрать номер ячейки.
  3. Сделайте 5 раз серийного разведения (1:5, 1: 25; 1:125 и 1:625) концентрированного вектор с питательной среде. Добавить I мкл каждого разведенного вектор отдельных скважин. Образцы могут быть продублированы для повышения точности.
  4. Добавить 1 мкл 4 мг / мл Polybrene (Hexadimethrine метила) в каждой лунке, содержащей вектор и в и без вектора. Перемешайте, осторожно встряхивая пластины. Вернуться в инкубаторе в течение 48 часов.
  5. Удаление среды из скважин культуре клеток. Промыть каждую лунку с PBS. Добавить 250 мкл 1x трипсина-EDTA решение клеток. Когда клетки отделяются (3-5 мин), добавить 1 мл культуральной среды. Ресуспендируют клеток с помощью пипетки. Передача клеточной суспензии в пробирки на 1,5 мл центрифугу.
  6. Центрифуга в 900 г в течение 6 мин. Для векторов с люминесцентными гена-репортера (например, GFP), переходите к пункту 3.7 для анализа FACS. Для векторов, не репортер, переходите к пункту 3.8 для реального КПЦР времени.
  7. Для векторов, содержащих флуоресцентныеrescent гена-репортера, удалите супернатант и ресуспендируют осадок 300 мкл 3,7% формальдегида в PBS. Определить процент репортер положительных клеток на основе анализа FACS. Титр будут представлены как трансдукция единиц на миллилитр концентрированной вектор (TU / мл).

figure-protocol-1

Например, если 1 х 10 5 клеток трансдуцированных с 1/25 мкл (0,04 мкл) вектора и 30% клеток репортер положительный, титр будет:

figure-protocol-2

Используйте только разведения попадают в линейной зависимости между процентом положительных клеток и количество векторных добавил рассчитать титр. Окончательный титр должна быть в среднем титр получить преобразователями, по крайней мере 2 различных количеств вектора.

  1. Для векторов безфлуоресцентный ген репортер, извлечения геномной ДНК из клеток с использованием HT1080 QIAamp ДНК Mini Kit (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Усиление вектор последовательности геномной ДНК с использованием ABI Prism 7000 Detection System (Applied Biosystems) с праймерами (ВИЧ-1 PBS / дюйм регион 17) 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 'и 5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3 », и TaqMan зонда 5 '-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3'. Альбумин ген, который является одним копий гена в геноме (2 экз / клетка) также усиливается с праймерами 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 'и 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3 », и зонд 5'-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3 », как внутренний контроль. Определить копию количество векторных и альбумина методом ПЦР в 96-луночного планшета в соответствии с инструкцией завода-изготовителя со следующей программой: 50 ° C в течение 2 мин, 95 ° С в течение 10 мин, 35 циклов 95 ° C в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 2 мин. Десять раз серийные разведения плазмиды с известной концентрацией (представлены в виде копиичисло), содержащий шаблон последовательности должны быть усилены для создания калибровочной кривой для количественного определения неизвестных образцов. Титр будет представлен как интеграция единиц на миллилитр концентрированной вектор (МЕ / мл).

figure-protocol-3

4. Трансдукции неокортекса культур

Неокортекса культур, содержащих как нейроны и клетки глии готовится из коры мыши использованием двухступенчатой ​​процедуры покрытие, как описано выше 18. Neocortices полученные из эмбриональных мышей на 14-16 день беременности высевают на ранее установленные глиальных монослоя в MEM с добавлением 10% FBS, 20 глюкоза мм и 2 мм глютамина в 24-луночного планшета для культуры ткани.

  1. Через 5 дней в пробирке, добавить 10 мкМ цитозинарабинозид (Ara-C) в neocortical культуру подавлять без нейронов деление клеток. Продолжить культуре клеток в течение 2 дней.
  2. Теплый питательной среды в 37 ° С на водяной бане 5-10 мин. Замените Ara-C среде, содержащей свежей питательной среды (500 мкл / лунку).
  3. Добавить вектор желаемого МВД (кратность инфекции; отношение числа векторных частиц с числом клеток-мишеней) к культуре. Продолжить культуры в течение 24 часов. Мы используем МВД 1-10 (обычно 5) в первичных корковых культур.
  4. Замените культуральной среде со свежей средой. Продолжить культуры. Если есть ген-репортер в векторной конструкции, проверить клетки под флуоресцентным микроскопом через 2 дня после трансдукции. Выражение репортер ген будет виден в нейронах 2-7 после трансдукции, в зависимости от конструкции вектора и дозы используется.

5. Представитель Результаты

Титры лентивирусов векторов производится с этого диапазона протокол 10 8 -10 10 МЕ / мл, whicч предназначены для трансдукции различных типов клеток из ЦНС, как в пробирке и в естественных условиях. таблице 1 и рисунке 2 показано представитель результат с помощью векторов производства этого протокола. Мы трансдуцированных мышиный неокортекса культур лентивирусов векторов выражения зеленый флуоресцентный белок (GFP), контролируемые synapsin (SYN) промоутер или глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) промотора. Через семь дней после трансдукции, мы провели иммунной маркировать нейроны и астроциты с анти-NeuN и анти-GFAP антителами, соответственно. Как показано в таблице 1 и на рис. 2А, после трансдукции с вектора, несущего synapsin промоутера, более 90% нейронов (NeuN + клеток), экспресс-GFP и не астроциты (GFAP + клеток) выразить это ген-репортер. Когда GFAP промоутер используется в конструкции вектор (рис. 2В), около 80% астроцитов (GFAP + клеток) выраженияс GFP, все GFP + клеток астроцитов, что подтверждается колокализации с GFAP и отсутствия GFP выражение в NeuN-меченых клеток. Эти результаты показывают, что лентивирусов векторов очень эффективны для доставки трансгенов в клетках центральной нервной системы и клеточной конкретного гена может быть достигнуто при необходимости используются промоутеров.

figure-protocol-4
Рисунок 1. Схематическое изображение ВИЧ на основе лентивирусов векторов и упаковка плазмид. ВИЧ-1 провируса показан в верхней части. Элементы вектора производства разделены на четыре различных плазмид. Лентивирусов передачи плазмида содержит гибридный LTR 5 ', в которой U3 область заменяется цитомегаловирус (CMV), промотор упаковки сигнала (ψ), RRE последовательность, центральный тракт polypurine (cPPT), гена (например, люминесцентные репортер) вместе с промоутером выбора, и 3 'LTR, в которомцис-регуляторных последовательностей полностью удаляются из U3 региона. pMDLg / pRRE содержит кляп и пол гены и последовательности РРЭ от ВИЧ-1 под контролем промотора CMV. pRSV-Rev содержит кодирующую последовательность Rev обусловлен промоутер RSV. pCMV-G содержит VSV-G гена белка под контролем промотора CMV. PA указывает на сигнал полиаденилирования от человеческого β-глобина генов.

figure-protocol-5
Рисунок 2. Экспрессия генов в репортер мыши неокортекса смешанной культуры трансдуцированных лентивирусов переносчиков клетки определенного типа промоутеров. Культур трансдуцированных LV-SYN-GFP () или LV-GFAP-GFP векторов (B) в МВД 5. Через семь дней после трансдукции клеток immunostained с анти-NeuN или анти-GFAP антителами. Верхняя панель показывает GFP флуоресценции, средней панели показывают, окрашивания и нижняя панели объединены изображения (GFP: зеленый; NeuN или GFAP: красный).

Вектор GFP + клеток в нейроны GFP + в астроциты
LV-SYN-GFP 92,2 ± 7,3 0
LV-GFAP-GFP 0 78,3 ± 11,5

Таблица 1. Сравнение GFP выражение в мышиных неокортекса культуры трансдуцированных лентивирусов переносчиков различных промоутеров.
мышей неокортекса культур (5 х 10 5 / и в 24-луночного планшета) были трансдуцированных LV-SYN-GFP или LV-GFAP-GFP в МВД 5. Через семь дней после трансдукции, культуры были зафиксированы и immunostained для NeuN или GFAP. Количество GFP и NeuN / GFAP выражения клетки подсчитывали в образах из 10 полей в экспериментальных условиях. Значения представляют собой процент нейронов (NeuN + клеток) илиастроциты (GFAP + клетки), которые также выразили ген GFP репортера. Значения указаны средние значения ± SD из трех независимых экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе, мы показали, производство лентивирусов векторов и применение этих векторов в неокортекса культур. Мы продемонстрировали эффективную и клетки определенного типа трансдукции с векторами производятся с помощью этих методов. Когда промоутер synapsin использовании GFP выражение строго конкретный нейрон. Когда промоутер GFAP использовании GFP выражение исключительно в астроциты. Если ни один тип клеток конкретных выражений не требуется, вездесущий промоутер может быть использован. Мы обнаружили, как и ubiqut...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH Neuroscience Blueprint Основные гранта (P30 NS057105, BJS) в Вашингтонском университете, Программа гранта NS032636 (BJS) и Надежда Центра неврологических расстройств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу
DMEM Sigma-Aldrich D5796
MEM Invitrogen 11090-081
Эмбриональной телячьей сыворотки Hyclone SV3001403
PBS Mediatech 21-040-СМ
Трипсин-EDTA Sigma-Aldrich T3924
Бутират натрия Sigma-Aldrich B5887
Hexadimethrine бромид (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
293T клеток ATCC CRL-11268
HT1080 клеток ATCC CCL-121
Сокол 100 х 20 мм ткань культурноэлектронной блюдо BD Biosciences 353003
1 х 3 ½ в трубы центрифуги polyallomoer Beckman Coulter- 326823
0,2-микронной шприц фильтр Гранулирование 431219
QIAamp ДНК Mini Kit Qiagen 51304

Ссылки

  1. Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  2. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
  3. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
  4. Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
  5. Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
  6. Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
  7. Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
  8. Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
  9. Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
  10. Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
  11. Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
  12. Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
  13. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
  14. Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
  15. Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
  16. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499(2009).
  17. Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
  18. Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
  19. Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
  20. Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
  21. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  22. Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10(2009).
  23. Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
  24. Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
  25. Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
  26. Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
  27. Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
  28. Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FACS293T
Производство лентивирусов векторов для трансдукции клетки из центральной нервной системы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.