Нейронных цепей топографически организованы в функциональные отсеки с конкретным молекулярным профилей. Здесь мы предлагаем практические и технические меры для выявления глобальной топографии мозга с помощью универсального подхода wholemount иммуногистохимического окрашивания. Мы продемонстрировать полезность метода с помощью хорошо понятных цитоархитектонике и схема мозжечка.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Wholemount иммуногистохимии для выявления сложной топографии мозга
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Повторяется и хорошо понимал сотовой архитектуры мозжечка делают его идеальной модели системы для изучения мозга топографии. В основе ее относительно равномерным цитоархитектонике это сложный комплекс парасагиттальных областях генов и экспрессии белков. Молекулярной фрагментации мозжечка отражается на анатомические и функциональные организации афферентных волокон. Чтобы в полной мере оценить сложность мозжечка организации мы ранее уточнены wholemount подход окрашивания высокой пропускной способности анализа паттернов дефектов мыши мозжечка. Этот протокол описывает подробно реактивы, инструменты и практические шаги, которые являются полезными для успешного выявление закономерностей экспрессии белка во взрослом мозжечке мыши с помощью wholemount окрашивания. Шаги, подчеркнул здесь продемонстрировать полезность этого метода с использованием выражения zebrinII / aldolaseC как пример того, как мелкий рельеф мозга могут быть выявлены вродной трехмерной конформации. Описываются также адаптации к протоколу, что позволяет для визуализации экспрессии белка в афферентных проекций и большой мозжечка для сравнительного исследования молекулярной топографии. Для иллюстрации этих приложений, данные из афферентных окрашивания мозжечка крысы включены.
Протокол
1. Перфузии животных и мозжечка Dissection
- В зависимости от белка, перфузии могут быть необходимы для успешного 1,2 окрашивания. Transcardiac перфузии является инвазивной, не выживание процедура, которая требует правильного использования анестетиков. Правильная подготовка, институциональное утверждение и одобрение IACUC все необходимые Перед процедурой. Это всегда хорошая идея консультироваться ветеринары учреждения, чтобы получить помощь в определении потребностей эксперимента и получения правильного обучения. Перед процедурой, животное должно быть глубоко под наркозом и не реагируют на стимулы, такие как ноги или хвост шнура. Используя ножницы....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы описали технические детали, необходимые для успешного окрашивания wholemount помощью универсальной иммуногистохимический подход для выявления экспрессии белка в развивающемся и взрослом мозге. Используя этот подход, сложных молекулярных моделей выражения могут быть проанализированы и оценены топографии мозга без необходимости трудоемкого и трудоемким процедурам срезов тканей.
Этот протокол был использован для выявления узорной выражение из нескольких белков клетки Пуркинье в обоих взрослы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
RVS поддерживает новый следователь запуска средства Альберта Эйнштейна Медицинского колледжа университета Ешива.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Материалы | Функции в протокол | ||
| Перфузии насоса (Fisher Scientific/13-876-2) | Позволяет последовательное и медленное перфузии. | ||
| Sharp-наконечник Ножницы (FST/14081-08) | Основное применение в перфузии и рассечение. | ||
| Блант наконечником щипцы (FST/91100-12) | Для стабилизации сердце для вставки перфузии иглы. | ||
| Пинцет (ФСТ по Дюмон AA/11210-10) | Для использования во время вскрытия мозг из черепа и отделить мозжечка от остальной части мозга. Это важно, потому что у них есть немного закругленным кончиком, что позволяет свести к минимуму повреждения мозжечка во время вскрытия. | ||
| Nutator (Fisher Scientific) | Используется для сохранения ткани в движение во время инкубационного периода. | ||
| 1,5 мл трубки (Sarstedt / Винтовая крышка Micro Tube) | Все этапы егоtochemistry протокола состоится в этих пробирок. Закругленным дном гарантирует, что мозжечок находится в движении. | ||
| Перфорированные ложка (FST/10370-17) | Используется для сохранения wholemounts в микропробирки, мягко переливание из отработанного раствора. | ||
| Leica MZ16 FA микроскоп | Используется для изучения wholemount окрашивания. | ||
| Leica DFC3000 FX камер | Используется для захвата wholemount изображений. |
Таблица 1.
| Пример календаря для типичного эксперимента wholemount | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| День 1 | Дента исправления комнатной температуре 8 часов | Дента отбеливатель, 4 ° С, ночь | ||||||
| День 2 | 100% метанола, комнатной температуры, 2, 30 мин каждый | 100% метанола, замораживания / оттаивания, 4x, 30 мин min/15 | п = "2"> 100% метанола, -80 ° С, ночь | |||||
| День 3 | 50% MeOH/50% PBS при комнатной температуре, 60-90 мин | 15% метанол / 85% PBS при комнатной температуре, 60-90 мин | 100% PBS при комнатной температуре, 60-90 мин | 10μg/mL протеиназы K в PBS при комнатной температуре 2-3 мин | 100% PBS при комнатной температуре, 3x, 10 минут каждый | ФЭУ, 4 ° C, ночью | ||
| День 4-5 | PMT + 1 ° антитела + 5% ДМСО, 4 ° С, 48 часов | |||||||
| День 6 | ФЭУ, 4 ° C, 2-3x, 2-3 часов каждый | PMT + 2 ° антитела + 5% ДМСО, 4 ° С, 24 часов (или начать усиление шаги ABC комплекс) | ||||||
| День 7 | ФЭУ, 4 ° C, 2-3x, 2-3 часов каждый | PBT, комнатной температуры, 2 часа | Инкубируйте в свежем DAB в PBS до оптимального окрашивания визуализируется | |||||
| Рецепты (* = подготовить свежий каждый раз) | |
|---|---|
| PBS (фосфатный буферный раствор) | 0,1 М фосфатный буферный раствор в дистиллированной воде. рН 7,2 (Sigma таблетки; P4417) |
| PFA (параформальдегид) | Производимые и хранят в замороженном виде 20%-ным раствором и затем разбавляют до 4% в PBS для рабочего раствора (Fisher Scientific, T353) |
| Фиксатор 3 Дента * | 4 частей метанола 1 часть диметилсульфоксид (ДМСО, Fisher Scientific, D159-4) |
| Дента Bleach 3 * | 4 частей метанола 1 часть диметилсульфоксид (ДМСО, Fisher Scientific, D159-4) 1 часть 30% перекиси водорода |
| Ферментативного пищеварения | 10 мкг / мл протеиназы К (Roche Diagnostics, 03115828001) в PBS. |
| PBST | PBS, содержащий: 0,1% Твин-20 (Fisheт научно-BP337; Тритон также может быть использован вместо Твин-20 во всех случаях). |
| PMT 25 * | PBS, содержащий: 2% обезжиренное сухое обезжиренное молоко (гвоздика предпочтительнее) 0,1% Твин-20 (Fisher Scientific, BP337) |
| PBT 25 * | PBS, содержащий: 0,2% бычьего сывороточного альбумина (Sigma, B9001S) 0,1% Твин-20 (Fisher Scientific, BP337) |
| DAB * | Растворите 10 мг таблетки 3,3-диаминобензидина (Sigma-Aldrich, D5905) в 40 мл PBS. Добавить 10 мкл 30% перекиси водорода для начала реакции). |
| ABC Комплексное решение | Vectastain комплект (Vector Laboratories, Inc, PK-4000) |
Таблица 3.
Ссылки
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
- Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
