Измерительная ячейка Кинетика цикла прогрессии с метаболическим Маркировка и проточной цитометрии

Краткое содержание

Отслеживание тонкие изменения в прогрессии и кинетики стадии клеточного цикла может быть достигнуто путем использования сочетания метаболических маркировки нуклеиновых кислот с BrdU и общая окраска геномной ДНК с помощью йодида пропидия. Этот метод позволяет избежать химического синхронизации велосипедного клеток, тем самым предотвращая внедрение неспецифического повреждения ДНК, которые, в свою очередь влияет на прогрессию клеточного цикла.

Аннотация

Точный контроль инициации и последующего прохождения через различные фазы клеточного цикла имеет первостепенное значение для пролиферирующих клеток. Деление клеток в рамках клеточного цикла является неотъемлемой частью роста и размножения, а нарушение регуляции ключевых компонентов клеточного цикла связано с событиями, провоцирующими канцерогенез ^1,2. Молекулярные агенты в противоопухолевой терапии часто воздействуют на биологические пути, ответственные за регуляцию и координацию деления клеток ³. Хотя кинетика клеточного цикла может варьироваться в зависимости от типа клеток, распределение клеток по четырем стадиям клеточного цикла в пределах конкретной клеточной линии довольно стабильно благодаря постоянному паттерну экспрессии митогенов и факторов роста. Генотоксические воздействия и другие клеточные стрессоры могут привести к временной блокировке прогрессии клеточного цикла, что вызывает остановку или временную паузу в определенной фазе клеточного цикла для запуска соответствующего механизма ответа.

Возможность экспериментального наблюдения за поведением популяции клеток в зависимости от стадии клеточного цикла является важным достижением в клеточной биологии. Для изоляции клеток на определенных стадиях клеточного цикла обычно используются такие процедуры, как митотический «шейк-офф» (отделение клеток путем встряхивания), дифференциальное центрифугирование или сортировка на основе проточной цитометрии ^4-6. Затем эти фракционированные популяции, обогащенные клетками определенной фазы цикла, подвергаются экспериментальным воздействиям. При использовании таких методов физического разделения выход, чистота и жизнеспособность отделенных фракций часто могут снижаться. Кроме того, временной интервал между разделением популяций клеток и началом экспериментального воздействия, в течение которого фракционированные клетки могут перейти на следующую стадию клеточного цикла, может создать значительные трудности при реализации и интерпретации этих экспериментов.

Другие подходы к изучению стадий клеточного цикла включают использование химических веществ для синхронизации клеток. Обработка клеток химическими ингибиторами ключевых метаболических процессов каждой стадии клеточного цикла полезна для блокирования перехода цикла на следующую стадию. Например, гидроксимочевина, ингибитор рибонуклеотидредуктазы, останавливает клетки на переходе G1/S, ограничивая подачу дезоксинуклеотидов — строительных блоков ДНК. Другие примечательные химические вещества включают афидиколин, ингибитор полимеразы альфа, для остановки в фазе G1; колхицин и нокодазол, которые препятствуют формированию веретена деления, останавливая клетки в фазе M; и, наконец, терминатор цепи ДНК 5-фтордезоксиридин для инициации остановки в фазе S ^7-9. Обработка этими химическими веществами является эффективным способом синхронизации всей популяции клеток на определенной фазе. После удаления химического вещества клетки единоновременно возвращаются в клеточный цикл. Введение исследуемого агента после высвобождения из блокирующего химического вещества гарантирует, что вызванный ответ на препарат получен от однородной популяции клеток, находящихся на определенной стадии клеточного цикла. Однако, поскольку многие химические синхронизаторы являются известными генотоксическими соединениями, сложно разделить участие различных путей ответа (на синхронизаторы в сравнении с исследуемыми агентами).

В данной работе мы описываем метод метаболического мечения для отслеживания субпопуляции активно делящихся клеток на всех этапах: от фазы репликации ДНК до деления и разделения дочерних клеток. В сочетании с количественным анализом методом проточной цитометрии данный протокол позволяет измерять кинетику прохождения клеточного цикла в отсутствие механического или химического стресса, который обычно сопровождает другие методы синхронизации клеточного цикла ¹⁰. В следующих разделах мы обсудим методологию, а также некоторые возможности ее применения в биомедицинских исследованиях.

Протокол

1. Сотовые подготовка

1. Пластина клетки для достижения плотности примерно на 60% слияния. Клетки должны быть в логарифмической фазе во время сбора. Для MCF7 клеток, это достигается путем посева на 5 х 10 ⁵ клеток / 10 см пластины в соответствующих средствах массовой информации. HT29 и LS180 клетки высевают на 6 х 10 ⁵ клеток / 6 см тарелку. Мы использовали средства массовой информации DMEM с добавлением 10% FBS и 1 пенициллина / стрептомицина. Будьте уверены, чтобы семена пластины для правильного положительного и отрицательного контроля вдополнение к вашей образцах. Они включают в себя следующее:

я	положительный контроль	BrdU только
II	положительный контроль	П.И. только
III	Отрицательный контроль	BrdU негативный, П. отрицательный

(Следует отметить, что предварительный эксперимент с несколькими моменты времени такой как указано в этом протоколе может быть использована, чтобы сузить временные рамки, в течение которых осуществляют будущей коллекции.)

2. Покрытие клетки инкубировали при 37 ° C, 5% СО ₂ в течение 24-48 ч, что позволяет клеткам восстановиться и присоединить.
3. Для импульсной метки клеток бромдезоксиуридин (BrdU), DMEM заменяется шм свежей среде, содержащей 10 мкМ BrdU. Клетки инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C, 5% CO _2, чтобы обеспечить включение BrdU в ДНК. Обязательно оставьте одну пластину необработанной в качестве отрицательного контроля.
4. Импульс маркировки СМИ удаляется, а клетки промываются кратко 1X PBS.
5. Свежий медиа роста добавил (минус BrdU) и клетки могут продолжать инкубацию при 37 ° C, 5% СО ₂ до соответствующего timepoint для сбора урожая не будет достигнуто.

2. Сбор и фиксация

1. Необработанных клетках, начиная с шага 1.3 считается нулевым timepoint. Этот пример может быть собрано вместе с 1 ч. timepoint которые собираются сразу после лечения BrdU.
2. Для уборки клетки, средства массовой информации удаляется, а пластины промывают один раз 1X PBS.
3. Клетки трипсином, собранные в культивировании СМИ, а затем осаждали центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин Супаernatant отбрасывается.
4. Промыть 1-10 х 10 ⁶ клеток в 5 мл ледяной 1X PBS. Центрифуга на 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин супернатант удаляется.
5. Осадок клеток затем ресуспендировали в 100 мкл ледяной PBS / 1% FBS. Добавление 1% FBS в PBS средства для предотвращения слипания клетки.
6. Добавить эти клетки по капле на 5 мл -20 ° C, 70% этанолом, чтобы исправить клеток.
7. Инкубировать на льду в течение 30 мин или хранить при 4 ° С в течение ночи. Это идеальный шаг, на котором заканчивается сбор образцов из различных моменты времени. Образцы можно оставить в этаноле в течение нескольких дней, что позволяет им обрабатывать одновременно через оставшуюся часть протокола.

3. BrdU и PI Окрашивание

1. Гранул клеток путем центрифугирования в течение 5 мин со скоростью 1500 оборотов в минуту.
2. Снимите фиксатор, но оставить ~ 50 мкл, в котором, чтобы ослабить осадок на вортексе.
3. Для денатурации ДНК, медленно добавляют 1 мл 2N HCl / Triton X-100по каплям при встряхивая. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Гранул клеток путем центрифугирования образцов в течение 5 мин со скоростью 1500 оборотов в минуту. Аспирируйте и отказаться от супернатант.
5. Ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл 0,1 М тетраборат натрия, рН 8,5, для нейтрализации денатурации шаг.
6. Центрифуга клеток в течение 5 мин со скоростью 1500 оборотов в минуту. Аспирируйте и отказаться от супернатант.
7. Ресуспендируйте осадок клеток в 75 мкл Смесь для окрашивания BrdU (50 мкл 0,5% Твин-20/1% BSA / PBS + 20 мкл FITC сопряженных анти-BrdU + 5 мкл 10 мг / мл РНКазы).
8. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут защищенном от света месте.
9. Чтобы шарик клеток, центрифуги образцов в течение 5 мин со скоростью 1500 оборотов в минуту. Аспирируйте и отказаться от супернатант.
10. Ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл PBS, содержащий 5 мкг / мл пропидия йодида.

4. Проточной цитометрии

1. Для анализа клеток, проточной цитометрии оснащен лазерным 488 нм исоответствующие фильтры необходимо. Анализ программного обеспечения, таких как CellQuest необходимо создать участки описаны ниже.
2. При выполнении пробы через проточной цитометрии, создать вперед рассеяния (SSC-H) в зависимости от стороны рассеяния (FSC-Н) для обеспечения правильного распределения размеров клеток (рис. 1А). Оба эти параметры приведены в линейном масштабе.
3. Одновременный просмотр участка FL3-H (PI пятна) по сравнению с FL2-W (рис. 1б). Этот участок используется для создания ворота (R3) выделить долю клеток, которые находятся в пределах нормального распределения клеточного цикла. В общем, эта картина распределения характеризуется двумя скопления клеток из 2N и 4N содержание ДНК П.И. окрашивания представляет G1 и G2 фазах клеточного цикла, соответственно. Строка клеток, расположенных между этими 2 кластерами представитель текущей репликации ДНК, что происходит в фазу S клеточного цикла.
4. Создать сюжет displayiнг закрытых ячеек (R3) с шагом 4.3, с FL1-H (FITC, журнал участка) по оси ординат и PI (линейный участок) на оси абсцисс (рис. 1в). Этот участок будет использоваться для установки остальных параметров использования различных элементов управления, изложенные в 1.1, а также для сбора данных для анализа.
5. Поместите PI только окрашенных образцов на цитометра. Регулировка усиления разместить G1 на ~ 200 на оси абсцисс. Это будет легче представить себе в виде гистограммы сюжет PI пятно.
6. Второй элемент управления включает в себя запуск BrdU только образец на проточной цитометрии. Регулировка усиления, так что 2 популяций клеток (BrdU положительные против BrdU отрицательный) появятся на участке. В идеале, BrdU негативные клетки расположены появляться чуть ниже 10 ^-1.
7. Окончательный контроль BrdU / PI отрицательный пример. Запустите этот отрицательный контроль, чтобы клетки не появляются ни в одном из верхней или правой стороны квадранта.
8. После того, параметры различных участках были установлены,проточной цитометрии откалиброван и готов к обработке BrdU и PI окрашенных клеток. Не менее 10000 клеток, которые закрытого в правильном часть PI (см. шаг 4.3) следует читать в коллекции.
9. Для анализа собранных данных, программное обеспечение, такое как FlowJo или FacsDiva используются. Каждый из вышеупомянутых участков могут быть воссозданы в этих программах, а также количественные и статистический анализ выполняется.
10. Конечная точка анализа включает в себя несколько последовательных шагов. Создание участка FITC против PI с ячейками закрытого в качестве ИП положительного от участка PI против FL2-W позволяет различать велосипедные населения. Вторые ворота создается из этого участка, выделяя положительные BrdU населения. Выражая это отличительная населения на гистограмме участка с ИП на оси абсцисс позволяет отслеживать время ход клеточного цикла. Это может быть дополнительно визуализируются построения число BrdU-положительных клеток в G1 или G2 содержание в зависимости от времени.

5. Представитель Результаты

Обычно велосипедные клеток, окрашенных йодистым пропидия имеют разные пики на G1 и G2, соответствующие клетки, содержащие 2N и 4N содержание ДНК, соответственно (рис. 2). Импульсный маркировки с BrdU позволяет избирательный маркировки субпопуляции клеток, активно синтезирующие ДНК (фаза, т.е. S). Вскоре после удаления реагента BrdU, все меченых клеток в S фазе (рис. 3). Ограничивая маркировки на короткий импульс человек способен следовать этому в настоящее время отдельные субпопуляции клеток по всему многочисленные моменты времени, когда они проходят через последующие этапы клеточного цикла. Это могут быть визуализированы в 1 час времени точка на рисунке 3, явный недостаток G1 и G2 пиков.

Дополнительная информация может быть получена из шаг маркировки BrdU. Мало того, что доля активно делящиеся клетки измеряется, но ЭСТimate клеточного цикла стадии распределения между двумя образцами можно определить, как хорошо. Собирая клеток одинаково промежутки времени после удаления реагента BrdU, клетки можно проследить, как они продолжают цикл, прогресс в G2 и, наконец, двигаться до клеточного деления исходной клетки, в конце концов превращается в BrdU-положительных дочерние клетки с G1 Содержание ДНК (рис. 4). Например клеточного цикла количественного этапа и кинетический анализ осуществляется на рисунке 5.

Рисунок 1. (A) вперед по сравнению с Scatter участок бокового рассеяния представителя MCF7 клеточной популяции. (B) PI по сравнению Ширина (FL-W) земельный представитель MCF7 клеточной популяции. Память показана для исключения дубликатов клетки в конечном счете (R3). Сотовые дублетов будет иметь больший импульс, чем ширина одной ячейки, так как они дольше проходить через лазерный луч и therefруды могут быть исключены из анализа. (C) PI по сравнению с FITC (BrdU) земельный представитель MCF7 клеточной популяции. Память показано, включают в себя только FITC (BrdU) положительных клеток (R4).

Рисунок 2. Представителю гистограмма участок общей численности населения обычно велосипеде клеток.

Рисунок 3. Гистограмма участок клетки, которые были собраны 1 час после удаления BrdU импульса, после стробирования для FITC (BrdU)-положительных клеток. BrdU-положительных клеток на ранней timepoint после удаления этикетки показать PI профилями, которые соответствуют образцы отображения содержания ДНК в соответствии с клетками, которые находятся в S-фазе клеточного цикла, подтверждающий успешное маркировки клеток только в синтезе ДНК.

л = "Рисунок 4" />
Рисунок 4. Сравнение клеточного цикла между кинетики раковых клеток линий колоректального рака HT29 (А) и LS180 (B), а также рак молочной железы MCF7 (C). Клетки собирали каждый час в течение 8 часов, после удаления BrdU импульса. В этом эксперименте мы наблюдали четкий профиль ускорения прогрессии клеточного цикла через G2 фазе клеточного цикла в толстой LS180 клеточной линии. Сравнение кинетики между двумя профилями клеток колоректального рака, возникновение пика G1 бросается в глаза при Т = 4 часа после BrdU в LS180 клеток, по сравнению с соответствующим моменту времени для HT-29 клеточная линия которой не хватает этого пика. По сравнению с любой из двух клеточных линий колоректального, MCF7 клетки велосипеде по значительно сниженной ставке. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

RE 5 "/>
Рисунок 5. (А) Количественные клеточного цикла фаза анализа BrdU-меченых клеток рака. Дин / Джетта / Fox алгоритм был применен к HT29, LS180 и MCF7 (показано зеленым цветом). В результате клеточного цикла фазовых распределений из каждого образца выражается в% от общего BrdU-положительных клеток на каждом этапе. Только выбора момента времени для каждой ячейки строки отображается, так как анализы для некоторых более ранних моментов времени производится недействительными результаты. В эти ранние моменты времени, все BrdU-положительных клеток в S-фазе и, следовательно, не имеют различных G1 и G2, пики, которые необходимы для применения алгоритма. (B) Гистограммы раковых клеток показывает кинетики движения через G2 / M фазах клеточного цикла. Прогресс через G2 / M фазах быстрым для LS180 клетки, а затем и HT29 MCF7. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

JPG "ALT =" Рисунок S1 "/>
Рисунок S1. Контроля проточной цитометрии. MCF7 клеток показано, как (А) отрицательный контроль, когда клетки не являются ни ИП, ни BrdU окрашенные. (B) PI только окрашивают. (C) BrdU-FITC помечены образцы.

Рисунок S2. Схематическое изображение, показывающие связь между флуоресцентной спектр излучения ИП по сравнению с FITC (BrdU). Спектрального окна коллекции для люминесцентных канала 1 (FL1 для FITC) и флуоресцентные канала 3 (FL3 для PI) приведены в соответствующих полях. Существует не флуорофора перекрытия спектров между FL1 и FL3 обнаружения. Очевидно, что флуоресценция компенсация не нужна, когда экспериментальные данные PI и FITC-BrdU со-меченых клеток собираются в FL1/FL3 каналов соответственно. Флуоресцентные спектры были получены с сайта BD Biosciences:целевых = "_blank"> http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Обсуждение

Объединив проточной цитометрии с включением BrdU, у нас есть необходимые инструменты для изучения кинетики клеточного цикла. Отличительной особенностью BrdU функционировать как аналог тимидина то, что позволяет для содержания ДНК количественное велосипедные клетки. Включение BrdU в растущую нить ДНК дочери в процессе синтеза фазе клеточного цикла, что позволяет следить субпопуляции клеток езда на велосипеде через репликацию ДНК в фазе S, в период роста на G2 и в конечном итоге деления клеток . Дочь BrdU-положительных кл...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагент	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
бромдезоксиуридин	Becton Dickinson	55089
пропидия йодид	Сигма	287075	1mg/ml акции
FITC анти-BrdU	Becton Dickinson	347583
тетрабората натрия	Рыбак	S80172	0,1 М, рН 8,5
FACS Caliber	Becton Dickinson