Бисульфит мутагенеза является золотым стандартом для анализа метилирования ДНК. Наш модифицированный протокол позволяет для анализа ДНК метилирования на уровне одной клетки и была специально разработана для отдельных яйцеклеток. Она также может быть использован для расщепления стадии эмбриона.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одноместный мутагенеза бисульфит ооцитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эпигенетика охватывает все наследуемые и обратимые модификации хроматина, которые изменяют доступность генов и, таким образом, являются основными механизмами регуляции транскрипции генов1. Метилирование ДНК представляет собой эпигенетическую модификацию, которая действует преимущественно как репрессивная метка. Посредством ковалентного присоединения метильной группы к цитозинам в CpG-динуклеотидах она может привлекать дополнительные репрессивные белки и модификации гистонов для запуска процессов, участвующих в конденсации хроматина и сайленсинге генов2. Метилирование ДНК необходимо для нормального развития, так как оно играет критическую роль в программе развития, дифференцировке клеток, репрессии ретровирусных элементов, инактивации X-хромосомы и геномном импринтинге.
Одним из наиболее эффективных методов анализа метилирования ДНК является бисульфитный мутагенез. Бисульфит натрия представляет собой мутаген ДНК, который дезаминирует цитозины в урацилы. После ПЦР-амплификации и секвенирования эти события конверсии определяются как тимины. Метилированные цитозины защищены от дезаминирования и, следовательно, остаются цитозинами, что позволяет идентифицировать метилирование ДНК на уровне отдельных нуклеотидов3. Разработка анализа методом бисульфитного мутагенеза прошла путь от первоначально описанных протоколов4-6 к более чувствительным и воспроизводимым методам7. Одним из ключевых достижений стало помещение небольших количеств ДНК в агарозную бусину, что защищает ДНК от жесткого воздействия бисульфита8. Это позволило проводить анализ метилирования в пулах ооцитов и эмбрионов на стадии бластоцисты9. Самый совершенный на сегодняшний день протокол бисульфитного мутагенеза предназначен для отдельных эмбрионов на стадии бластоцисты10. Однако, поскольку бластоцисты содержат в среднем 64 клетки (содержащие 120-720 pg геномной ДНК), этот метод неэффективен для изучения метилирования в отдельных ооцитах или эмбрионах на стадии дробления.
Опираясь на опыт встраивания малых количеств ДНК, в том числе из ооцитов, в агарозный гель11, мы представляем метод, при котором ооциты напрямую заключаются в бусину из агарозы и лизирующего раствора сразу после их извлечения и удаления блестящей оболочки (zona pellucida). Это позволяет нам преодолеть две основные проблемы бисульфитного мутагенеза единичного ооцита: защиту крайне малого количества ДНК от деградации и последующую потерю материала на многочисленных этапах протокола. Важно, что поскольку данные получаются из одиночных ооцитов, исключается проблема систематической ошибки ПЦР при работе с пулами клеток. Кроме того, данный метод позволяет обнаружить непреднамеренное загрязнение клетками кумулюса, так как любой образец с более чем одним паттерном метилирования может быть исключен из анализа12. Данный протокол представляет собой усовершенствованный метод успешного и воспроизводимого анализа метилирования ДНК на уровне одной клетки и идеально подходит как для отдельных ооцитов, так и для эмбрионов на стадии дробления.
Протокол
День 1
Подготовьте следующие решения свежий в день яйцеклетки коллекции стерильной дистиллированной воды, таких как вода GIBCO. Чтобы снизить вероятность загрязнения ДНК, изменить перчатки часто и использовать фильтр советы. Хранить трубы под углом же, когда открыты, и резюмировать все трубы, когда они не используются. Мы рекомендуем, что решения принимаются, как N +1.
3% агарозном LMP
30 мг низкую температуру плавления (LMP) агарозном
до 1 мл GIBCO H 2 O
растворяют при 70 ° C
Лизис решения
8 мкл буфера для л....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это один анализ ооцитов содержит много шагов, число которые имеют решающее значение и требуют особого ухода. Первый яйцеклетки стирки. Это особенно важно мыть каждую яйцеклетку несколько раз в свежей среде падает после гиалуронидазы лечение, чтобы удалить как многие клетки кучевые насколько это возможно. Кроме того, при передаче ооцитов к решению кислой Тирода для удаления зона pellucida убедиться, окружающая среда ясно клеток кумулюса. Ооцитов очень липкая после удаления зона, и любые окружающие клетки кучевые могут ле.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана в Университете Западного Онтарио, кафедра акушерства и гинекологии, а также грант ER06-02-188 от исследований и инноваций Ministryof, ранний премии научный сотрудник. MMD была поддержана Программой CIHR Обучение в репродукции, раннему развитию и воздействие на здоровье (REDIH) Высшее стипендии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Таблица специфических реагентов и оборудования.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| Коллекция ооцитов | |||
| Гиалуронидаза | Сигма | H4272 | |
| Кислотные Тироде | Сигма | T1788 | |
| Протеиназы K | Сигма | P5568 | |
| 10% Igepal | Bioshop | NON999.500 | |
| Лизис решения | |||
| Трис, рН 7,5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Сигма | L9650 | И яBSP; |
| EDTA рН 8,0 | Сигма | E5134 | |
| КРЫШКИ | Bioshop | LDS701.10 | |
| DVB-T | Invitrogen | P2325 | |
| SDS буфере для лизиса | |||
| ТЕ рН 7,5 | Bioshop (Трис) Sigma (ЭДТА) | TRS001.5 E5134 | |
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Бисульфит преобразования | |||
| Едкий натр | Сигма | S8045 | |
| Натрий Hydrogensulfite (бисульфит натрия) | Сигма | 243973 | ; |
| Гидрохинон | Сигма | H9003 | |
| Низкую температуру плавления (LMP) агарозном | Сигма | A9414 | |
| Минеральное масло | Сигма | M8410 | |
| М2 среднего | Сигма | M7167 | |
| GIBCO дистиллированная вода | Invitrogen | 15230-196 | |
| Автоклавного бидистиллированной (день) воды | |||
| ПЦР | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 нг / мл дрожжевой тРНК | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Зеленый Реакция GoTaq буфер | Замега | M7911 | |
| Внутренняя и внешняя вложенных грунтовки | Сигма | ||
| Перевязка | |||
| Promega pGEM-T Easy векторного | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Компетентные клетки E.coli | Zymo исследований корпорации | T3009 | |
| Оборудование | |||
| Препаровальная лупа | |||
| 70 ° C и 90 ° C тепла блоки | |||
| 37 ° C и 50 ° C Waterbaths (42 ° C для преобразования) | |||
| Рокер | |||
| ПЦР машины |
Ссылки
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic bio....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
