Мы описываем прототип способ получения микроскопом покровные покрыта флуоресцентной желатина для визуализации invadopodia-опосредованной деградации матрице. Вычислительные методы с использованием доступного программного обеспечения представлены для количественного определения результирующего уровня матрицы протеолиза одной клетки в смешанной популяции и для многоклеточных группы охватывает весь микроскопических полей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественное измерение Invadopodia-опосредованного протеолиза внеклеточной матрицы в одно-и многоклеточных контексты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сотовый вторжения в местных тканей является важным процессом в развитии и гомеостаза. Malregulated вторжения и последующего движения клетки характерно несколько патологических процессов, в том числе воспаление, сердечно-сосудистые заболевания и метастазов опухолевых клеток 1. Сосредоточен деградации протеолитическими внеклеточного матрикса (ECM) компонентов в эпителиальной или эндотелиальной базальной мембраны является важным шагом в налаживании сотовой вторжения. В опухолевых клетках, обширный анализ в лабораторных установила, что ECM деградации осуществляется вентральной актина богатых мембранных структур называют выступающими invadopodia 2,3. Invadopodia форме в тесном прикладывание к ECM, где они отвечают ECM пробоя под действием матриксных металлопротеиназ (ММП). Способность опухолевых клеток с образованием invadopodia прямо коррелирует со способностью вторгаться в местные стромы и связанные с ними сосудистые компоненты 3. _content "> Визуализация invadopodia ECM-опосредованной деградации клеток с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием красителей-меченых белков матрицы наносится на стекло покровные стала наиболее распространенной техникой для оценки степени протеолиза матрицы и сотовые инвазивный потенциал 4,5. Здесь мы опишем версия стандартный метод генерации флуоресцентно-меченных покровные стекла с использованием коммерчески доступных Орегон Зеленый-488 желатином сопряжены. этот метод легко масштабируется быстро производить большое количество покрытием покровные. Покажем некоторые общие микроскопические артефакты, которые часто встречаются Во время этой процедуры и как их можно избежать. Наконец, мы опишем стандартные методы использования доступны компьютерные программы, чтобы количественное меченых желатин деградации матрицы опосредовано отдельных клеток и целых клеточных популяций. описанные процедуры дают возможность точно и воспроизводимо мониторинг invadopodiaдеятельности, а также может служить в качестве платформы для оценки эффективности модуляции экспрессии белка или тестирование по борьбе с инвазивными соединений на деградацию внеклеточных матриц в одно-и многоклеточных настройки.
Протокол
1. Производство Орегон Зеленый 488-желатин покрытием Покровные
- Подготовка немеченого 5% (м / м) акции желатина / раствор сахарозы путем добавления 1,25 г желатина и 1,25 г сахарозы в PBS до конечного объема 50 мл. Теплый склад желатиновый раствор до 37 ° С и убедитесь, что он полностью растаял перед использованием. Хранить конечной смеси при температуре 4 ° C.
- Очистите диаметром 13 мм № 1 покровные стекла, создав отдельные покровное в каждую лунку 24-луночных пластиковых пластин культуре ткани. Добавить 500 мкл 20%-ной азотной кислоты в каждую лунку и инкубировать в течение 30 мин. Аспирируйте раствора азотной кислоты и вымыть покровные три раза ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Способность визуализировать клетки унижающие внеклеточного матрикса помог в раскрытии молекулярных механизмов, занятых в ранних стадиях клеточного вторжения. Pioneered Вэнь-тянь Chen в начале 1980-х годов 4,14,15, покрытием флуоресцентно меченых белков внеклеточного на стекло покровные для последующего микроскопического анализа появился в качестве основного метода в оценке invadopodia функции в широком диапазоне типов клеток. Предписанных протоколом демонстрирует основной метод, используемый для подготовки же.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана благотворительные фонды из Университета Западной Вирджинии Мария Babb Randolph онкологический центр. Мы благодарим Susette Мюллер (Georgetown University) и Лора Келли для ранней консультации и помощь. Использование West Virginia University фонда изображений микроскопии (при поддержке Марии Babb Randolph онкологический центр и, NIH гранты RR16440 P20, P30 и P30 RR032138 GM103488) с благодарностью.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название Реагенты / Инструмент | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| желатин | Сигма | G1890 | Свиной кожи |
| сахарозы | Рыбак | BP220 | |
| 12 мм покровные | Рыбак | 50-121-5159 | |
| 24-луночные планшеты | Рыбак | 08-772-1 | BD Falcon |
| азотнокислый | Рикка | R5326000 | 20% раствор |
| поли-L-лизин | Электрон наук микроскопии | 19320-B | 0,1% раствор |
| глутаральдегида | Сигма | G7526 | 8% раствор |
| Орегон Зеленый 488-сопряженных желатина | Invitrogen | G-13186 | |
| натрийборгидрида | Сигма | 213462 | |
| Triton X-100 | Рыбак | BP151 | |
| родамина-фаллоидином | Invitrogen | R415 | |
| анти-cortactin (клон 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-Flag антитела | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 козьего анти-IgG мыши | Invitrogen | A21235 | |
| Продлить Золотой antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 конфокальный микроскоп | Zeiss | ||
| ImageJ программного обеспечения | Всеобщее достояние | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 программного обеспечения | Медиа кибернетики | ||
| NIS Elements программного обеспечения | Nikon |
Ссылки
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
