Nanotopology клеточной адгезии по переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM)

Summary

Топология адгезии клеток на подложке измеряется с нанометровой точностью переменным углом полного внутреннего отражения флуоресценции микроскопии (VA-TIRFM).

Abstract

Топологию поверхности, например, клеток, растущих на подложке, определяется с нанометровой точностью переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM). Клетки культивируются на прозрачных слайдов и инкубировали с флуоресцентным маркером равномерно распределены в их плазматической мембраны. Освещение происходит путем параллельного пучка лазера при переменным углом полного внутреннего отражения (ПВО) с различной глубиной проникновения затухающих электромагнитных полей. Запись флуоресцентных изображений при облучении около 10 различных углов позволяет рассчитывать клетки с субстратом расстояния с точностью до нескольких нанометров. Различия адгезии между различными клеточными линиями, например, раковых клеток и менее злокачественных клеток, таким образом, определена. Кроме того, возможны изменения клеточной адгезии при химическом или фотодинамической терапии могут быть рассмотрены. По сравнению с другими методами супер-разрешение воздействия световой микроскопии сохраняетсяочень маленький, и без повреждения живых клеток, как ожидается, произойдет.

Introduction

Когда луч света, распространяющегося через среду с показателем преломления п ₁ соответствует интерфейс для второй среде с показателем преломления п ₂ 1, полное внутреннее отражение происходит на всех углах падения Θ, которая больше, чем критический угол Θ _с = агсзш (N ₂ / N _1). Несмотря на полное отражение падающего света вызывает затухающих электромагнитных полей, который проникает во вторую среду и убывает экспоненциально с перпендикулярной расстоянии г от интерфейса в соответствии с I (г) = I ^{_{0-эз / D (Θ).}} Я (г) соответствует интенсивности электромагнитного поля и D (Θ) с гл....

Protocol

1. Посев и инкубация клеток

1. Семенной отдельных клеток, например, U373-MG или U-251-MG клетки глиобластомы при типичной плотностью 100 клеток / мм ² на предметное стекло и выращивать их для 4872 часов в культуральной среде (например, RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков), используя инкубаторе при температуре 37 ° C и 5% CO _2.
2. Инкубируйте клетки с мембраной маркер, например, 6-додеканоил-2-диметиламино нафталина (лаурдана) применяется в течение 60 мин при концентрации 8 мкм (в культуральной среде) ^4, или цитоплазме маркер, например, кальцеин ....

Discussion

Описан метод измерения клетки с субстратом расстояния с нанометровой точностью. В настоящее время методы супер-разрешение микроскопа, например, на основе структурированной подсветки ⁷ или на одну молекулу обнаружения ^8-10, а также вынужденное излучение истощения (STED) микроскопии ¹¹ представляют значительный интерес. Ни один из этих методов, однако, допускает осевое разрешение ниже 50 нм. Кроме того, достаточно высокая освещенность 50100 Вт / см ² необходимо для един.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Тип	Комментарии
Инкубатор	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Ламинарный поток	Holten безопасной	S2010 1,2 EN GG 1LN
DMEM + 10% FCS + 1% пенициллина / стрептомицина	Biochrom		Выращивание среднего
Предметные стекла объекта	Marienfeld	Чистый белый стекло	Специальная процедура очистки использовали
6-додеканоил-2-диметиламино нафталина (лаурдана)	Молекулярные зонды		Флуоресцентные метки (раствор: 2 мм в этаноле)
Микроскоп	Carl Zeiss	Axioplan 1
Лазерный диод	PicoQuant	ЛДГ 400 с драйвером PDL 800-B	Длина волны: 391 нм
Единая система одномодового оптоволокна	Точечный источник	kineFlex	Используется с коллимирующей оптикой
EMCCD камеры	Андор	DV887DC	Вернуться освещенной камере