Nanotopology клеточной адгезии по переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM)

Summary

Топология адгезии клеток на подложке измеряется с нанометровой точностью переменным углом полного внутреннего отражения флуоресценции микроскопии (VA-TIRFM).

Abstract

Топологию поверхности, например, клеток, растущих на подложке, определяется с нанометровой точностью переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM). Клетки культивируются на прозрачных слайдов и инкубировали с флуоресцентным маркером равномерно распределены в их плазматической мембраны. Освещение происходит путем параллельного пучка лазера при переменным углом полного внутреннего отражения (ПВО) с различной глубиной проникновения затухающих электромагнитных полей. Запись флуоресцентных изображений при облучении около 10 различных углов позволяет рассчитывать клетки с субстратом расстояния с точностью до нескольких нанометров. Различия адгезии между различными клеточными линиями, например, раковых клеток и менее злокачественных клеток, таким образом, определена. Кроме того, возможны изменения клеточной адгезии при химическом или фотодинамической терапии могут быть рассмотрены. По сравнению с другими методами супер-разрешение воздействия световой микроскопии сохраняетсяочень маленький, и без повреждения живых клеток, как ожидается, произойдет.

Introduction

Когда луч света, распространяющегося через среду с показателем преломления п ₁ соответствует интерфейс для второй среде с показателем преломления п ₂ 1, полное внутреннее отражение происходит на всех углах падения Θ, которая больше, чем критический угол Θ _с = агсзш (N ₂ / N _1). Несмотря на полное отражение падающего света вызывает затухающих электромагнитных полей, который проникает во вторую среду и убывает экспоненциально с перпендикулярной расстоянии г от интерфейса в соответствии с I (г) = I ^{_{0-эз / D (Θ).}} Я (г) соответствует интенсивности электромагнитного поля и D (Θ) с глубиной проникновения на длине волны λ, определяемый

D (Θ) = (λ/4π) (п ₁ ² грехов ² Θ - N _{² 2)} ^{-1 / 2}

Как сообщалось в литературе, ^1,2, I ₀ соответствует интенсивности падающего света I _{электронной} умножается на коэффициент пропускания T (Θ) и соотношение N ₂ / N _1. Если вектор напряженности электрического поля этой световой луч поляризован перпендикулярно плоскости падения (т.е. плоскости, натянутой на падающий и отраженный луч), этот коэффициент передачи определяется

T (Θ) = 4 соз ² Θ / [1 - (N ₂ / NL ₁₎ ^2]

Для обнаружены интенсивности флуоресценции в TIRFM измерений, поглощение света должно быть интегрировано над всеми слоями образца и умножается на квантовый выход флуоресценции η соответствующих красителей, а также с твердым угол обнаружения Ω. Как сообщалось ранее ^3, эта интенсивность может быть описан

Я _F (Θ) = AT (Θ) ° С (г) ^{е-Z / D (Θ)} йг

если все факторы, которые не зависят F ROM от угла падения Θ и координаты г, включены в экспериментальную постоянной Уравнение A. 3 может быть решена аналитически, если концентрация с (г) флуорофоров они считаются почти постоянной

- Либо вообще координат г ≥ Δ, например, в цитоплазме клетки, имеющие расстояние Δ от интерфейса. В этом случае интеграл должен быть рассчитана г = Δ для г = ∞ в результате

I _F = C T (Θ) D (Θ) ^{E-Δ / D (Θ)}

- Или между г = Δ - т / 2 и Z = Δ + т / 2, т. е. в тонком слое толщиной т, например, клеточные мембраны расположены на расстоянии Δ от интерфейса. В этом случае интенсивность флуоресценции может быть рассчитана как

I _F = C T (Θ) ^{тэ-Δ / D (Θ),}

Если Т мала по сравнению с Δ.

ENT "> Из уравнений (4) и (5) клетки с субстратом расстояния Δ может быть рассчитана, если изображение интенсивности флуоресценции I _F записываются для переменными углами Θ, а если п (I _F / T г) (уравнение 4) или п (I _F / T) (формула 5) вычисляется как функция 1 / сут в течение этих углов. Для мембранных маркеров лаурдана используемые в этой статье (ст. ниже) оценка была выполнена в соответствии с формулой. 5.

Как сообщалось ранее ^3, получения изображений и оценки требуется
- Равномерное распределение света возбуждения по образцу,
- Срок действия 2-х слойной модели (с показателями преломления N ₁ и N ₂ к подложке и цитоплазмы, соответственно). Это справедливо, если плазма мембрана очень тонкая, и если слой внеклеточной среде (между клеткой и подложкой) мала по сравнению с длиной волны падающего света.

Кроме того, умеренное числовой апертурой(Обычно ≤ 0,90) от объектива микроскопа выгодно, чтобы избежать отклонения яркости из-за анизотропии излучения в ближнем поле диэлектрик.

Protocol

1. Посев и инкубация клеток

1. Семенной отдельных клеток, например, U373-MG или U-251-MG клетки глиобластомы при типичной плотностью 100 клеток / мм ² на предметное стекло и выращивать их для 4872 часов в культуральной среде (например, RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков), используя инкубаторе при температуре 37 ° C и 5% CO _2.
2. Инкубируйте клетки с мембраной маркер, например, 6-додеканоил-2-диметиламино нафталина (лаурдана) применяется в течение 60 мин при концентрации 8 мкм (в культуральной среде) ^4, или цитоплазме маркер, например, кальцеин acetomethlyester применяется в течение 40 мин при концентрации 5 мкМ ^3, или мембраны связаны фотосенсибилизатора, например протопорфирина IX индуцированных на 4 ч инкубации с его предшественник 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК; 1 мМ) ^4,5.
3. Вымойте клеток с культуральной среды или фосфатным буферным раствором (PBS) до флуоресцентной микроскопии.

2. VA-TIRFM

1. Используйте прямой микроскоп, например, Zeiss Axioplan, и заменить его конденсатора освещения устройство, как описано в работе. 3 с полусферической или полу-цилиндрической стеклянной призмы оптически связанных с объектом слайда (см. Рисунок 1).
2. Используйте параллельные коллимированный лазерный луч, который после съемки в стеклянной призмы и дальнейшего оптических компонентов (например, вогнутое зеркало) снова приводит к параллельным пучком на поверхности образца (телецентрической лучей ученика). Позаботьтесь о том, вектора электрического поля поляризован перпендикулярно плоскости падения.
3. Используйте регулируемые зеркала, расположенного внутри конденсатора, который изображается в плоскости образца и освещает образец под переменным углом падения (объект луч). Регулируемые зеркала может быть вызвано шаговых двигателей, где каждая позиция соответствует и определенный угол падения, как это определено угломерных измерений ³
4. Калибровка углового положения регулируемые зеркала помощью критического угла Θ _с = 61,3 ° на стакан воды переходу в виде фиксированного значения. _С Θ могут быть визуализированы при изменении Θ, когда флуоресцентного красителя (например, 1 мМ флавинмононуклеотид, FMN) растворяется в воде. Положение зеркала на Θ = Θ _с хранится в программе позиционирования зеркала.
5. Установите параметры камеры (задней подсветкой Андор IXON EMCCD, DV887DC, ANDOR технологии, Belfast, UK ^6), в том числе температуры, усиление, время записи и сдвига скорости.
6. Используйте объектив соответствующего увеличения и преимущественно умеренный числовой апертурой (например, 40 × / 0,75 или 63 × / 0,90 погружения в воду) и локализовать объект слайда в микроскоп. Использование иммерсионного масла для обеспечения оптического контакта образца с стеклянной призмы. Запись флуоресцентных изображений идентичных образцов при измененииУгол освещения (Θ ≥ Θ Θ _с с _с соответствующей до 64,5 ° для клетки-стекло). Угловом диапазоне 66 ° -74 ° с шагом 0,5 ° или 1 ° рекомендуется. Используйте соответствующий длинный пас или фильтр полосы пропускания для флуоресцентной детекции.

3. Анализ данных

1. Читайте изображения (например, в формате ASCII), записанные под разными углами Θ, а также настройки камеры (для фона дискриминации), длина волны возбуждения и показатели преломления для стекла (п ₁ = 1,52) и клеток (N ₂ = 1.37) в оценке программы (LabView; NanoCell). Для каждого набора параметров глубины проникновения D (Θ) и коэффициента пропускания T (Θ) рассчитываются автоматически.
2. Выберите изображений, используемых для оценки клеточного субстрата расстояния Δ по формуле 5 (мембрана маркером) или уравнение 4 (цитоплазма маркер), отдельные изображения с неоднороднымосвещение (выявление д, ж. полосы) могут быть исключены.
3. Рассчитать изображения клетки с субстратом топологии и выберите соответствующий цветовой код для отображения. Во время оценки профилей отдельные пиксели могут быть показаны, как показано на рисунке 2. Эти профили могут быть использованы в качестве индикатора качества подгонки.
4. Хранить оценке протокол.

4. Представитель Результаты

Представитель эксперименты проводятся с генетически модифицированным U251-MG клеток глиобластомы любезно предоставлены профессором янв Mollenhauer, кафедра молекулярной онкологии, Университет Южной Дании, Оденсе. В двух субклонами тех U251 клетки генов-супрессоров опухолей TP53 или PTEN чрезмерно выражены с использованием Tet-On индуцибельной системы экспрессии, так что эти клетки обладают пониженной потенциальной онкогенных и может рассматриваться как менее злокачественные. Высоко злокачественных U251-MG клетки без ген-супрессор используются в качестве элементов управления и U251-MG клеток дикого типа служат для дальнейшего сравнения. Лазерный диод излучает почти непрерывный ряд пикосекундных импульсов (LDH400 с водителем PDL 800-B, Picoquant, Берлин, Германия; длина волны: 391 нм, энергия импульса: 12 PJ; частота повторения: 40 МГц) используются в качестве источника возбуждения.

На рисунке 3 TIRFM изображений U251-MG клеток глиобластомы с активированным TP53 супрессоров опухолей ген и инкубировали с лаурдана (8 мкМ, 60 мин) изображены на углах падения 66,0 °, 69,0 ° и 73,0 ° соответствующей глубины проникновения затухающих электромагнитных полей около 140 нм, 75 нм и 60 нм соответственно. С уменьшением флуоресценции глубина проникновения уменьшается в интенсивности (см. масштабах) и происходит от более поверхностных участках клеток (например, фокальных контактов по краям). Cell-подложка расстояния (визуализируется на рисунке 3d на цветовой код, начиная от 0-600 нм) сильно варьируют по ячейкам между нают несколько нанометров (бело-желтый) и 250-300 нм (темно-красный), т. е. фокальные контакты и больше клетки с субстратом расстояния находятся в непосредственной близости. То же самое касается U251-MG клеток глиобластомы с активированным геном PTEN супрессоров (рис. 4d), ​​в то время как клетки с субстратом расстояния, а для постоянных U251-MG контроля и клеток дикого типа с типичными значениями 80-100 нм (желтый, рисунок 4б ) и 150-200 нм (оранжево-красные; рис. 4а).

Рисунок 1. Освещение устройства для VA-TIRFM в вертикальном микроскопом. Регулируемые зеркала приводом от шагового двигателя позволяет угловое разрешение ± 0,25 °.

Рисунок 2. Оценка профиля для одной пикселейEL (схема). Когда Л. Н. [I _F / T (Θ)] строится как функция 1 / D (Θ), наклон представляет клетки с субстратом расстояние Δ. Этот склон обычно определяется с точностью около ± 10%. Одно значение - в результате неоднородного освещения - была отмечена и исключены из оценки.

Рисунок 3 TIRFM изображений U251-MG клетки глиобластомы с активированным TP53 ген-супрессор при инкубации с лаурдана (8 мкМ, 60 мин.) Записаны под разными углами освещения (переменного тока); клетки с субстратом расстояния в диапазоне 0-600 нм показали по цветовой код (г); длины волны возбуждения: 391 нм, обнаружение: ≥ 420 нм, размер изображения:. 210 мкм × 210 мкм Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 4 клетки с субстратом расстояния U251-MG glioblatoma клеток в диапазоне 0-600 нм показали цветового кода;. (А) дикого типа (б) контроля; (с) клеток с активированным геном TP53 супрессоров, (г) клеток с активированным геном PTEN супрессоров; длины волны возбуждения: 391 нм, обнаружение: ≥ 420 нм, размер изображения:. 210 мкм × 210 мкм Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Discussion

Описан метод измерения клетки с субстратом расстояния с нанометровой точностью. В настоящее время методы супер-разрешение микроскопа, например, на основе структурированной подсветки ⁷ или на одну молекулу обнаружения ^8-10, а также вынужденное излучение истощения (STED) микроскопии ¹¹ представляют значительный интерес. Ни один из этих методов, однако, допускает осевое разрешение ниже 50 нм. Кроме того, достаточно высокая освещенность 50100 Вт / см ² необходимо для един...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Тип	Комментарии
Инкубатор	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Ламинарный поток	Holten безопасной	S2010 1,2 EN GG 1LN
DMEM + 10% FCS + 1% пенициллина / стрептомицина	Biochrom		Выращивание среднего
Предметные стекла объекта	Marienfeld	Чистый белый стекло	Специальная процедура очистки использовали
6-додеканоил-2-диметиламино нафталина (лаурдана)	Молекулярные зонды		Флуоресцентные метки (раствор: 2 мм в этаноле)
Микроскоп	Carl Zeiss	Axioplan 1
Лазерный диод	PicoQuant	ЛДГ 400 с драйвером PDL 800-B	Длина волны: 391 нм
Единая система одномодового оптоволокна	Точечный источник	kineFlex	Используется с коллимирующей оптикой
EMCCD камеры	Андор	DV887DC	Вернуться освещенной камере