Улучшена визуализация метастазов в легких на одной резолюции сотовый у мышей, комбинированные В месте Перфузии легочной ткани и X-Gal Окрашивание LacZ-Меткой опухолевых клеток

Краткое содержание

Роман протокол сообщили в настоящем исследовании, позволяет избирательно обнаружения метастазов в легких в одной резолюции клетки у мышей, комбинированные На месте Перфузии легкого и фиксации и X-Gal окрашивание LacZ С метками опухолевых клеток.

Аннотация

Метастазирование является основной причиной смерти при большинстве типов рака и, следовательно, основным направлением исследований рака. Тем не менее, обнаружение микрометастазов с помощью радиологической визуализации и успех их терапевтической эрадикации остаются ограниченными.

Хотя животные модели оказались бесценными инструментами для исследования рака¹, мониторинг/визуализация микрометастазов остается проблемой, а неточная оценка распространения метастазов в доклинических исследованиях потенциально приводит к разочаровывающим результатам в клинических испытаниях². Следовательно, существует большой интерес к совершенствованию методов, чтобы наконец обеспечить воспроизводимое и надежное обнаружение метастазов вплоть до уровня одной клетки в нормальной ткани. Поэтому основное внимание уделяется методам, позволяющим обнаруживать опухолевые клетки in vivo, таким как микрокомпьютерная томография (микрокомпьютерная томография), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), биолюминесцентная или флуоресцентная визуализация^3,4. В настоящее время мы оптимизируем эти методы для мониторинга in vivo роста первичной опухоли и метастазирования в различных моделях остеосаркомы. Некоторые из этих методов также могут быть использованы для анализа метастазов ex vivo наряду с классическими методами, такими как qPCR⁵, FACS⁶ или различными типами гистологического окрашивания. В качестве эталона в настоящем исследовании мы установили стабильную трансфекцию или трансдукцию опухолевых клеток с геном lacZ, кодирующим бактериальный фермент β-галактозидазу, который метаболизирует хромогенный субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид (X-Gal) до нерастворимого красителя синего цвета^{индиго 7} и позволяет проводить высокочувствительное и селективное гистохимическое окрашивание в синий цвет опухолевых клеток в тканях мышей ex vivo вплоть до уровня одной ячейки, как показано здесь. Это недорогой и не требующий большого количества оборудования инструмент, который позволяет точно проверить метастазирование⁸ в исследованиях, оценивающих новые противоопухолевые методы лечения^9-11. Ограничивающим фактором окрашивания X-gal является низкий контраст, например, с красным окрашиванием хорошо васкуляризированных тканей, связанным с кровью. В легочной ткани эта проблема может быть решена с помощью перфузии легких in situ, метода, который был недавно разработан Борсигом и соавторами.¹², которые перфузировали легкие мышей под наркозом, чтобы очистить их от крови, а также зафиксировать и внедрить их in-situ под надуванием через трахею. Этот метод предотвращает также коллапс легкого и тем самым поддерживает морфологию функциональных альвеол легких, что улучшает качество ткани для гистологического анализа. В настоящем исследовании мы описываем новый протокол, в котором используется комбинация окрашивания X-gal lacZ-экспрессирующих опухолевых клеток и перфузии и фиксации легочной ткани in situ. Этот усовершенствованный протокол обеспечивает высокочувствительное обнаружение одиночных метастатических клеток в легких и позволил нам в недавнем исследовании обнаружить «спящие» микрометастазы в легких у мышей модели¹³, которая первоначально была описана как неметастатическая¹⁴.

Протокол

1. В месте перфузии легкого и фиксация

1. Anesthetize мышей IP-инъекции ~ 150 мкл фосфатным буферным раствором (PBS), содержащего 112,5 мг / кг (масса тела) кетамин, 16,5 мг / кг ксилазина и 15 мг / кг Ацепромазин (или другой анестезии, содержащие соответствующие болеутоляющие средства).
2. Когда рефлексы у мышей больше не наблюдается, зафиксировать его на операционный стол обратно вниз и влажный мех с 70% этанола, чтобы пятно волосы вниз.
3. Откройте кожу от живота до шеи и потяните ее в сторону или удалить его.
4. Откройте брюшины и грудной клетки с достаточным размером. Предотвращение разрывов крупных сосудов (например, jugularis пола), чтобы избежать снижения эффективности последующей перфузии.
5. Вырезать полой вены caudalis под печенью.
6. Используйте 20 мл шприц оснащен 21G - 24G иглу вводят медленно 10-15 мл PBS в правый желудочек бьющегося сердца, пока легкие полностью белый исердце перестает биться (асистолия).
7. Повышение от кровеносных сосудов на печени и диафрагмы с сосудистым зажимом.
8. Используйте в 10 мл шприц оснащен 21G - 24G иглу вводят ~ 2 мл 3% параформальдегидом (PFA) в PBS в правый желудочек.
9. Раскройте трахею снаружи грудной клетки. Используйте тот же шприц для введения ~ 3 мл 3% PFA в PBS черепа (за пределами грудной клетки) в трахею до легкого завышены. Сразу же после удаления игл, отщипывать трахеи хвостового из прокола с сосудистым зажимом и ждать 10 минут, чтобы позволить фиксации.
10. Разрез кровеносных сосудов выше сосудистый зажим, снимите зажим и вводят ~ 2 мл PBS в правый желудочек, чтобы удалить излишки PFA.
11. Прокол нижней части всех долей легких с помощью иглы, удалить сосудистый зажим на трахею и вводить 3-5 мл раствора PolyFreeze вложения средне / PBS 1:01 в трахею хвостового первого прокола до PFA в легкоедолей заменяется решением.
12. Снимите легких, осторожно потянув сердце с щипцами и пересекающих соединительной ткани связок, кровеносных сосудов и трахеи. Держите сердце связан с легкими.
13. В зависимости от того, как приступить к анализу легочной ткани продолжить протоколы, описанные в разделах 2 и 3. Если вы хотите сделать и анализы, удалить одно легкое доли и действуйте, как описано в возрасте до 3. Процесс оставшихся долей подключен к сердцу, как описано в разделе 2.

2. Визуализация LacZ с метками метастатических опухолевых клеток в целых долей легких

1. Поместите легких в пластиковой чашке с плотной крышкой закрытия и исправить ее с 2% формальдегида в PBS при комнатной температуре в течение 30-60 мин.
2. Удалить фиксации решения и тщательно промойте 3 раза с PBS.
3. Добавить по крайней мере, 10 мл свежеприготовленного 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид (X-Gal) окрашивание раствора (X-Gal раствора [40 мг / мл вДиметилформамид] 1:40 разводят в Основной красящий раствор, рН 7,1 (табл. 1); защиты от света).
4. Положите кусок марли в верхней части бассейна легкие, чтобы держать его полностью в растворе и положите крышку лишь в общих чертах на горшок, позволяющие осуществлять обмен воздуха.
5. Инкубировать при 37 ° С в течение 3-5 часов в защищенном от света.
6. Удалить X-Gal раствора, промойте один раз PBS для удаления остаточных X-Gal решение (по желанию) и добавить 4% PFA.

3. Визуализация LacZ с метками метастатических опухолевых клеток в легких Cryosections

1. Prefill помечены вложения форму на 1/3 неразбавленным среднего вложения PolyFreeze. Положить доля легкого сверху и залейте вложения среде до лопасть полностью покрыта. Постарайтесь предотвратить пузыри.
2. Инкубируйте встроенных легких при 4 ° С в течение 20 мин.
3. Тогда заморозить встроенных легких медленно в смеси сухого льда и изопентана и хранить при температуре -80 ° C.
4. Вырезать 7-10 мкм криоразделах, посвященных криостата и смонтировать их на SuperFrostPlus слайды микроскопом.
5. Инкубируйте разделов сразу с X-Gal окрашивание раствора при 37 ° С в течение 24 ч во влажной камере.
6. Промыть слайдов в PBS 2 раза в течение 5 мин, а затем кратко в дистиллированной воде.
7. Counter-пятно с ядерными быстрым красным в течение 10-30 секунд, промыть в дистиллированной воде и смонтировать слайды с иммуно-горе.

4. Представитель Результаты

Асаи и соавт. Сообщили в оригинальной статье на Dunn-производные LM8 мышиной модели ОС, которая SC первичных опухолей, полученных от родительской клетки Данн, отличаются от тех, происходит от высокой метастатической LM8 к югу клеточной линии, не самопроизвольно образуют обнаружены метастазы в легких сингенных C3H мышей ^14. С Здесь сообщил методы, мы переследованию образованию метастазов в Dunn/LM8 мышиных моделях ОС. Мы воспользовались стабильной LacZ-трансдуцированных Данн и LM8 клеткиы и протокол на месте перфузии легкого и фиксации у мышей. Представитель изображений перфузии и не перфузии легких мышей подкожно с LacZ-трансдуцированных и не трансдуцированных управления Данн и LM8 клетки показано на рисунке 1. В мышей, которым вводили контрольные клетки Данн, макроскопические и микроскопические метастазы остались обнаружить в не-перфузии и перфузии легких (рис. 1А, I-IV). Но, что интересно, в мышей, которым вводили Dunn-LacZ клеток, X-Gal окрашивание выявило синие микрометастазов очагов отдельных клеток или небольших скоплений клеток (<0,1 мм) на поверхность без перфузии легких (рис. 1А, VI). В месте перфузии и фиксации легких дальнейшее совершенствование выявляемости Dunn-LacZ микрометастазов (рис. 1А, VIII). Тем не менее, результат для макроскопических очагов не наблюдается (рис. 1А, V, VII).

В мышей, которым вводили управления LM8 клетки, полупрозрачные, едва уловимым macrometastatic очагов более 0,1 мм в диаметре, были признаны в не-перфузии легких (рис. 1б, г). Перфузии легкого (рис. 1б, в) не улучшает обнаружение очагов. Тем не менее, в мышей, которым вводили LM8-LacZ клеток нескольких X-Gal окрашен в голубой цвет макро-(рис. 1Б, В) и микрометастазов (рис. 1б, VI) были обнаружены на поверхности, не перфузии органов. Кроме того, перфузии легких улучшена выявляемость макро-и микрометастазов (рис. 1б, VII - VIII). Следовательно, микро-и macrometastases стал видимым при более высокой плотностью и большим числом, в основном за счет полупрозрачности перфузии тканей, в которых очаги под поверхностью орган также стал видимым.

Дополнительные чistological анализа с использованием cryosections легочной ткани подтвердили улучшенные возможности обнаружения метастазов в легких у мышей вводили LacZ-трансдуцированных Данн и LM8 клеток. У мышей с первичными опухолями, полученные из Dunn-LacZ или LM8-LacZ клеток, в отличие от мышей с первичными опухолями соответствующих контрольных клеток, микрометастазов или даже одной клетки очаги были признаны в легких секций (рис. 2). Кроме того, macrometastases также были более четко видны в мышей, которым вводили LM8-LacZ клеток, чем у животных, которым вводили управления LM8 клетки (рис. 2, D).

Рисунок 1. Обнаружение спонтанных метастазов, не трансдуцированных (I-IV) и LacZ-трансдуцированных (V-VIII), Данн (А) и LM8 (B) клеток в не-перфузии (I, II, V, VI) и перфузии (III, IV, VII, VIII), легкие в C3H мышей. Метастазы в представительных X-Gal-станцииINED целом легких (V, VII в А и B) и соответствующие крупным планом (VI, VIII в А и B) голубого цвета. Macrometastatic очагов (> 0,1 мм) в органах мышей, которым вводили, не отмеченных LM8 клеток (I-IV в B), обозначены звездочками. Районы показано в крупных планов являются репрезентативными для всей легких. Масштаб полоски указывают на 1 мм в образах целом легких и 0,1 мм крупным планом. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 2. Обнаружение Данн и LM8 микрометастазов в легких cryosections. Разделы октября легочной ткани встроенный инкубировали в X-Gal красящий раствор при 37 ° С в течение 24 ч во влажной камере, а затем контрастно с ядерным быстрый красного цвета. Стрелки указывают на микрометастазов очагов признается в легких участков мышей, которым вводили Dunn-LacZ (B) или LM8-LacZ клеток (D). Micrometastases осталось обнаружить в легких участков мышей, которым вводили не-трансдуцированных Данн (A) или LM8 клеток (C). Масштаб полоски указывают на 0,1 мм.

Обсуждение

Здесь представлены результаты в Dunn/LM8 модель мыши OS продемонстрировать силу вновь созданный метод, который сочетает в себе X-Gal окрашивание LacZ с метками опухолевых клеток на месте перфузии / фиксации легочной ткани. Эта комбинация этих двух методов позволяет с высокой чувствительностью обнаружения микрометастазов поражения до одного уровня клеток, а также улучшает визуализацию macrometastases на поверхности легких (рис. 1), а также в легких секций (рис. 2). В то время как X-Gal окрашивание также позволяет обнаруживать (микро) метастазов в других органах, на месте перфузии / фиксации повышает выявляемость метастатических очагов в тканях, кроме легких незначительно из-за естественной крови и тканях связанных цвет этих органов ^13. Даже если перфузии направлено на другого органа, например печени, удаление кровь лишь частично улучшить контрастность ставкуWeen X-Gal окрашивание и естественный цвет органа. Тем не менее, метод применим к любому типу LacZ с метками опухолевых клеток, значительно улучшить выявляемость легких метастазы до уровня спящих одноклеточных микрометастазов и позволяет легко и надежно количественного макро-и микрометастазов. Ограничение этого метода и все другие методы, основанные на репортера генов, в том числе люциферазы и флуоресцентные белки, является стабильность экспрессии трансгенов. Как показано на рисунке 2-й, не все опухолевые клетки в macrometastatic очаги окрашен в голубой цвет, что указывает на отсутствие бета-галактозидазы. Это может быть связано с некрозом, но это, скорее всего, в связи с потерей экспрессии трансгенов. Мы заметили, что Данн и LM8 клетки очень эффективны в понижающей регуляции LacZ и другие трансгены даже при непрерывной селекции для самовыражения. Поэтому мы переключается в недавних исследованиях с мышиным K12и K7M2 и человеческого HOS, 143В и Saos-2 линии остеосаркомы клетки, которые все поддерживали устойчивые выражения LacZ в пробирке, а также в естественных условиях до 100% в течение долгого времени.

После стабилизации LacZ-выражения гарантируется, этот метод может быть применен в исследованиях генов манипулировать опухолевых клеток, например, для механистически исследовать процесс колонизации тканей ^13, а также для разработки и тестирования новых методов лечения, направленных на искоренение метастатических поражений ^{15 , 16.} Кроме того, она может служить в качестве ориентира для совершенствования текущих методов визуализации радиологических, таких как ПЭТ, (микро) КТ и МРТ, используемых для раннего выявления метастазов. В недавнем исследовании ПЭТ (неопубликованные) с различными индикаторов мы убедились в естественных условиях обнаружены метастазы в легких впоследствии бывший естественных условиях с описанным протоколом. В продолжающемся исследовании с новым мелких животных микро-CT (SkyScan) мы так далеко ABле для выявления метастазов в легких в естественных условиях до размера 0,5 мм и экс естественных условиях до 0,3 мм, но мы нацелены на разрешение 0,1 мм. Интересно, что это предельный размер, что мы устанавливаем отличить от макро-микрометастазов с комбинированным методом на месте перфузии и X-Gal окрашивание. Это вновь подчеркивает чувствительность и полезность этой простой и экономически эффективной техники.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Narketan10 (кетамин)	Vetoquinol AG		100 мг / мл
Xylazin (ксилазина)	Штрели Pharma AG		20 мг / мл
Prequilan (Ацепромазин)	Fatro SpA		10 мг / мл
Бульдог Тип сосудистый зажим сосудистый зажим	Средства изобразительных наук	18051-35	изогнутые, 35 мм
Пластиковая чашка с крышкой	Семадени	2988	25 мл чашки с крышками
5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид (X-Gal); порошок	Axxora	ALX-582-002-G005	растворяют в N, N-ди-метилформамида до 40 мг / мл, магазин защищенном от света при температуре -20 ° C
Основной красящий раствор, сравняться с рН 7,1, хранятся защищенном от света при температуре 4 ° С в течение макс. 1 месяц	самодельный		100 мл / л 10xPBS, 1,64 г / л K3Fe (CN) 6, 2,1 г / л K4Fe (CN) 6, 2 мл / л 1М MgCl2, 2 мл / л 10% NP40, 1 мл / л 10% Натрий-Deoxycholate
Средний PolyFreeze внедрения	Polysciences; швейцарские дистрибьютор: Brunschwig	19636-1
Вложение формы	Polysciences	18646A-1
Leica CM1850 криостата	Leica Microsystems
SuperFrost слайды	Менцель	J1800AMNZ
Ядерные-Fast Red - алюминиевый раствор сульфата	Отдел Chroma Waldeck GmbH & Co KG расстояниеributor: Medite	84-0241-00
IMMU-Mount	Thermo Electron, швейцарский дистрибьютор: Histocom	9990412