Method Article

Простой протокол для извлечения Гемоциты от диких гусениц

DOI:

10.3791/4173

November 15th, 2012

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Насекомое гемоцитов выполнять многие важные функции, как иммунные и не иммунные, на всех этапах развития насекомых. Наши нынешние знания гемоцитов типов и функции в исследованиях на насекомых генетических моделей. Здесь мы представляем метод для извлечения, количественной оценки и визуализации гемоцитов от диких гусениц.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Насекомое гемоцитов (эквивалент млекопитающих белых клеток крови) играет важную роль в ряде физиологических процессов протяжении всего жизненного цикла насекомого 1. В личиночной стадии насекомых, принадлежащих к приказу чешуекрылых (бабочек) и двукрылых (истинные мухи), гемоцитов формируются из лимфатических желез (специализированных кроветворных органов) или эмбриональных клеток и может быть доведена до взрослой стадии. Эмбриональные гемоцитов участвуют в миграции клеток в процессе развития и хемотаксис регулирования при воспалении. Они также принимают участие в апоптоз клеток и необходимы для эмбриогенеза 2. Гемоциты посредником сотовой руку насекомых врожденного иммунного ответа, который включает в себя несколько функций, таких как сотовые распространения, агрегация клеток, образование узелков, фагоцитозу и инкапсуляции иноземных захватчиков 3. Они также несут ответственность за организацию конкретных насекомых гуморальной защиты во время инфекции, такие как PRoduction антимикробных пептидов и других эффекторных молекул 4, 5. Гемоцитов морфологии и функции в основном были изучены генетические или физиологические насекомых моделей, в том числе плодовой мухи, дрозофилы 6, 7, комары Aedes Aegypti и Anopheles gambiae 8, 9 и табачных hornworm, Manduca Sexta 10, 11. Тем не менее, мало информации, в настоящее время существует около разнообразие, классификация, морфология и функция гемоцитов в не-моделью видов насекомых, особенно те, собранных в дикой природе 12.

Здесь мы опишем простой и эффективный протокол для извлечения гемоцитов от диких гусениц. Мы используем предпоследнего возраста Lithacodes фасциола (желто-плечи пули моль) (рис. 1) и Euclea delphinii (колючий дуб пули) гусеницы (Lepidoptera: Limacodidae) и показать, что достаточных объемов гемолимфы (крови насекомых)могут быть выделены и гемоцитов номера отсчитывается от отдельных личинок. Этот метод может быть использован для эффективного изучения типов гемоцитов в этих видов, а также в других смежных гусениц чешуекрылых собрали с поля, или он может быть легко сочетается с иммунологических анализов предназначен для исследования гемоцитов функции после инфекции микроорганизмов или паразитов 13.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка материала

  1. Подготовка иглы (1-2 мкм и чаевые 3-4 конус мм) с использованием боросиликатного стеклянные капилляры и съемник микропипетки. Инструмент настройки: рампа: 561; скорость: 20; тепла: 560; Задержка: 1; тяга: 100; Давление: 500.
  2. Подготовить коллекцию решения: 60% Средний Грейс (GM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 20% антикоагулянтов буфера (98 мМ NaOH, 186 мм NaCl, 1,7 мМ ЭДТА и 41 мМ лимонной кислоты, рН 4,5 ). Данный раствор готовят свежую в стерильных условиях и держали на льду в любое время.
  3. Приготовьте раствор инкубационного буфера: 90% GM дополнен с 10% FBS. Это решение также готовитс....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В протоколе описаны здесь позволяет собирать минимальный объем 10-20 мкл гемолимфы насекомых из отдельных гусениц. Гемоциты собранных с помощью этого метода являются бесплатными клеточных слипания, меланизации дефектов тканей мусора и других загрязнений. Поэтому гемоцитов можно легко наблюдать и подсчитывали под микроскопом, и некоторые насекомые могут наблюдаться в течение нескольких Hosūr. Мы заметили, что большинство гемоцитов в наших образцах состоял из плазматоцитов 3 (гемоцитов распространение асимметри.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы для извлечения гемоцитов из важных медицинских насекомых и чешуекрылых насекомых модель уже сообщалось ранее 9, 14. Гемоцитов методов добычи адаптированы в соответствии с видов насекомых, стадии развития насекомого и его морфологические особенности. Например, гемолимфы изоляции от личинок Manduca может быть легко выполняются Ножницы изогнутые рога в конце брюшной полости 15. Потому что пуля гусениц (Limacodidae) лишены этой брюшной структуру, мы разработали отдельный протокол для ге.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TMS был поддержан Харлан целевых стипендий (УДВ) в ходе этого исследования. Финансирование коллекции полей и разведении L. фасциола и E. delphinii был предоставлен грант NSF DEB 0642438 на JTL.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
Микропипетки съемник Sutter Instruments P-1000
Боросиликатного стеклянные трубки Sutter Instruments B100-50-10 OD: 1.0, ID: 0,50 мм
Грейс среднего Сигма G8142
Плод бычьего сывороточного Thermo Fisher Scientific SH3007102 Тепло инактивированная
Дюмон # 5 пинцет Изобразительных инструментов науки 11252-40
Neubauer гемоцитометр Hausser Научные 3200
Пластиковые Tubiнг Tri-Tech TT-3-32OD OD: 3/32'', ID: 1/32 "
Стекло медицинский шприц Фортуна Optima D-97877 Объем 50 мл
Тупой иглой конца Мелкие детали NE-162PL-25 Калибра 16 х 1 "длиной

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).
  2. Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hemocyte ExtractionCaterpillar HemolymphInsect Immune ResponseHemocytometer CountingAnesthetizing CaterpillarsShallow Incision TechniqueBuffer Solution InjectionHemolymph CollectionWild Caterpillar AnalysisCellular Immune Assays

Related Articles