Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мульти-модальных изображений ангиогенеза в обнаженной модели крысы из груди метастазы рака костей с помощью магнитного резонанса, компьютерной томографии Объемные и ультразвуковые

14.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4178

⸱

14 августа 2012 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medical Physics in Radiology, German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany, 2Unit of Chemotherapy and Toxicology, German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany

В этой статье

Краткое содержание

В патогенезе костных метастазов, ангиогенез является важным процессом и, следовательно, представляет собой мишень для визуализации и терапии. Здесь мы представляем крысиной модели конкретных участков груди метастазы рака костей и описать стратегии неинвазивно изображения кровеносных сосудов В естественных условиях С помощью магнитно-резонансная томография, компьютерная томография объемный и УЗИ.

Аннотация

Ангиогенез является важнейшей характеристикой роста раковых опухолей и формирования метастазов. При метастазировании в кости ангиогенные факторы играют ключевую роль в пролиферации опухолевых клеток в полости костного мозга, а также во взаимодействии опухолевых и костных клеток, что приводит к локальному разрушению костной ткани. Нашей целью была разработка модели экспериментального костного метастазирования, позволяющей проводить оценку ангиогенеза в очагах поражения скелета in vivo с помощью методов неинвазивной визуализации.

Для этой цели мы вводили 105 клеток рака молочной железы человека линии MDA-MB-231 в поверхностную эпигастральную артерию, что предотвращает рост метастазов в областях тела, отличных от соответствующей задней конечности1. Через 25–30 дней после инокуляции опухолевых клеток развиваются специфические костные метастазы, ограниченные дистальным отделом бедренной кости, проксимальными отделами большеберцовой и малоберцовой костей1. Морфологические и функциональные аспекты ангиогенеза в костных метастазах можно исследовать в динамике с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ), объемной компьютерной томографии (ОКТ) и ультразвукового исследования (УЗИ).

МРТ отображает морфологическую информацию о мягкотканном компоненте костных метастазов, который изначально ограничен полостью костного мозга и впоследствии выходит за пределы кортикального слоя кости по мере прогрессирования. С помощью динамической МРТ с контрастным усилением (DCE-MRI) можно получить и количественно оценить функциональные данные, включая региональный объем крови, перфузию и проницаемость сосудов2-4. Деструкция кости фиксируется с высоким разрешением с помощью морфологической КТ-визуализации. В дополнение к результатам МРТ остеолитические очаги могут располагаться рядом с участками интрамедуллярного роста опухоли. После введения контрастного вещества КТ-ангиография позволяет с высоким разрешением визуализировать архитектуру макрососудов при костных метастазах, а DCE-КТ дает возможность изучить микроциркуляцию в этих очагах5,6. УЗИ применимо для оценки морфологических и функциональных характеристик скелетных поражений за счет локального остеолиза кортикального слоя кости. С использованием B-режима и допплерографии можно оценить структуру и перфузию мягкотканных метастазов соответственно. DCE-УЗИ позволяет в режиме реального времени визуализировать васкуляризацию при костных метастазах после инъекции микропузырьков7.

В заключение следует отметить, что при использовании модели сайт-специфических костных метастазов рака молочной железы мультимодальные методы визуализации, включая МРТ, КТ и УЗИ, предоставляют взаимодополняющую информацию о морфологии и функциональных параметрах ангиогенеза в этих поражениях скелета.

Протокол

1. Культуре клеток

  1. Культура MDA-MB-231 человеческих клеток рака молочной железы (Американская коллекция типовых культур) в RPMI-1640 (Invitrogen, Германия) с добавлением 10% FCS (Sigma, Германия). Держите всех культур в стандартных условиях (37 ° C, увлажненной атмосфере 5% CO 2) и прохождение клеток 2-3 раза в неделю, чтобы держать их в логарифмического роста. Для животных моделях, описанных ниже, нет необходимости для использования в костной сублиний MDA-MB-231 клеток опухоли скорость взять более 90% 1.
  2. Урожай суб-сливной опухолевых клеток после использования 2 мМ ЭДТА в PBS-(фосфатно-солевом буфере без Са 2 + и Mg 2 +) и 0,25% трипсина (Sigma, Тауфкирхен, Германия). Граф MDA-MB-231 клеток в камере Нойбауэр и приостановить их в RPMI-1640 (5x10 5 клеток в 1 мл).

2. Обнаженная модель крысы костных метастазов

  1. Все эксперименты были одобрены ответственными правительственными анимал комитета по этике.
  2. Используйте обнаженной крыс в возрасте 6-8 недель и держать их на возбудителя без условий в соответствующей небольшой системы животного (например, мини-барьер системы). Держите животных в контролируемых условиях (21 + / - 2 ° C комнатной температуры, влажности 60% и 12 час свет-темнота ритма) и предлагают автоклавного корм и воду без ограничений объявление на крысах.
  3. Прежде чем животное операции, вводят обезболивающий препарат (например, Carprofen 4 мг / кг подкожно, в связи с его однократного введения и коротким периодом полувыведения (около 8 часов), carprofen не должны влиять на рост опухоли). Обезболить крыс смесью кислорода (0,5 л / мин) и ИФ (1-1,5% об.) И убедитесь, что крысы под наркозом правильно и регулярно вдыхает до начала следующей процедуры.
  4. Положите под наркозом животным под соответствующий операционный микроскоп бинокулярный (например, Leica) и работать с увеличением в 16 раз.
  5. Начало хирургического вмешательства путем разрезания кожи и подкожной клетчатки в ИнгуИнал области при длине 2-3 см с помощью ножниц (BC060r Iris ножницы 108 мм). Все артерии, отходящие в бедренную артерию (ФА) должны быть расчлененным в том числе поверхностный эпигастральной артерии (СЭО), нисходящей артерии коленными (DGA), подколенной артерии (ПА) и подкожной артерии (СА).
  6. Поместите клипы на бедренной артерии проксимальнее происхождения СЭО, а также на DGA, PA и SA на временно закрывают местный кровоток. Перевязывать моря в его дистальной части, чтобы открытие этого судна без кровотечения (рис. 1а).
  7. Разрежьте SEA с помощью ножниц (Vannas Micro-SCRS протектором STR 85 мм) из проксимальных перевязки (рис. 1б) и управления 1% папаверин решение на море, чтобы облегчить последующие вставки иглы за счет расслабления сосудов ( Рис 1С).
  8. Отрежьте примерно половина диаметра моря с ножницами и вставить иглу (0,3 мм и 42 мм длиной) в просвет на море, holdiнг разреза конца сосуда с пинцетом (рис. 1D, E). Если возможно, фиксировать иглу в внешнее устройство к снижению нелегальной движений, которые могут привести к перфорации стенки сосуда. Подключите шприц с иглой. Удалить клип из дистального Англии и разместить его на подкожной артерии (рис. 1F).
  9. Вводите MDA-MB-231 приостановлены клеток в 0,2 мл среды медленно в море. В силу клипы MDA-MB-231 клеток направлены на DGA и ПА. Вытащите иглу и перевязывать море, чтобы предотвратить кровотечение перед взлетом артерии клипов. Закройте рану с помощью хирургического клипы и прекратить ингаляционной анестезии.
  10. Для пост-процедура наблюдения, крысы, как правило, усыпляют 7-8 недели после прививки опухоли клетки, чтобы избежать тяжелых костных осложнений. За это время животные должны контролироваться ежедневно оценить размер опухоли и каких-либо признаков боли (например, поведенческие отклонения, потеря веса, двигатель дефекты). Если животные показать опухольразмер превышает допустимый предел этически или свидетельство о боли во время роста опухоли, они должны быть умерщвлены.
  11. Иммуно-дефицитные (ню) крыс были использованы для ксеногенной трансплантации человеческих MDA-MB-231 клеток рака молочной железы. Голая крысы не были выбраны, чтобы лучше представить себе растущую опухоль.

3. Магнитно-резонансная томография (МРТ)

  1. После прививки опухоли клетки, позволяющие приблизительно 25-30 дней роста опухоли до начиная с изображениями. Для МРТ использовать специальный сканер или экспериментальной системы человека MR с соответствующей катушкой животных. Мы использовали человеческие MR системы (симфонии, Siemens, Германия) и самодельный катушка для радиочастотного возбуждения и регистрации, выполненная в виде цилиндрического объема резонатора с внутренним диаметром 83 мм и полезная длина 120 мм (рис. 2A).
  2. Обезболить крысы с кислородом и ИФ, как указано выше. Поместите катетер в вену хвоста и закрепить его на хвосте помощью крана е. Подключите шприц, содержащий контрастного вещества (например, 0,1 ммоль / кг Gd-DTPA примерно 0,5 мл; Магневист, Bayer Schering-Германия).
  3. Положите крысу в системе MR поддержания ингаляционной анестезии. Начнем с последовательности морфологических MR, чтобы найти костных метастазов (например, Т2 взвешенное: турбо последовательности спинового эха, TR 3240 мс, TE 81 мс матрицей 152 х 256, угол обзора 90 х 53,4 мм 2, толщина среза 1,5 мм, 3 средних, сканирование Время 3:40 мин).
  4. Определить кусочек костных метастазов с большим диаметром и начать последовательность DCE-MRI (например, насыщенность восстановление турбо мигания, TR 373 мс, TE 1,86 мс матрицей 192 х 144, угол обзора 130 х 97,5 мм 2, толщина среза 5 мм, измерение 512, в среднем 1, время сканирования 6:55 мин). После примерно 30 секунд, начала вводить контрастное вещество в течение периода времени от 10 сек. Общее время для вышеупомянутых процедур для выполнения МРТ примерно 15-20 минут на одно животное.
Название "> 4. Объемная компьютерная томография (ДКТ)

  1. Выберите подходящую систему КТ, либо человека или экспериментальных сканера. Здесь мы использовали прототип плоская панель оборудована объемной компьютерной томограф (рис. 2В; Объем КТ, Siemens, Германия).
  2. Обезболить крысы с кислородом и ИФ, как указано выше. Поместите катетер в вену хвоста и закрепить его на хвосте помощью ленты. Подключите шприц, содержащий контрастного вещества (например, 1 г йода на кг примерно в 0,5 мл; Imeron 400 Бракко, Германия).
  3. Положите крысу на сканере при ингаляционной анестезии. Используйте следующие параметры сканирования для ДКТ: трубки напряжение 80 кВ, ток трубки 50 мА, время сканирования 51 сек, скорость вращения 10 секунд, кадров в секунду, 120, матрицы 512 х 512 и толщина среза 0,2 мм. Вводите контрастное вещество во втором вращения плоской системы управления. Общее время для вышеупомянутых процедур для выполнения ДКТ экспертизы составляет примерно 5-10 минут в анимдр..
  4. Реконструкция изображений с модифицированной FDK (Фельдкамп-Davis-Кресс) в конусе лучей алгоритм восстановления (ядро H80a, Афра, Германия).

5. Ультразвуковое исследование (США)

  1. Экспериментальные и клинические США системы для этой цели. Мы использовали клинические системе Acuson Sequoia 512 Ультразвуковая система с линейным датчиком 15L8 (рис. 2, Siemens-Acuson, Mountain View, CA).
  2. Обезболить крысы с кислородом и ИФ, как указано выше. Поместите катетер в вену хвоста и закрепить его на хвосте помощью ленты. Подключите шприц, содержащий микропузырьков контрастного вещества (например, 1,6 мл / кг около 0,5 мл; SonoVue, Бракко, Италия). Закрепите датчик США на соответствующей задней ноги штатива и применять гель США между датчиком и задние ноги.
  3. Выполните B-режиме (частота передачи: 17 МГц; механический индекс: 0.51) для определения наибольшего диаметра костных метастазов и установить датчик в тсвою позицию. Добавить доплеровский сигнал на В-режим изображения для получения информации о тканевой перфузии. Пожалуйста, имейте в виду, что только поражения, которые нарушают кортикальной кости доступны в США волн.
  4. Для динамической контрастности повышенной США (DCE-US), настройки устройства США в каденцию отличие импульса последовательности (CPS) режиме (частота передачи: 7 МГц; механический индекс: 0.18), вводят микропузырьков и записывать кино петля длиной 90 сек. Общее время для вышеупомянутых процедур для выполнения экспертизы США составляет примерно 10-15 минут на одно животное.

6. Постобработка данных изображений

  1. Использование морфологического информации от МРТ, ДКТ и США характеризуют мягкие ткани опухоли (МРТ, США) и скелетных уничтожения (ДКТ) костных метастазов и определения местоположения, размер повреждения и объем поражения с DICOM Viewer (например, Osirix Dicom Viewer).
  2. Для получения ветвления сосудов в метастазах в кости (ангиография), ДКТ данные могут быть использованы. Повторнопостроить 2D или 3D-изображения, используя информацию артериальной фазы с или без методов вычитания (например, Osirix Dicom Viewer).
  3. Для количественной оценки показателей васкуляризации от DCE-MRI, DCE-VCT и DCE-США, использовать программные средства для конкретных условий. Для DCE-MRI, определить амплитуду сосудистые параметры (связанные с объемом крови) и обменного курса к постоянной р (связанные с перфузии и судно проницаемости) в костных метастазов с Dyna Lab (MEVIS исследований, Бремен, Германия) на основе двух- Отсек модель Brix 8,9. Альтернативные фармакокинетические модели для оценки имеются, например, Tofts модель 10.
  4. Для количественной оценки DCE-VCT данных, выполнять описательный анализ данных для расчета параметров, таких как площадь под кривой (AUC) и пик повышения (PE) с Dyna Lab (MEVIS исследований, Бремен, Германия).
  5. Количественной информации в режиме реального времени DCE-американского использования количественных программного обеспечения для анализа (например, Qontrasт, Бракко, Италия), анализируя кино-петли в соответствии с моделью осуществляется введение болюса. Поместите области интереса (ROI) в костных метастазов, определение или описательным такие факторы, как площадь под кривой или количественные параметры из цветных карт, например, региональные объема крови, регионального кровотока и время заполнения.

7. Представитель Результаты

После внутриартериального введения MDA-MB-231 клеток в море (рис. 1), сайт-специфические метастазы в кости развиваются в соответствующих задние ноги обнаженной крысы. Остеолитические поражение ограничивается бедра, голени и малоберцовой кости могут быть отображены неинвазивно с помощью МРТ, ДКТ и США (рис. 2), начиная примерно 25-30 дней после инъекции и после-до нескольких недель. При объединении МРТ, ДКТ и США, включая родных и контрастным усилением техники, дополнительная информация может быть оценен в костных метастазов, которые состоят из мягкой тканиопухоли (опухолевых клеток и стромы) и соответствующие поражения остеолитические (костной деструкции). Для сравнения соответствующих данных между методами, все три формы изображения могут быть использованы последовательно в том же крыса. МРТ показывает морфологии костного метастатического мягких тканей, что изначально ограничены полости костного мозга, а затем превышает кортикальной кости в процессе развития. Функциональные параметры, такие как региональные объем крови, перфузии и судно проницаемость может быть получена от DCE-MRI и количественно (рис. 3). Структура кости и, в частности остеолитические изменений в метастазах оценивается в высоком разрешении по ДКТ. В дополнение к МРТ, остеолитические поражения расположены рядом с интрамедуллярного рост опухоли. ДКТ ангиография выявляет измененные архитектуры macrovessel метастазов в кости, и DCE-VCT отображает соответствующие аспекты микроциркуляции (рис. 4). В связи с локального разрушения кортикальной кости в metastatiС поражением США применяется для оценки морфологических и функциональных особенностей мягких тканей опухоли с использованием B-режима и доплеровского методов. По заявлению микропузырьков, DCE и США позволяет в режиме реального времени изображения васкуляризации метастазы в кости (рис. 5).

figure-protocol-1
Рисунок 1. Задние ноги обнаженной крысы готовы к опухоли клетки прививки изображение получено путем операции микроскопом. , Ветвящиеся структуры бедренной артерии (FA) в том числе поверхностный эпигастральной артерии (СЭО), нисходящей артерии коленными (DGA), подколенной артерии (ПА) и подкожной артерии (СА). Артериальная клипы размещены на СА, ПА и проксимальных Англии, а также перевязки МОРЕ, В, SEA была вырезана из проксимальных перевязки, C, мышечная релаксация море после того папаверина, D, разрез по СЭО (подхвачена щипцы), E, ​​введение иглы в море, F, фиксируется игла в море (внешний Fi xating устройства) и инъекции MDA-MB-231 опухолевых клеток по СЭО в DGA и ПА в силу клипов.

figure-protocol-2
На рисунке 2, человеческая система MR (Симфония, Siemens, Германия) и самодельный катушка для радиочастотного возбуждения и регистрации помещен в сканер;. B, плоская панель оборудована объемной компьютерной томограф (КТ том, Siemens, Германия), C, клинической ультразвуковой системы Acuson Sequioa 512 (Siemens-Acuson, Mountain View, CA).

figure-protocol-3
Рисунок 3. Осевая MR разделов. Левая панель, T2w МРТ, средняя панель, амплитуда (DCE-MRI), правая панель, обменный курс к постоянной р (DCE-MRI). Стрелки указывают на метастазы в кости. Цветовую карту для DCE-MRI данных в диапазоне от красного (высокие значения) до синего (низкие значения).

78/4178fig4.jpg "/>
Рисунок 4. 3D реконструкции ДКТ в остеолитические метастазы кости (левая панель) и ангиография (средняя панель), а также DCE-VCT раздел ориентации осевой от повышения параметров пик (справа). Цветовую карту для DCE-VCT данных в диапазоне от красного (высокие значения) до синего (низкие значения).

figure-protocol-4
Рисунок 5. США изображений в В-режиме (морфология, на левой панели), доплеровский (перфузии, средняя часть) и CEUS (на правой панели, максимальное повышение после инъекции микропузырьков в реальном масштабе времени изображений васкуляризации) из костных метастазов.

Справочная фильм 1. Щелкните здесь для просмотра дополнительных кино .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод вызывая экспериментальные метастазы в кости, представленные здесь, в сочетании с изображениями процедуры позволяют последующих остеолитические поражения в обнаженном крыс в продольном направлении. В нашей модели MDA-MB-231 человеческих клеток рака молочной железы вводят в море, которое анастомоза между подвздошной артерии через pudendoepigastric ствола и бедренной артерии. Таким образом, приток крови в область поставляется в коленном суставе сохраняется после перевязки СЭО. Преимущества этой модели по сравнению с ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB-TR 23 и SFB-TR 79, туберкулезом и DK). Авторы хотели бы поблагодарить Ренате Bangert Карин Leotta и Лиза Зейлера за отличную техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу
MDA-MB-231 человеческих клеток рака молочной железы Американская коллекция типовых культур (АТСС) HTB-26
RPMI-1640 Invitrogen 61870
ФТС Invitrogen 10270
Трипсин-EDTA Invitrogen 25300
Carprofen Римадил Pfizer PZN 110208
Магневист Bayer Schering- PZN 6961516
Imeron 400 MCT Бракко PZN 228654
SonoVue Бракко PZN 1567358
Папаверин Alfa Aesar L 04152
Isofluran Бакстер HDG 9623
Симфония (магнитно-резонансная томография) Сименс
Объем КТ (компьютерная томография объемный) Сименс
Acuson Sequioa 512 (УЗИ) Siemens-Acuson

Ссылки

  1. Bäuerle, T. Characterization of a rat model with site-specific bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells and its application to the effects of an antibody against bone sialoprotein. Int. J. Cancer. 115, 177-186 (2005).
  2. Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W., Bäuerle, T. Sorafenib tosylate and paclitaxel induce anti-angiogenic, anti-tumor and anti-resorptive effects in experimental breast cancer bone metastases. Eur. J. Cancer. 47, 277-286 (2010).
  3. Bäuerle, T. Cilengitide inhibits progression of experimental breast cancer bone metastases as imaged noninvasively using VCT, MRI and DCE-MRI in a longitudinal in vivo study. Int. J. Cancer. 128, 2453-2462 (2011).
  4. Bäuerle, T., Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W. Drug-induced vessel remodeling in bone metastases as assessed by dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging and vessel size imaging: a longitudinal in vivo study. Clin. Cancer Res. 16, 3215-3225 (2010).
  5. Bäuerle, T. Imaging anti-angiogenic treatment response with DCE-VCT, DCE-MRI and DWI in an animal model of breast cancer bone metastasis. Eur. J. Radiol. 73, 280-287 (2010).
  6. Bäuerle, T. Bevacizumab inhibits breast cancer-induced osteolysis, surrounding soft tissue metastasis, and angiogenesis in rats as visualized by VCT and MRI. Neoplasia. 10, 511-520 (2008).
  7. Merz, M., Komljenovic, D., Semmler, W., Bäuerle, T. Quantitative contrast-enhanced ultrasound for imaging anti-angiogenic treatment response in experimental osteolytic breast cancer bone metastases. , Forthcoming (2012).
  8. Brix, G. Pharmacokinetic parameters in CNS Gd-DTPA enhanced MR imaging. J. Comput. Assist. Tomogr. 15, 621-628 (1991).
  9. Brix, G. Microcirculation and microvasculature in breast tumors: pharmacokinetic analysis of dynamic MR image series. Magn. Reson. Med. 52, 420-429 (2004).
  10. Tofts, P. S. Estimating kinetic parameters from dynamic contrast-enhanced T(1)-weighted MRI of a diffusable tracer: standardized quantities and symbols. J. Magn. Reson. Imaging. 10, 223-232 (1999).
  11. Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48, 6876-6881 (1988).
  12. Kjonniksen, I., Winderen, M., Bruland, O., Fodstad, O. Validity and usefulness of human tumor models established by intratibial cell inoculation in nude rats. Cancer Res. 54, 1715-1719 (1994).
  13. Bäuerle, T. Treatment of bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells with an antibody against bone sialoprotein. Int. J. Oncol. 28, 573-583 (2006).
  14. Andersen, T. L. A physical mechanism for coupling bone resorption and formation in adult human bone. Am. J. Pathol. 174, 239-247 (2009).
  15. Nyangoga, H., Mercier, P., Libouban, H., Basle, M. F., Chappard, D. Three-dimensional characterization of the vascular bed in bone metastasis of the rat by microcomputed tomography (MicroCT). PLoS One. 6, e17336(2011).
  16. Bäuerle, T., Semmler, W. Imaging response to systemic therapy for bone metastases. European Radiol. 19, 2495-2507 (2009).
  17. Bretschi, M. Cilengitide inhibits metastastic bone colonization in a nude rat model. Oncol. Rep. 26, 843-851 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мульти-модальных изображений ангиогенеза в обнаженной модели крысы из груди метастазы рака костей с помощью магнитного резонанса, компьютерной томографии Объемные и ультразвуковые
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.