Методическая статья

LabVIEW управлением Романа Nanoliter Осмометр для Ice привязки исследования белков

22.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4189

⸱

4 февраля 2013 г.

 , 
1Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition , The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food, and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Physics and Astronomy, Ohio University

В этой статье

Краткое содержание

Ice белков (IBPs), также известный как антифриз белков, тормозят рост и льда являются перспективными добавка для использования в криоконсервация тканей. Основным инструментом, используемым для расследования IBPs является nanoliter осмометра. Мы разработали дом-разработаны стадии охлаждения установлены на оптическом микроскопе и управляются с помощью заказных LabVIEW рутины. Осмометра nanoliter описанных здесь манипуляций температуры образца в ультра-чувствительной манере.

Аннотация

Белки, связывающие лед (IBP), включая антифризные белки, структурирующие лед белки, белки термического гистерезиса и белки, ингибирующие рекристаллизацию льда, обнаруживаются у холодостойких организмов и защищают их от повреждений при замерзании путем взаимодействия с кристаллами льда. IBP встречаются у самых разных организмов, включая рыб1, растения2, 3, членистоногих4, 5, грибы6 и бактерии7. IBP адсорбируются на поверхности кристаллов льда и препятствуют присоединению молекул воды к ледяной решетке в местах адсорбции IBP. Лед, растущий на поверхности кристалла между адсорбированными IBP, приобретает высокую кривизну, что снижает температуру роста кристаллов льда; это явление называют эффектом Гиббса-Томсона. Это понижение создает разрыв (термический гистерезис, TH) между точкой плавления и неравновесной точкой замерзания, в пределах которого рост льда прекращается8-10, см. Рисунок 1. Одним из основных инструментов, используемых в исследованиях IBP, является нанолитровый осмометр, который позволяет измерять активность TH растворов IBP. Нанолитровые осмометры, такие как приборы Clifton (Clifton Technical Physics, Hartford, NY) и Otago (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), были разработаны для измерения осмолярности раствора путем измерения понижения точки плавления капель нанолитрового объема. Эти устройства использовались для измерения осмолярности биологических образцов, например слез11, и оказались полезными в исследованиях IBP. Ручное управление этими нанолитровыми осмометрами ограничивало экспериментальные возможности. Скорость изменения температуры не могла контролироваться надежно, диапазон температур прибора Clifton был ограничен 4 000 mOsmol (около -7.5 °C), а запись температуры в зависимости от времени была недоступна для этих приборов.

Мы разработали специализированную систему нанолитрового осмометра с компьютерным управлением на базе платформы LabVIEW (National Instruments). Криостат, описанный ранее9, 10, содержит металлический блок, через который циркулирует вода, что позволяет ему выполнять функцию теплоотвода, см. Рисунок 2. К этому блоку прикреплены термоэлектрические охладители, которые могут управляться с помощью коммерческого контроллера температуры, совместимого с модулями LabVIEW, см. Рисунок 3. Более подробная информация приведена ниже. Основным преимуществом данной системы является высокоточный контроль температуры, см. Рисунок 4. Автоматизированное регулирование температуры позволяет координировать фиксированный температурный градиент с выводом данных видеомикроскопии, содержащим дополнительные детали эксперимента.

Для изучения временной зависимости активности ТН мы протестировали гиперактивный ИБП массой 58 кДа из антарктической бактерии Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. Этот белок был помечен усиленным зеленым флуоресцентным белком (eGFP) в конструкции, разработанной группой Питера Дэвиса (Королевский университет)10. Мы показали, что профиль изменения температуры влиял на активность ТН. Прецизионный контроль температурного профиля в этих экспериментах значительно улучшил результаты измерений ТН. Нанолитровый осмометр дополнительно позволил нам изучить ингибирование рекристаллизации белками IBPs5, 13. В целом, рекристаллизация представляет собой явление, при котором крупные кристаллы растут за счет более мелких. IBPs эффективно подавляют рекристаллизацию даже при низких концентрациях14, 15. Мы использовали наш осмометр под управлением LabVIEW для количественного мониторинга рекристаллизации льда и поддержания постоянной доли льда с помощью одновременного видеоанализа изображений в реальном времени и температурной обратной связи из камеры образца13. Расчеты в реальном времени обеспечивают дополнительные возможности управления в ходе экспериментальной процедуры. Был разработан предметный столик для инвертированного микроскопа, предназначенный для размещения микрофлюидных устройств с температурным контролем, который будет описан в другом источнике16.

Система охлаждения предметного столика

Узел охлаждаемого предметного столика (Рисунок 2) состоит из набора термоэлектрических охладителей, которые охлаждают медную пластину. Отвод тепла от столика осуществляется путем пропускания холодной воды через закрытую камеру под термоэлектрическими охладителями. Отверстие диаметром 4 mm в центре медной пластины служит смотровым окном. Для установки термистора было просверлено отверстие в плоскости пластины диаметром 1 mm. На медную пластину поместили изготовленный на заказ медный диск (диаметром 7 mm) с несколькими отверстиями (диаметром 500 μm) и совместили его со смотровым окном. Воздух подавали со скоростью потока 35 ml/sec и осушали с помощью Drierite (W.A. Hammond). Сухой воздух использовался для обеспечения сухой среды в зоне охлаждения. Столик был подключен через 9-контактный разъем к контроллеру температуры (модель 3040 или 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). Контроллер температуры был подключен кабелем к PCI-карте GPIB компьютера (National instruments, Austin, Texas, USA).

Протокол

0. Предварительные процедуры

  1. Стеклянный капилляр для решения инъекций. Использование капиллярного съемника (Narishige, Токио, Япония), подготовить резкий пипетки с тонким открытия из стеклянного капилляра микро трубки (Brand GMBH, Wertheim, Германия). Размер отверстия должны быть проверены путем пропускания воздуха через капилляр для получения тонкой кипящей в чистой воде. Если капиллярная закрыт, то можно открыть его, разбивая ее края. Это может быть достигнуто путем нажатия или царапины это мягко по отношению к воде, содержащей стенок трубы. Подготовка капиллярные, что открытие почти заблокированы, но достаточно открыть, чтобы позволить формирование суб-миллиметровом пузыри.
  2. Медный диск очистки. Разрушать ультразвуком медных дисков в течение 10 мин в 0,1% Micro-90 мыло (Cole-Parmer, Вернон Хиллс, штат Иллинойс, США), затем промыть дистиллированной водой. Представьте дисков в изопропанол (техническое) решение, и разрушать ультразвуком в течение 10 мин. Плавниксоюзника, высушить диски, используя фильтрованный воздух. Такая очистка этап имеет решающее значение для предотвращения загрязнения IBP между экспериментами.
  3. Двойной слой покровного стекла сборки. Покровного стекла сборка была готова предоставить для выборочного наблюдения без конденсации влаги на поверхности стеклянной крышкой. Это было достигнуто путем размещения Drierite (WA Hammond Drierite, Ксения, штат Огайо, США) частицы (2 мм в диаметре) между двумя покровные, которые затем были склеены пистолет горячего клея. Эта конфигурация предотвратить конденсацию, которые могут блокировать зрения, когда образец охлаждают до низких температур и сняло необходимость дуть сухой воздух на смотровое окно.

1. Охлаждение Этап Настройка

  1. Подключите воды на входе и выходе потока из стадии охлаждения до 4 мм внутреннего диаметра трубы Tygon (Saint-Gobain, Париж, Франция), и подключить входной воды трубы водяного насоса.
  2. Подключите 4 мм, внутренний диаметр трубы Tygon на входе системы охлаждения т этапеO поставлять сухого воздуха. В воздухе сушат в линию Drierite колонки.
  3. Эксплуатация воздушных и водяных насосов. Обратите внимание, что охлаждающие элементы не должны работать без радиатора.
  4. Включите регулятор температуры, камеры и LabVIEW рутины.

2. Подготовка проб

  1. Поместите 3-4 мкл каплю иммерсионного масла B (Каргиль лабораторий, Cedar Grove, Нью-Джерси, США) на обратной стороне 7 мм, диаметр диска меди 500 мкм, имеющих отверстия, просверленные через диск.
  2. Расположите медный диск на стадии охлаждения с боковой погружения нефть вниз.
  3. Подключите капиллярная трубка (тупой край) до 0,7 мм, внутренний диаметр трубы Tygon связан с другого конца в 2 мл стеклянный шприц (Poulten-Граф, Wertheim, Германия).
  4. Перед использованием капиллярной трубке, проверьте небольшое отверстие капилляра для того, чтобы отверстие соответствующего размера (см. предварительные процедуры).
  5. Медленно вставьте GLAсс капилляр в подготовленную IBP белка пробирку (2,4 мкМ Мп IBP-GFP в 20 мМ CaCl 2 и 25 мМ Трис-HCl при рН 8, см. ссылку 10 для подготовки деталей) и вытащить стеклянный шприц, пока стеклянный капилляр содержит 0,1 мкл раствора белка.
  6. Начать запись видео с помощью программного обеспечения LabVIEW.
  7. Вставьте острый край стеклянного капилляра (содержащий раствор белка) в одно из отверстий в медных дисков на стадии охлаждения.
  8. При наблюдении в микроскоп (Olympus, Токио, Япония, 10-кратный объектив), осторожно проникают в слой иммерсионного масла с кончика стеклянного капилляра, а затем нажмите стеклянный шприц (очень тонко), чтобы доставить небольшое количество (~ 10 п) белка Решение создать 200 мкм капли.
  9. Закройте отверстие в стадии охлаждения с двойной сборки покровного стекла слоя (см. Предварительные процедуры).

3. Измерение активности TH

  1. Предварительноесс охлаждение кнопку и установите температуру до -40 ° C.
  2. Первоначально решение капля будет ясно. При низких температурах, как правило, в диапазоне от -30 ° C до -35 ° C, цвет капли изменения, указав, что решение было заморожено. Сразу же после пробы заморожены, повышение температуры медленно, пока основная лед начинает таять. Постепенное повышение температуры необходимо, чтобы избежать превышения температуры, что может привести к полному таянию образца.
  3. Переключить на 50x цель и начать, чтобы растопить лед, регулируя температуру. Эта настройка является интерактивным, и последние шаги, как правило, осуществляется с помощью маленьких шагов температуре 0,002 ° C. Продолжайте, пока расплава монокристалл остается. Окончательный размер кристалла должна быть около 10 мкм. Самая высокая температура, при которой плавление перестал определяется как температура плавления и точно определить на более поздней стадии анализа видео.
  4. Установить температуру на несколько сотых градуса Цельсия ниже температуры плавления кристалла и начать температуры рампа с задержкой 10 минут. Отрегулируйте наращивает скорость по желанию. За это время кристалл будет подвергаться IBPs.
  5. После завершения 10 раз экспозиция мин, температура будет уменьшаться автоматически под контроль процедуру LabVIEW.
  6. Соблюдайте формы кристалла при понижении температуры. В какой-то момент, внезапный взрыв кристаллов льда могут быть обнаружены. Температура, при которой это происходит, отметил, как температура взрыва кристалла.
  7. Используйте видео анализ, чтобы определить точную температуру плавления и всплеск температуры. Во-первых, с помощью анализа видео, найти точную температуру плавления. Напомним, что самая высокая температура, при которой плавление перестал определяется как температура плавления. Запишите этот температуру плавления в программе электронных таблиц. Затем, определить точную температуру взрыва кристалла, и документировать это значение, а также. Разница между температурой плавления и замерзания, или температура кристалла взрыв, является тепловая активность гистерезиса решение IBP.

4. Измерение зависимости от времени TH активность

  1. Следуйте протоколу, описанному в разделах 3.1-3.3 подготовить единый кристалл льда.
  2. После образования кристаллов, установить время задержки рампы по желанию, и включить рампы.
  3. Температура снизится по фиксированной ставке (в соответствии с требованиями операторов) автоматически, как только темпа задержки.
  4. Документ температуры, при которой происходит взрыв кристалла. Рассчитайте время экспозиции (время между образованием кристаллов и кристаллов взрыв).
  5. Повторите эксперимент для различных времен задержки и построить TH деятельности в зависимости от воздействия времени, чтобы оценить зависимость от времени TH деятельности.

Результаты

Измерение зависимости от времени TH

LabVIEW управлением nanoliter осмометра облегчает выполнение точных измерений активности TH. Постоянную скорость снижения температуры допускается измерение зависимости от времени TH. Точный контроль температуры включен по осмометра nanoliter имеет решающее значение для этих экспериментов. Выдержка из кристаллов льда в IBPs в растворе определяется как период времени с образованием кристаллов (конец процесса плавления) до внезапного роста льда вокруг кристалла (кристалл взрыв). Мы обнаружили, что время воздействия кристаллов льда в IBPs решающее влияние на TH деятельности. Короткие периоды IBP экспозиции (несколько секунд) производится низкой активности TH в МП IBP-GFP решение (2,4 мкм) (рис. 5). TH деятельности увеличилась с IBP время экспозиции пока не достигли плато на 4 мин экспозиции IBP. При более высоких концентрациях IBP, пластиныAu была достигнута на короткое время.

figure-results-1
Рисунок 1. Схематическое IBPs адсорбированных на льду. Принято с разрешения 10.

figure-results-2
Рисунок 2. Стадии охлаждения. A) связи на трубы на микроскопе. Б) без верхней свинца. C) схема.

figure-results-3
Рисунок 3. Скриншот интерфейса LabVIEW. ClИк здесь, чтобы просмотреть большую фигуру.

figure-results-4
Рисунок 4. График температурной стабильности. Регулятор температуры был установлен, чтобы понизить температуру 0,01 ° C каждые 15 сек.

figure-results-5
Рисунок 5. Mp IBP TH деятельности в зависимости от игрового времени экспозиции кристалла в IBPs. Каждый раз, дело в том, среднее из 3-6 экспериментов.

Обсуждение

Эта работа демонстрирует работу с компьютерным управлением nanoliter осмометра, что обеспечивает точное измерение TH деятельности с необычайной контроля температуры. В любом чувствительные к температуре системы, нежелательные температурные градиенты следует избегать. Чтобы избежать температурных градиентов в аппарате представлены здесь, капли исследуемого раствора должна быть расположена в центре отверстие в охлаждении медный диск этап (шаг 2,7). Кроме того, в одном кристалле должны быть в центре капли, а не по краям (в большинстве случаев, это произойдет спонтанно). Зависимость от времени описано показывает, что скорость охлаждения может повлиять на TH показания. Таким образом, мы предлагаем в том числе отчета о времени, в течение которого кристалл подвергается раствор до охлаждения, а также от скорости охлаждения. Как правило, мы ждали 10 минут до наращивает вниз температура на 0,01 ° C шаги каждые 4 сек.

LabVIEW совместно контролируемыхОлинг этапе был адаптирован для использования с помощью инвертированного микроскопа, на котором микрофлюидных устройства могут быть термически манипулировать. Эта система облегчает выполнение решений обмена эксперименты с кристаллами льда и IBPs отмеченных УЗФБ с 9, 10, 16. LabVIEW-управляемая система может быть адаптирована к сцене Clifton, подключив 3040 Регулятор температуры с помощью назначенных адаптации электрической цепи. Такая система работает в лаборатории Дэвис 17. Программное обеспечение LabVIEW и назначенный адаптации электрических схем для сцены Clifton предоставляются по запросу.

В заключение мы описываем nanoliter осмометра, что облегчает чувствительной контроля и манипуляции температуру и скорость увеличения температуры и уменьшение (с чувствительностью 0,002 ° C), согласованный с видео интерфейс, с помощью LabVIEW для рутинного анализа в реальном времени. Эта система может выполнять воспроизводимые скорости контролируемых экспериментов, которые являются importanт для исследования кинетики IBP взаимодействия со льдом. Такие эксперименты могут решить ряд давно обсуждаемая вопросы, связанные с механизмом действия IBPs.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Это исследование было поддержано ISF, NSF, и ERC. Мы хотели бы отметить техническую помощь с температурой этапе от Рэнди Milford, Майкл Корен, Даг Шефер, и Джереми Dennison. Помощь в разработке программного обеспечения были предоставлены Или Чэнь, Сюй Ди, Раджеш Sannareddy, и Sumit Bhattachary. Мы хотели бы поблагодарить наших сотрудников Профессор Питер Л. Дэвис и доктор Лори А. Грэмом для белка Мп IBP и полезные обсуждения. Мы также благодарим лабораторию члены доктор Майя Бар-Dolev, Yangzhong Цинь, доктор Yeliz Челик, д-р Наталья Pertaya, Орталь Mizrahy, и Шломит Guy за их обратную связь с пользователем.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Имя Компания Номер в каталоге / модель Комментарии
Погружение масло Type B Каргиль лабораторий 16484
Drierite WA Hammond Drierite 043063 2270g
Микро-90 раствор для очистки Cole-Parmer EW-18100-11
Капиллярные съемника Narishige PB-7
Стеклянные капиллярные трубки Марка GNBH 7493 21 Длиной 75 мм, 1,15 диаметра
Температураконтроллер Newport, Irvine, Калифорния, США Модель 3040 Модель 3040
Оптический микроскоп Олимп Модель BH2
10-кратный объектив Олимп S плане 10, 0,3, 160/0.17
50x объектив Nikon CF план, 50X/0.55 EPI ELWD
CCD камеры Provideo CVC-140
Tygon трубы Saint-Gobain, Париж, Франция Tygon разработка S-50-HL труб
Стеклянный шприц (2 мл) Poulten-Граф, Wertheim, Германия 7 10227
GPIB-PCI карт Национальные инструменты, Остин, Техас, США 778032-01
Видео кадров граBBER IMAQ-PCI-1407 Национальные инструменты, Остин, Техас, США 322156B-01
LabVIEW Система Design Software Национальные инструменты, Остин, Техас, США Версия 8
DiVx Автор программного обеспечения DiVx LLC, San Diego, CA, USA

Ссылки

  1. DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
  2. Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
  3. Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
  4. Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
  5. Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
  6. Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
  7. Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
  8. Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
  9. Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
  10. Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
  11. Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
  12. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
  13. Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
  14. Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
  15. Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
  16. Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
  17. Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).

Перепечатки и разрешения

Теги

LabVIEW
LabVIEW управлением Романа Nanoliter Осмометр для Ice привязки исследования белков
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.