Гетеротипические Трехмерные In Vitro Моделирование Стромальные-эпителиальных взаимодействий во время посвящения яичников Рак и прогресс

Краткое содержание

Мы описываем методологии для установления В пробирке Гетеротипические трехмерных моделей содержащие яичников фибробластов и нормальной поверхности яичников или раком яичников эпителиальных клеток. Мы обсудим использование этих моделей для изучения стромальных-эпителиальных взаимодействий, которые происходят во время развития рака яичников.

Аннотация

Эпителиального рака яичников (EOCs) являются ведущей причиной смерти от злокачественных гинекологических в западных обществах. Несмотря на успехи хирургического лечения и улучшения на основе платины химиотерапии, наблюдается небольшое улучшение в EOC выживаемость в течение более четырех десятилетий ^1,2. В то время как I этап опухоли имеют 5-летнюю выживаемость> 85%, выживаемость этап III / IV заболевания <40%. Таким образом, высокий уровень смертности для EOC может быть существенно уменьшена, если опухоль была обнаружена на ранней, более поддающихся лечению, стадиях ^3-5. В настоящее время молекулярно-генетические и биологические основы раннего развития стадии заболевания изучена плохо. В частности, мало известно о роли микроокружения опухоли во время посвящения; но известные факторы риска для EOCs (например, возраст и четности) предполагают, что микроокружение играет ключевую роль в начале генезиса EOCs. Поэтому мы разработали трехмерную гетеротипические моделейкак нормальный яичник и ранней стадии рака яичников. Для нормального яичника, мы совместно культивируемых нормальных поверхности яичников эпителиального (IOSE) и нормальных стромальных фибробластов (INOF) клетки, увековеченный retrovrial трансдукции каталитической субъединицы теломеразы человека холофермента (hTERT), чтобы продлить срок службы этих клеток в культуре. Для моделирования ранних стадиях яичников эпителиального трансформации клеток, избыточная экспрессия онкогена CMYC в IOSE клетки, опять совместно культивировали с INOF клеток. Эти гетеротипические модели были использованы для изучения влияния старения и старения на трансформации и вторжение в эпителиальных клетках. Здесь мы опишем методологические шаги в развитии этих трехмерных моделей; эти методики не являются специфическими для развития нормальной ткани яичников и рака яичников, и может быть использована для изучения других типов тканей, где стромальные и эпителиальные клетки взаимодействия являются фундаментальными аспектом поддержания тканей и ди-Сиз развития.

Протокол

На рисунке 1 показано обзор рабочего процесса описаны ниже.

1. Выделение нормальных фибробластов яичников и продление продолжительности жизни в пробирке с помощью избыточной экспрессии каталитической субъединицы холофермента hTERT

1. Яичников ткани могут быть собраны с информированного согласия пациента и утверждение совета организации (для американских учреждений). Нормальные ткани яичника может быть собрана после тотального абдоминальной гистерэктомии или полной лапароскопической гистерэктомии с двусторонней придатков матки. В этом исследовании тканей были рассмотрены патологоанатомом и часть стромы яичника биопсию для клеточной культуры. Образцы тканей примерно 2-5 мм ² были собраны из центральной области яичников, чтобы попытаться уменьшить вероятность также отбор проб эпителия яичников.
2. Транспорт свежей ткани яичников в лаборатории клеточных культур в увековечены нормальных фибробластов яичников (INOF) роста среднего, с добавлением дополнительных антибиотики и противогрибковые. INOF среде роста (INOF-GM) включает в себя: Средний 199 и MCDB105 смешивают в соотношении 1:1 с добавлением 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг / мл гентамицина и 250 нг / мл амфотерицина B.
3. Рабочие в шкафу биобезопасности: Удалите все эпителиальные клетки, которые остаются слабо прикреплены к ткани, путем промывки образца с 5 мл PBS. Аспирируйте и повторить еще два раза.
4. Передача образца плюс PBS в чистую диаметром 10 см (P100) культуры блюдо. Используйте стерильные щипцы для обработки тканей и место во второй, сухой чистый P100 блюдо культуры. Используйте стерильным скальпелем вырезать ткань 0,5 см ^{2 шт.} Поместите каждый кусочек ткани в отдельное блюдо P100 и далее разрезать на куски <1 мм ² в размере. Добавить 20 мл INOF-GM (плюс антибиотики и противогрибковые), и инкубировать при 37 ° C, 5% CO _2. Мониторинг роста клеток с использованием фазового микроскопа. Клетки можно увидеть присоединения к блюду ума гин 24 часа в сутки.
5. Re подачи через неделю, удаляя все не соблюдают ткани стремление. После этого, подпиточный культуры два раза в неделю. Клетки образуют колонии, как правило, в течение 1-3 недель. После этих колоний достаточно велики, чтобы субкультуры (как только они достигают около 500 мкм), изолировать клоны, используя трипсин покрытие дисков клонирования.
   Подтвердите клеток на 100% фибробластов и свободной от других клеточных загрязнений при посеве образцов клеточной линии на стекло покровные и проведения иммуно-флуоресцентного окрашивания для фибробластов маркер (FSP), эпителиальных маркеров (пан-цитокератин) и эндотелиальные клетки маркером (фон Willenbrand фактора VIII).
6. Прохождение первичного нормальных яичников фибробластов (NOF) клетка выделяет из одного блюда P100 P100 на 3 блюд за один день до ретровирусной трансдукции hTERT. Готовые вирусных супернатанты могут быть куплены или собственного производства с использованием стандартных протоколов для совместной трансфекции клеток HEK293T (см.целевых = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
   Ретровирусные супернатанты могут быть получены с использованием pBABE-гигро-hTERT вектор (Addgene). Удалить NoFS из инкубатора, а затем аспирации среду клеточной культуры. Добавьте 3 мл вирусного супернатанта к каждому блюду: одно блюдо получает hTERT-ретровирусов, ^2-й блюдо получает GFP-ретровирусов и третье блюдо не получает вирус. Перекрытие вирусных супернатантов с INOF-GM содержащие полибрен, чтобы дать конечной концентрации 8 мкг / мл. Re подачи клеток на следующий день со свежей средой. Через два дня после инфекции, начинается выделение низкой дозе (10 ед / мл) гигромицину В. После семи дней эта доза может быть увеличена до 20 Ед / мл; выбор должен быть завершен в течение 10-14 дней.
7. Клоны, экспрессирующие hTERT или GFP может быть выделен кольцо клонирование как только они достигают около 500 мкм. Клеточные линии требуют дополнительных характеристик для подтверждения успешной выражение hTERT и сохранение основных функций клеточной линии. Это включает в себя: (а)подтверждения активности теломеразы с помощью ПЦР-ИФА и длину теломер, по Саузерн-блот или ПЦР ^6,7; (б), подтверждающие выражения критических маркеров (например, иммуноокрашивания с анти-пан-цитокератин антитела для выявления эпителиальных клеток, и с анти- фибробластов поверхностный белок антител для фибробластов) схожи между первичным и hTERT-увековечил клеток; (с), подтверждающие клетки не проявляют свойства опухолевой трансформации (например, с помощью креплений независимых анализов роста), (г), подтверждающие продление срока службы в пробирке наблюдается в . клеток, экспрессирующих hTERT, но не GFP-экспрессирующих hTERT увековечили нормальных фибробластов яичников (INOFs) должны обойти репликативного старения, но не neoplastically трансформируются, дополнительно INOF клетки должны поддерживать выражение фибробластов поверхности белка, но не эпителиальные маркеры, такие как цитокератин (рис. 2) .

2. Покрытие из ткани КУЛЬТУРАБлюда с электронной PolyHEMA, не связанных с приверженцем культуры клеток

1. Для подготовки polyHEMA решение, взвесить 1,5 г polyHEMA, и место в стерильные бутылки. Добавить 95 мл молекулярной биологии класс абсолютного этанола и 5 мл клеточной культуры классе дистиллированной воды. Гидрогель polyHEMA будет растворяться в воде содержание решения, и этанол будет стерилизовать подготовки.
2. Поместите polyHEMA решение в водяной бане при температуре 65 ° С до полного растворения. Это может занять до 8 часов. Обратите внимание, что polyHEMA решения не могут быть сохранены в течение длительного периода времени и поэтому всегда должны быть готовы свежие.
   Устранение неисправностей: Решения polyHEMA требуют длительного времени инкубации при температуре 65 ° C. Регулярно инвертировать polyHEMA решение перемешать. Вязкость наблюдается в нижней части стеклянной бутылке указывается polyHEMA не полностью растворяются и дальнейшей инкубации при 65 ° C не требуется.
3. Рабочие в ламинарном потоке, пальто блюд культуре тканей с polyHEMA решение. Любой СИЗе тканевой культуре блюдо, колбу или многоямного пластины могут быть покрыты polyHEMA. Рекомендуемые объемы polyHEMA решения, необходимые для каждого судна приведены в таблице 2.
4. Разрешить блюд культуре клеток высохнуть внутри ламинаре. Это может занять 2-3 дня. Нежные качалки на качающейся платформе могут быть использованы для обеспечения равномерного покрытия больших размеров посуды или колбы. Если polyHEMA высыхает решение слишком быстро поверхности не может быть гладким. Чтобы избежать этого, убедитесь, что крышка блюдо / колбе остается на протяжении всего процесса сушки.
5. Нанесите второй слой polyHEMA и дать высохнуть, как описано выше.
   Устранение неисправностей: Дыры в покрытии polyHEMA может произойти, особенно когда пластины высохнуть слишком быстро. Двойное покрытие пластин с polyHEMA помогает покрыть щелей или трещин в покрытии, покрытые перед использованием. Плиты обычно занимает 2-3 дня для каждого polyHEMA пальто, чтобы высушить и так должна быть подготовлена ​​по крайней мере неделя, прежде чем они будут необходимы для клеточной культуры.
6. PolyHEMA покрытых пластинами может храниться при комнатной температуре до использования.

ПРИМЕЧАНИЕ: 1% агарозном решений, растворенного в 1X PBS и автоклавировать для стерилизации, также может быть использован для покрытия блюд культуры клеток для создания не соблюдают поверхности для краткосрочного 3D культивирования (менее одной недели). Агарозы покрытие мульти-луночных создает вогнутую поверхность, что способствует формированию единого сфероида на лунку для многих клеточных линий. Тем не менее, для более 3D культур polyHEMA покрытия рекомендуется в качестве агарозном покрытия часто распадаются после длительного культуры.

3. Создание трехмерной (3D) гетеротипические сфероидов и Re-кормление 3D культур

1. Восстановление и расширение INOF и эпителиальных клеточных культурах в пробирке подготовить достаточное количество клеток для создания 3D гетеротипические сфероидов. Для «массовой культуры» мы обычно семена 2-4х10 ⁶ INOFs в P100 блюдо и 0,5-1x10 ⁶ эпителиальные клетки, чтобы дать стромальных: эпителиальные РАTiO 4:1. INOF клетки выращивают в питательной среде INOF (INOF-GM) без гентамицина или амфотерицин В. При желании, фибробластов клетки могут быть предварительно до 3D-культуры (например, для индукции старения, клетки можно лечить с помощью суб-летальной дозы перекиси водорода ).
2. Мытье сухих пластин polyHEMA с 5 мл фосфатно-солевым буфером (PBS) в течение 5 мин. Аспирируйте PBS и заменить 15 мл INOF-GM.
3. Между тем, trypsinize увековечили нормальных клеток фибробластов яичников, чтобы отделить их от культуры блюдо, через 3-5 мин нейтрализации трипсина с равным объемом культуры, средств массовой информации и осаждения клеток путем центрифугирования при 450 мкг в течение 5 мин.
4. Удалите супернатант. Создание одной клеточной суспензии ресуспендированием осадок клеток в 5 мл INOF-GM, хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз или встряхиванием мягко. Определить концентрацию клеток путем смешивания 10 мкл клеточной суспензии и 10 мкл трипанового синего и перечисления с помощью гемоцитометра. Трипанового синего исключения можно использоватьD для идентификации живых клеток.
5. Добавить 4x10 ⁶ клеток INOF в среду уже разливают в polyHEMA покрытием пластины. Макияж объем культуральной среды до 20 мл с помощью соответствующего объема свежего INOF-GM и инкубировать при 37 ° C, 5% CO _2. Клетки начинают агрегировать в многоклеточных сфероидов в течение 24 часов. Сфероид образование можно контролировать с помощью фазовой микроскопии.
   Точный подсчет сфероида номера под массой условиях культуры трудно, но мы считаем, что мы получим 50-100 сфероидов, когда 4x10 ⁶ стромальные клетки высевают. Сфероид размеров обычно составляет от 80-250 мкм.
6. Повторной подачи сфероида культур каждые 2-3 дня, отдыхая пластины под углом на пипеткой помещают в ламинарном боксе. Разрешить сфероиды, чтобы обосноваться. Это может занять до 20 мин. Осторожно снимите истощенных средах с 5 мл пипетки, пока только приблизительно 4 мл остаются в блюдо. Будьте осторожны, не аспирацию сфероидов. Re подачи с 16 мл свежего INOF-GM и вернуться в инкубаторе.
7. На 7-й день, добавить эпителиальных клеток фибробластов сфероидов для создания гетеротипические культур следующим образом. Подготовка суспензии яичников эпителиальных клеток (фенотипически нормальных или трансформированных) трипсинизацией как описано в разделе 3.4-3.5. Определить концентрацию клеток с помощью гемоцитометра. Мыть раз в INOF-GM, чтобы предотвратить любые факторы роста от того, перенесенные из эпителиальных СМИ роста.
   В нашей лаборатории нормальной поверхности эпителиальных клеток яичника (OSEC) линии были собраны с информированного согласия пациента от удалены яичники по общей абдоминальной гистерэктомии или полной лапароскопической гистерэктомии с двусторонней придатков матки. Яичники были щеткой с стерильной цитощеточка собрать эпителия. Первичные клеточные линии были установлены и трансдуцированных hTERT, используя подход, описанный выше. Подробная информация о OSEC культуры в 2D, 3D и OSEC увековечение можно найти в ссылках 10 и 11.
8. Для формирования гетеротипические SPHeroids, в первую повторной подачи культурах фибробластов сфероидов в одиночку. Затем прививку фибробластов сфероида культур с 1x10 ⁶ клеток эпителия в соотношении 4:1 фибробластов эпителиальных клеток. Культура гетеротипические сфероидов в INOF-GM.
9. Re кормить гетеротипические культур каждые 2-3 дня в течение дополнительных 14 дней.

4. Обработка изображений и молекулярные анализы

1. Многие различные методы могут быть использованы для анализа гетеротипические сфероидов. Для обработки изображений, рекомендуется, чтобы сфероиды собирают из культуры блюдо с 25 мл пипетки. Пипетирование медленно сведет к минимуму шансы на поперечных сил нарушая архитектуру сфероида. Сфероидов можно мыть в PBS и осаждали центрифугированием осторожно при 100 мкг в течение 10 мин; выше центробежной силы может привести к повреждению сфероидов. Кроме того, культуры могут быть переданы в 50 мл трубки сокола и дают отстояться, а рост средних затем удаляются.
   1. Для иммуногистохимическогохимия, исправить сфероиды с нейтральным буферном растворе формалина в течение 30 мин при комнатной температуре. Пелле сфероидов и заменить формалин с 70% этанола. Процесс в парафин с использованием стандартных протоколов, используемых для тканей человека. Парафиновые сфероидов может быть срезы и окрашивали либо гематоксилином и эозином или специфических молекулярных маркеров с использованием стандартных иммуногистохимии (рис. 3).
   2. Кроме того, сфероиды промывают в PBS может быть установлена ​​в 4% параформальдегид (подготовлен в PBS), встроенный в оптимальной температуры резания октября среднего и замораживали для замороженных срезов и иммунофлуоресцентного окрашивания.
2. Для молекулярных анализов, сфероиды могут быть собраны, осаждали и промывали дважды в PBS до лизиса клеток для ДНК, РНК или белков добычи.
3. Для анализа с помощью проточной цитометрии, сфероиды можно мыть в PBS и диссоциированных трипсином или accutase пищеварения при 37 ° C. Чтобы сделать это, погрузите трубку Сокол содержащий сфероиды япа водяной бане для облегчения трипсинизации. Полная диссоциация сфероидов в одной клеточной суспензии можно стимулировать с помощью пипетки раствор вверх и вниз с 1 совет мл пипетки. Будьте осторожны, не более-trypsinize клеток.

Нейтрализовать реакции с равным объемом культуральной среде и удалить сгустки клетки, передавая суспензии через сито 40-70 мкм клетки. Пелле клетки, промывают PBS, перечислить и ресуспендируют нужное количество клеток в буфере FACS. Пятно клеток в соответствии с инструкциями производителя.

5. Представитель Результаты

Этот подход может быть использован для широкого спектра приложений, а также для изучения биологии нормальных яичников, а также исследование яичников начало рака. Основное преимущество этого подхода над 3D-культуры, созданные с использованием коммерчески доступных внеклеточный матрикс геля является то, что нормальные фибробласты яичников производят внеклеточный матрикс, что делает иP ядро ​​сфероидов. По нашему опыту, матрицы материала, произведенного нормальных фибробластов яичников является гетерогенной и больше напоминает внеклеточного матрикса яичников, чем любой имеющийся в продаже матрицы геля. В нашей лаборатории мы использовали эпителиальные клетки, которые были частично превращается в пробирке с использованием определенных генетических элементов (например, CMYC гиперэкспрессия) и со-культурный этих клеток с нормальным и стареющих фибробластов яичников, чтобы имитировать ранней стадии рака яичников в период после менопаузы яичники. Наши данные свидетельствуют, что старение микроокружения опухолевых способствует функций (например, распространение) частично превращается эпителиальные клетки (рис. 3), в то время как нормальные микроокружения опухолевых тормозит прогресс ^8. Наша лаборатория и другие, также используются аналогичные подходы к моделированию нормальных эпителиальных клеток яичника ^9, маточные трубы эпителиальных клеток, поэтапной модели опухолевого прогрессии ^11-13, как однотипных сфероида культур. Мы заметили, что гистологические особенности нормальных и злокачественных клеток, которые не обнаруживаются, когда клетки культивировали в виде монослоев будут восстановлены, когда клетки перешли в сфероид культуры. Например, гистологические признаки рака яичников ясно клетки могут быть обнаружены в 3D культур ясно клетки рака яичника клеточных линий (рис. 4), но не в однослойных культурах те же клетки. Кроме того, 3D культивируемые клетки более точно отражать конкретные ткани экспрессии белка видели в первичных тканей по сравнению с аналогичным клетки культивировали в традиционном 2D однослойные культуры ^9-11. Эти подходы к моделированию нормальных и злокачественных тканей яичников также представляют собой ценный инструмент для открытия и функциональный анализ романа кандидата рака яичников генов-супрессоров и онкогенов и другие молекулярные биомаркеры, которые могут быть связаны с ди-Сиз развитию ^10,14.

Рисунок 1. Схематическое представление о протоколе для 3D гетеротипические культивирования. Колбах культуры ткани в два раза покрыты 1% polyHEMA решения и дают высохнуть. PolyHEMA покрытием пластики промывают 1x PBS непосредственно перед использованием. Увековечен нормальных яичников фибробластов (4x10 ⁶ клеток) помещали в колбу с 20 мл среды роста. Сфероид формирования и роста мониторинг в течение 7 дней. На данный момент, культуру фибробластов сфероида засевают 1x10 ⁶ клеток эпителия и двух типов клеток совместно культивировали в течение 14 дней до многоклеточных сфероидов собраны и обработаны для последующего применения (молекулярного анализа, визуализации и т.д.).

Рисунок 2. Иммунофлуоресценции окрашивания hTERT </ EM> увековечили нормальных фибробластов яичников. Оба первичных нормальных фибробластов яичников (Pr NoFS) и увековечил нормальных фибробластов яичников (INOFs) выражают фибробластов специфического белка (FSP), не выражают цитокератин-7 (Ck-7) и экспресс-виментина (VIM) . Маркеры интерес показаны зеленым цветом, ДНК окрашивали DAPI и показаны синим цветом, цитоплазма контрастно с голубыми Эвана и показаны красным цветом.

Рисунок 3. Иммуногистохимия совместного культурного стромальных и эпителиальных клеток. Левая панель, нормальные фибробласты яичников сфероида монокультуры, окрашивали гематоксилином и эозином. Нормальные клетки фибробластов яичников культивировали только в 3D сфероидов форму, состоящую из клеток с веретенообразной-морфологии и обильные внеклеточного матрикса. Справа: нормальные фибробласты яичника подвергались воздействию перекиси водорода, чтобы вызвать старение. Частично трансформируются яичников эпителиальных клеток (IOSE CMYC клеток значительно больше, чем тех же клеток до старения индукции (до стареющей, PSN). Родительский IOSE клетки без CMYC гиперэкспрессия не показывают разницу в пролиферации при совместном культивировании с PSN или SEN фибробластов. Эти данные позволяют предположить, чтоВ нашем в пробирке совместного культивирования модели, процессы старения в строме яичников может способствовать развитию ОК ^11. * Р ≤ 0,05, двусторонний парный Т-тест.

Рисунок 4. Гистологические особенности 3D культивируемых клеток отражает основной ткани. (A) Clear рака яичников клетки отличаются характерным четких структур клетки, они отсутствуют, когда четкие EOC клетки, выращенные на пластик, но подобные структуры обнаруживаются, когда же клетки выращивают как 3D сфероиды ( B). (C) сканирующего электронного микроскопа нормальных эпителиальных клеток яичника выращивают как сфероидов в течение 14 дней. Поверхность микроворсинки видны (стрелки). (D) Серозный рак яичников сфероидов клеточной линии, в культуре. (A, B) гематоксилином и эозином секционного парафин ткани опухоли или 3D сфероиды; (C) сканирующей электронной микроскопии; (D) фазовый контраст микроскопии. Сфероидов может быть сферической (штриховые окружности)или неправильной формы, как и в случае структуры увидеть в левой части изображения.

Блюдо / Размер плиты	Объем PolyHEMA (будет использоваться в два раза)	Культура СМИ конечного объема
6-луночный планшет	3 мл	5-7 мл
12-луночный планшет	1,5 мл	2 мл
24-луночный планшет	500 мкл	1,5 мл
48-луночный планшет	250 мкл	500 мкл
96-луночный планшет	50 мкл	200 мкл
P100 культуры блюдо	4-5 мл	20 мл
P60 культуры блюдо	2-3 мл	5-7 мл
F25 колбу	2-3 мл	7 мл
F75 колбу	4-5 мл	20-30 мл
F175 колбу	15 мл	30-50 мл

Таблица 2. Рекомендуемые объемы polyHEMA покрытие и 3D культивирования.

Обсуждение

Биология ранней стадии эпителиального рака яичников (EOC) еще плохо изучены. Возможно, одним из основных препятствий в этой области на протяжении многих лет было отсутствие понимания ткани конкретные истоки болезни, и о значимости роли микроокружения в EOC развития. За последние несколько лет, стало ясно, что EOC является гетерогенным заболеванием с несколькими различными подтипами histophathological, возможно, с различными клеточными происхождения для различных подтипов. Например, текущие данные свидетельствуют о том, ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагент	Поставщик	Номер по каталогу
PolyHEMA, пригодных для клеточной культуры	Sigma Aldrich	P3932
Молекулярная биология этанола класса	Sigma Aldrich	E7023
Стерильная вода для клеточных культур	VWR	12001-356
MCDB105	Sigma Aldrich	M6395
Среда 199	Sigma Aldrich	M2154
Hyclone эмбриональной бычьей сывороткой	Thermo Scientific	SH30088.03
гентамицина	Sigma Aldrich	G1397
Амфотерицин	Sigma Aldrich	A2942
pBABE-гигро-hTERT	Addgene	1773
PBS	VWR	12001-766
0,25% трипсина-EDTA	Invitrogen	25200-072
Сотовый фильтр (40 или 70 мкм)	VWR	21008-949 21008-952
Anti-фибробластов поверхностного белка антитела, клон 1B10	Сигма	F4771
Anti-пан-цитокератин антител (C11)	Санта-Крус	SC-8018
Полибрен (hexadimethrine бромид)	Сигма	107689
TeloTAGGG теломеразы ПЦР ИФА PLUS	Roche	12013789001
TeloTAGGG теломер Анализ длина	Roche	12209136001