Методическая статья

Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

DOI:

10.3791/4208

⸱

1 октября 2012 г.

 ,  ,  ,  , 
1Center for Inflammatory Bowel Diseases, Division of Digestive Diseases, David Geffen School of Medicine, The University of California Los Angeles, Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансплантация костного мозга дает возможность изменить генотип костного мозга клетки. Если ген интерес выражается как в костном мозге клеток, полученных и не полученных костного мозга клеток, трансплантация костного мозга может изменить костного мозга клеток разного генотипа без изменения без костного мозга клетки генотипа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы понять роль генов в развитии колита, мы сравнили ответы мышей дикого типа и ген интересов, дефицитных мышей нокаутом колит. Если ген интересов, выражается и в костном мозге клеток, полученных и не полученных костного мозга клеток хозяина, однако можно дифференцировать роль интересующего гена в костном мозге клеток, полученных и не костного мозга клеток, полученных из костного технику трансплантации костного мозга. Для изменения костного мозга клетки генотипа мышей, оригинальный костный мозг получателя мышей были уничтожены путем облучения, а затем заменяются новыми костного мозга донора различных генотипов. Когда мышей дикого типа донора костного мозга пересаживают на мышах, мы могли бы генерировать нокаутных мышей дикого типа экспрессия генов в клетках костного мозга, полученных клеток. Кроме того, при нокаутных мышей-доноров костного мозга пересаживают в дикий тип получателя мышей, мышей дикого типа без гена интересов, выражающийиз костного мозга клеток, полученных были произведены. Тем не менее, пересадка костного мозга не может быть на 100%. Таким образом, мы использовали кластер дифференцировки (CD) молекул (CD45.1 и CD45.2) в качестве маркеров донора и реципиента клетки для отслеживания доли донорского костного мозга клеток, полученных в получатель мышей и успех трансплантации костного мозга. Дикого типа мышей с генотипом и CD45.1 нокаутных мышей с генотипом CD45.2 были использованы. После облучения получателя мышей, доноров клеток костного мозга различных генотипов вводили в получатель мышей. Когда новый костный мозг регенерировать взять на свой иммунитет, мышей заражали химического агента (декстран сульфат натрия, DSS 5%), чтобы вызвать колит. Здесь мы также показали способ, чтобы побудить колита у мышей и оценить роль генов интерес, проявленный из костного мозга, полученных клеток. Если ген интересов, от клеток, полученных из костного играет важную роль в развитии заболевания (такие как кишечнаяТИС), фенотип получателя мышей с трансплантацией костного мозга может быть существенно изменен. В конце колит экспериментов, костного мозга клеток в крови и костном мозге были помечены антитела против CD45.1 и CD45.2 и их количественное соотношение существование может быть использован для оценки успеха пересадки костного мозга методом проточной цитометрии. Успешная трансплантация костного мозга должны показать подавляющее большинство генотипа (в срок маркер молекулу CD) над получателем генотипа как в костном мозге и крови мышей получателя.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Перед тем, как начать-технического соображения

  1. Мы рекомендуем использовать как C57/BL6 мышей дикого типа и нокаутных мышей для эксперимента потому, что мыши с соответствующими молекулами CD можно приобрести у основных поставщиков мыши.
  2. Поскольку трудно отслеживать мышей дикого типа и нокаутных мышей, полученных донорских клеток после трансплантации костного мозга, необходимо использовать CD45.1 мышей представляют мышей дикого типа. (CD45.1 C57/SJL мышей дикого Jackson Laboratories складе # 002014).
  3. Большинство колоний мышь CD45.2. Наши мышей принадлежат CD45.2 генотипа (в качестве альтернативы CD45.2 WT источник мышей: Jackson Laboratories акции # 000664). Определение CD45.1 или CD45.2 генотип может быть выполнена с использованием проточной цитометрии костного мозга и периферической крови, как указано в статье 7 настоящего Протокола.
  4. Мыши после облучения привели к резкому снижению иммунитета. Держите мышей в патогенов центр.
  5. Работа облучатель требует специального безопасности clearancе и обучение. Для экономии времени на подготовку и утверждение процессов, то лучше сотрудничать с лабораторией с квалифицированным специалистом, который способен работать облучателя.
  6. Многие учебные заведения имеют лаборатории проточной цитометрии с опытными специалистами. Чтобы свести к минимуму проблемы с потоком операций цитометрии, то лучше, чтобы обсудить ваши проточной цитометрии план эксперимента с опытным специалистом, прежде чем начать.
  7. Мыши были распределены таким образом (10 мышей в группе):
Группа Костный мозг донора к реципиенту Лечение
BM обмен CD45.1 WT, чтобы CD45.2 KO DSS колит
Си Вода нормальный контроль
C BM обмен CD45.2 KO к CD45.1 WT DSS колит
Ре Вода нормальный контроль
Ми Фиктивный CD45.1 WT, чтобы CD45.1 WT DSS колит
Фа Вода нормальный контроль
Соль Фиктивный CD45.2 KO KO к CD45.2 DSS колит
H Вода нормальный контроль

* Краткая иллюстрация экспериментального протокола показан на рисунке 1.

2. Облучение Мыши-реципиенты

  1. Мыши разводятся и содержатся в патогенов без объекта. Место мышей в автоклаве пирог облучения с фильтром. Положите одну мышь в каждый слот облучения пирога. Поместить пирог в облучатель и убедитесь, что проигрыватель и пирог обращаются.
  2. Включите воздушный насосдля вентиляции. Закройте дверь и облучатель заблокировать его.
  3. Облучения мышей с 1.000 рад (что эквивалентно 10 Гр) около 10 мин (в зависимости от источника излучения и период полураспада). С этого момента времени, облученных мышей с ослабленным иммунитетом и имеют слабый иммунитет против инфекции. После облучения взять пирог, и поместить в стерильный контейнер для транспортировки биобезопасности кабинета в животное-центр. Избегайте воздействия на мышей к внешней среде, чтобы минимизировать вероятность заражения.
  4. В биобезопасности кабинета, передает мышей в автоклаве клетках мыши с автоклавного постельные принадлежности (4 мышей в клетке Добавить новую стерильную воду с подвеской sulfatrim -. 3,12 мл на 100 мл воды).
  5. Заверните бутылку воды с алюминиевой фольгой, как антибиотики чувствительна к свету. Встряхнуть, чтобы смешать бутылку sulfatrim решение перед загрузкой его в клетку.

3. Донор костного мозга добыча

  1. Жертва мышей с диоксидом углерода или isoflurANCE, а затем погружают в раствор лизола 1:200. Спрей мышей с 70% этанола для увлажнения кожи и анализировать открытые кости.
  2. Замочите рассечение инструментов в 70% этанола для стерилизации.
  3. Выполните рассечение в шкаф биологической безопасности. Используйте стерильные инструменты вскрытие, чтобы разоблачить плечевой кости, бедра, голени и малоберцовой костей, свободных от крепления мышц и связок.
  4. Разрежьте обоих концах костей, чтобы показать красный костный мозг. Держите кости щипцами. Промойте красного костного мозга с холодным PBS с 3 шприца мл и иглы 25G в чашку Петри. Промойте с обоих концов кости, чтобы дать больше клеток костного мозга.
  5. Используйте 6 мл шприцев и 18G1 / 2 иглы сломать красные разъемы костного мозга повторной аспирации и выброса. Передача костного мозга с 50 мл пробирок Falcon.
  6. Побочные костного мозга вниз в 1800 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант, ресуспендируют осадок встряхиванием в течение 5-10 сек.
  7. Развести в 10 раз буфером для лизиса РБК со стерильной водой. ОбъявлениеD 1X РБК буфера для лизиса (5 мл на мышь донора), вихрь снова в течение 5 секунд и держать ровно 3 мин при комнатной температуре.
  8. Через 3 минуты, заполнить трубы с 20 мл холодного PBS, чтобы остановить лизиса и перемешать. Вылейте содержимое через 40 мкм ячейки фильтра непосредственно в новый 50 мл трубки Falcon.
  9. Промойте оригинальных труб с 5 мл PBS и передать в камеру фильтра, а также. Долить до 50 мл PBS и перемешать.

4. Подсчет клеток костного мозга донора

  1. Добавить 100 мкл трипанового синего трубки Эппендорф и 100 мкл костного мозга для подвески трубки Эппендорф и перемешать. Внесите окрашенных смесью ячейки гемоцитометра.
  2. Количество клеток рассчитывается по общей жизни костном мозге клеток в Соколе трубы = неокрашенных номер ячейки в 16 квадратов х 2 (из-за разбавления трипанового синего) х 10000 х 50 мл
  3. Спином вниз клеток костного мозга в 50 мл пробирки Сокола на 2000 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C.
  4. Удалить супернатант. Основанныйот общего количества клеток, ресуспендируют осадок с PBS до 1 × 10 8 клеток на мл

5. Инфузионные получателей Мыши

  1. Теплый получателя мышей на тепло площадку и под потепления лампы. Положить получателя мышей в фиксатор. Вводят 1 х 10 7 клеток на мышь в 100-200 мкл внутривенно.
  2. Инъекции донора костного мозга должно быть сделано между 4-24 ч после облучения.
  3. Хранить до 4 вводили мышам в клетке. Поддерживать вводили мышам получателя в автоклаве клетки с антибиотиками-очищенной воды в течение первых 4 недель в патогенов объекта животного и пусть мышей восстановить иммунитет. Изменение клетках, обработанных антибиотиками воды и пищи каждые 4 дня для поддержания гигиены.

6. Индукция колита и оценки колит

  1. 4 недели после трансплантации костного мозга облучение и кости, переключиться на обычную воду без антибиотиков и поддерживать мышей в течение еще 2 недель, чтобы восстановить их нормальноемикрофлоры кишечника.
  2. 6 недель после инъекции костного мозга, измерение исходной массы тела. Некоторые мышам дали 5% сульфата декстрана в питьевую воду без ограничений объявление, чтобы вызвать колит. Некоторые мыши приведены регулярные питьевую воду только как нормальные контрольные группы.
  3. 5 дней спустя, снять периферической крови, передать гепарин покрытие труб (Vacutainer) и держать на льду. Бассейн кровь из 4 мышей в 1 трубу. Комбинат 300 мкл крови с 300 мкл клеточной окрашивания буфера = 600 мкл. Разделите крови до 5 Эппендорфа, каждый с 100 мкл.
  4. Жертва мышей с диоксидом углерода или изофлурана. Оцените макроскопические оценки ущерба (пожалуйста, обратитесь к другому JOVE публикации видео подробно 1). Измерьте изменение веса тела. Измерение длины кишечника и толщиной с цифровой суппорта. Соблюдайте стула текстуры (твердая, мягкая или кровавый). Определение скрытой крови в кале с Hemooccult. Проанализируйте толстой ткани и закрепить в формалине для H & E окрашивание.
  5. Проанализируйте 1 бедренной кости бопе на мышь, извлечения костного мозга и промойте костного мозга с холодным PBS через 25G иглу и шприц 1 мл. Бассейн 4 костного мозга подключается к 1 трубу и держать на льду.
  6. Залить костного мозга чашки Петри, сдвига вилки костного мозга с 18G иглу и шприц 5 мл несколько раз, пока не плагин костного мозга присутствует.
  7. Спином вниз с 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант и ресуспендируют с 600 мкл буфера для окрашивания клеток. Разделите ресуспендированных костного мозга до 5 Эппендорфа, каждый с 100 мкл.

7. Контроль качества трансплантации костного мозга с помощью проточной цитометрии

  1. На каждом образце трубы из крови или костного мозга № 1-5:
  2. Подготовьте смесь антител для каждой соответствующей трубы в темноте.

№ 1 нет антител
# 2 30 мкл FITC изотипа контроль + 30 мкл PE контроля изотипа + 15 мкл CD16/32 блокировки
# 3 30 мкл FITC CD45.1 Ab + 15 мкл CD16/32 блокировки
# 4 30 мкл PECD45.2 Ab + 15 мкл CD16/32 блокировки
# 5 30 мкл FITC CD45.1 Ab + 30 мкл PE CD45.2 Ab + 15 мкл CD16/32 блокировки

Добавить нечего крови или костного мозга образца № 1
Добавьте 5 мкл антител смесь № 2 к каждому крови или костного мозга образца № 2
Добавить 3 мкл антител смеси № 3 к каждому крови или костного мозга образца № 3
Добавить 3 мкл антител смеси № 4 к каждому крови или костного мозга образца № 4
Добавьте 5 мкл антител смесь № 5 к каждому крови или костного мозга образца № 5
  1. Хранить в темном во льду в течение 30 мин.
  2. Добавить 2 мл 1X РБК лизис буфера в каждую пробирку. Хранить в темном на льду в течение 15 мин.
  3. Спином вниз клетки при 1500 оборотах в минуту, 5 минут при 4 ° C. (GH 3,8 ротор, 1500 оборотов в минуту = 350 мкг) Удалите супернатант. Ресуспендируют гранул с 500 мкл буфера для окрашивания клетки в темноте, то вихрь кратко.
  4. Проверьте CD45.1 (представляющих WT) и CD45.2 (представляющих KO) в иммуноокрашиванию кровь и образцы костного мозга методом проточной цитометрии. Выберите FITC представляют WT CD45.1 и PE представляют KO CD45.2.
  5. Проанализируйте результаты проточной цитометрии программного обеспечения FlowJo. Рассчитать отношение FITC: PE или PE отношение: отношение FITC для определения генотипа является доминирующим генотипом в крови и костном мозге.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Если ген интересов, играет важную роль в иммунных клетках в процессе развития колита, мышей, получавших костного мозга различных генотипов по трансплантации костного мозга (WT, чтобы KO KO или в WT) должны иметь измененный ответ на DSS колит. Одним из наиболее важных параметров для определения тяжести колита H & E окрашивание толстой ткани. Толстой ткани структурные изменения и признаки воспаления могут быть количественно оценены H & E гистологии система подсчета очков. Критерии для H & E гистологии очки для...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это трансплантации костного мозга подход годится для иммунологии исследования колит, инфекции, рак, ожирение и другие заболевания. Это трансплантации костного мозга эксперимента необходима, когда ген интересов, выражается в обоих костного мозга и не костного мозга и клеток, полученных из генно-интересов, подозревается посредником заболевание клеток или от населения. Например, антимикробного пептида кателицидина показан для модуляции острого колита. Но это выражается как в эпителиальные клетки и клетки иммунной системы (...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась пилота и гранты технико-экономическое обоснование с UCLA-CURE центр, Крона и колит фонда Америки развития карьеры Award (# 2691) и Национального института здоровья NIDDK K01 (DK084256) финансирование Hon Вай Кун.

Костный мозг облучения операция была оказана помощь Бернард Левин и Скотт Кухня UCLA Центра исследований СПИДа мыши / человека Химера объекта Core. Операции проточной цитометрии помогал UCLA объекта основных вектора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге
Буфер сотовых окрашивания Biolegend # 420201
10X лизис буфера РБК Biolegend # 420301
FITC мыши контроля изотипа Biolegend # 400207
PE мыши контроля изотипа Biolegend # 400211
PE анти-мышиных CD45.2 Biolegend # 109807
FITC анти-мышиных CD45.1 Biolegend # 110705
Anti-мышь CD16/32 блокировки Biolegend # 101301
40 мкм фильтр клетке Fisherbrand # 22363547
PBS 1X MP Biomedicals # 1860454
Гепарин Fisherbrand # BP2425
Sulfatrim (СМЗ) QualiTest NC9242720 (Фишер)
Лизола IC Andwin Научные NC9745686 (Фишер)
Vaccutainer BD # 8000813
Мышь фиксатор Braintree Научные # TV-150
Облучатель JL Пастух и Associates Mark I 68A
Проточный цитометр BD BD FACSCanto II
Проточный цитометр пробирке Сокол # 352052
Цифровой суппорт Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult ИКТ Beckman Coulter G0328QW

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
  3. Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
  4. Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
  5. Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11(2011).
  6. Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
  7. Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
  8. Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145(2010).
  9. Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. Gut. , (2012).
  10. Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
  11. Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
  12. Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
  13. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
  14. Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Flow CytometryColitis InductionDextran SulfateCD45 1 CD45 2 MarkersWild Type MiceKnockout MiceBone Marrow IsolationHistology AnalysisCell Staining

Похожие статьи