Мы разработали новый подход к хирургическому интратрахеального введения биологически активных веществ в мышь плода. Маршрут доставки является более эффективным в ориентированных на легкие плода мыши, чем обычно используется внутри амниотической инъекций. Эта процедура на сегодняшний день не было описано в мышиной модели.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Новый хирургический подход к интратрахеального введения биологически активных веществ в фетальный модель мыши
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пренатальное легочное введение клеток, генов или фармакологических агентов может стать основой для новых терапевтических стратегий лечения различных генетических и приобретенных заболеваний. Помимо врожденных или наследственных патологий, требующих длительной экспрессии доставленного гена, потенциальными показаниями для применения данного подхода в будущем рассматриваются некоторые ненаследственные перинатальные состояния, при которых для достижения терапевтического эффекта достаточно краткосрочной экспрессии гена или фармакологического вмешательства. К заболеваниям-кандидатам для применения краткосрочной пренатальной терапии могут относиться транзиторный неонатальный дефицит сурфактантного белка B, вызывающий респираторный дистресс-синдром новорожденных1,2, или гиперксическое повреждение легких новорожденных3. К заболеваниям, требующим постоянной терапевтической коррекции, относятся муковисцидоз (CF)4, генетические варианты дефицита сурфактанта5 и дефицит α1-антитрипсина6.
В целом, важным преимуществом пренатальной генной терапии является возможность начать терапевтическое вмешательство на ранних этапах развития, в момент или даже до появления клинических проявлений у пациента, предотвращая тем самым непоправимый вред организму. Кроме того, органы плода характеризуются более высокой скоростью пролиферации клеток по сравнению с органами взрослых, что может обеспечить более эффективный перенос генов или стволовых клеток в плод. Более того, доставка генов in utero осуществляется в период, когда иммунная система организма еще не полностью сформирована. Следовательно, трансплантация гетерологичных клеток или восполнение дефицита нефункционального или отсутствующего белка его правильной версией не должны вызывать иммунную сенсибилизацию к клетке, вектору или продукту трансгена, что недавно было подтверждено как для клеточной, так и для генетической терапии7.
В настоящем исследовании мы изучили возможность прямого воздействия на трахею плода на мышиной модели. Данная процедура применяется на моделях более крупных животных, таких как кролики и овцы8, и даже в клинической практике9, однако до настоящего времени она не выполнялась на мышах. При изучении потенциала фетальной генной терапии генетических заболеваний, таких как CF, мышиная модель очень полезна в качестве первого подтверждения концепции благодаря широкой доступности различных трансгенных линий мышей, детально документированному эмбриогенезу и фетальному развитию, менее строгим этическим нормам, короткому сроку беременности и большому размеру помета.
Для воздействия на легкие плода грызунов были описаны различные пути введения, включая интраамниотическую инъекцию10-12, интрапульмональную инъекцию (под контролем УЗИ)13,14, а также внутривенное введение в сосуды желточного мешка15,16 или пупочную вену17. Наша новая хирургическая процедура позволяет исследователям вводить выбранный препарат непосредственно в трахею плода мыши, что обеспечивает более эффективную доставку в дыхательные пути по сравнению с существующими методами18.
Протокол
1. Спаривание Мыши для получения нужной стадии беременности
Время помощник беременных мышей NMRI так, что они 18 дней (E18) беременные (всего беременности E19.5) во время операции. До и после операции они размещены в верхней фильтр клетках при нормальной комнатной температуре и нормальном дневном свете со свободным доступом к воде и чау-чау.
2. Плод Интратрахеальное (IT) Инъекции (рис. 1)
- Первая представляет беременных мышей NMRI к общей анестезии с 1,5% изофлурана в смеси O 2 на 1,5 л / мин. Уровень ИФ зависит от возраста и штамм мышей, но в целом изофлурана должны быть на таком уровне, что ставит животных в состоянии наркоза. Затем положить беременную мышь на грелку (37 ° C) для поддержания температуры тела в течение операции.
- Вся хирургическая процедура осуществляется при помощи двух хирургов. Один хирург будет выполнять рассечение беременных мышей и последующего воздействия йэлектронной плода интратрахеального для инъекций. Второй хирург будет выполнять плода внутритрахеальной инъекции себе. Хирургическая процедура выполняется с использованием стерильных инструментов и асептики.
- Лечить живота с повидон йодид и выполнять срединная лапаротомия, чтобы разоблачить беременной маткой. Экстериоризироваться один рог матки во время и подсчитать количество беременных мешков. Один плод в рог операцию и выбраны на основе оптимальное положение для экстериоризации головки плода при последующих шагов. Наиболее подходящим плода выбирается визуализации через стенку матки. Нос головки плода должно указывать на хирурга, который будет вводить в трахею после экспонирования головки плода и фиксации его назад (как объясняется в следующем шаге 2,5).
- Первый проход 6-0 полипропилена (Prolene) кошелек строка шва около 1 см в диаметре, через стенку матки и плодных оболочек (мембран амниотическойе и теменной желточного мешка) на участках, где позже головки плода будут выставлены до конца. Этот шов держит плод закреплен внутри матки с плеч года. Затем, сделайте разрез в матке внутри кошелька строку примерно 0,8 см с помощью острых ножниц.
- Осторожно сожмите головы и шеи плода через гистеротомии. Потяните кисетный шов аккуратно плотно вокруг шеи и закрепить его в этом положении с 2 Micro-Mosquito щипцов. Головки плода содержится в гиперэкстензии по 5-0 полиглактин 910 (Викрил) шва на два пинцета помещают в рот вокруг верхней челюсти.
- Под стереоскопическим микроскопом зум (увеличение x10) трахеи плода визуализируется, сделав вертикальный разрез шеи острыми и тупыми рассечение. Разрез в области шеи составляет около 5 мм длиной. Это поверхностный разрез, в качестве основной ткани дальнейшее использование расчлененный тупой диссекции, чтобы достичь трахеи.
- под прямым контролем зрения через стереоскопического микроскопа масштаба, придать общим объемом 30 мкл вещества (например, флуоресцентные шарики или вирусный вектор) в трахею с использованием 50 мкл Стекло Гамильтон шприц с 30 G острой иглой. После удаления игл, минимальный отток закачиваемой жидкости обеспечивает правильное инъекций. Разрез не закрыта после инъекции.
- Чтобы заменить голову в матке, применяют мягкое давление на нос. Шее сначала идет обратно в матку, а затем голову. Нос идет в последнюю очередь. Затем закройте гистеротомии, затянув кошелек строку. Затем вводят в общей сложности около 0,5 мл физиологического раствора в амниотической полости, чтобы предотвратить маловодие. Чтобы это сделать, вставить иглу в разрез внутри кошелька строку. Затем закройте шов вокруг иглы, после чего вводят солевой. В последнем шаге, втянуть иглу, а затем полностью закрывающий рurse строку.
- Закрыть материнской брюшной стенки (брюшины и внутреннего и внешнего мышечного слоя) и кожи с 5-0 Викрил швом в двух отдельных слоев. После проникновения в разрез с 0,2% ксилокаин для послеоперационного обезболивания. Рекомендуется использовать бупренорфин (0,05 - 0,1 мг / кг подкожно или IP) для послеоперационного обезболивания. Ни профилактических токолитики и не используются антибиотики. Мышей держали на грелку (37 ° C), пока они полностью восстановлены (примерно 1 час).
3. Внутри плода амниотическая (IA) Инъекции
- См. 2.1
- Лечить живота с повидон йодид и выполнять срединная лапаротомия, чтобы разоблачить беременной маткой. Экстериоризироваться один рог матки во время и подсчитать количество беременных мешков.
- ИА инъекции могут быть выполнены на всех плодов, как это занимает меньше времени для выполнения. Кроме того, положение плода не является критическимкал по сравнению с интратрахеального инъекций. В стенке матки является полупрозрачным, плода структур, таких как голова, конечности и хвост и плацентарной позицию красиво видно.
- Используя ту же иглу и шприц, как указано выше (2,7), вводят 30 мкл вещества в непосредственной близости от плода уст. Это может быть сделано наиболее простым либо между головки плода и передних конечностей, или между нижними конечностями и хвостом. Впрыск осуществляется только после тщательного изучения положения иглы, чтобы ни плода структуры находятся в контакте с наконечником во время инъекции.
- Матка перемещаются в брюшной полости и брюшной стенки и кожи замкнутое, как описано выше (2,9).
4. Оценка Injected плодов и кросс-содействие
- Убийств плотины с использованием утвержденной эвтаназии методом 36 ч после вмешательства плода (в E19.5). Смещения шейных позвонков без дополнительныханестезии было бы лучшим способом, как и все другие формы эвтаназии, которые включают анестезию (например, изофлурана, пентобарбитал) будет обезболить или даже убить плод, который вы хотели бы избежать во все времена. Доставка оперированных-на плод с помощью кесарева сечения. Управлением плода выявлены в матку свою позицию. Амниотической мешки нумеруются, начиная с яичников конце двурогая матка.
- После родов, используются следующие критерии для оценки жизнеспособности плода: наличие (1) сердцебиение, (2) розовый цвет кожи (по сравнению с синюшным) и (3) спонтанные движения. Поместите только щенков соответствии с этими критериями в помете приемная мать, содержащий одну дневных щенков. По опыту мы знаем, что щенки со слабым сердцебиение, синюшный цвет кожи и / или минимальных спонтанных движений часто не выживают в связи с отказом от мусора приемной матери или материнская каннибализма.
- После родов ОFA видимых красителей с помощью ИТ или И.А. инъекции (например, красные флуоресцентные молекулы), можно обеспечить правильное введение присутствие этого красителя (розового цвета с красными впрыском fluospheres) в грудном отделе (путем прямой инъекции в легких после того, как инъекций, или при вдыхании в легкие после инъекции IA) или брюшной полости (через рот). Это возможно благодаря тому, что новорожденные мыши полупрозрачные позволяет в естественных условиях оценка легкие и желудок.
- Отметить правильно вводили щенков с китайскими чернилами подкожно выше хвоста основе. Поместите все щенки, которые отвечают требованиям, указанным в п. 4.2 в помете приемной матери.
- Для обеспечения максимальной принятия и выживания оперированных-на щенков, оставить не более 10 щенков в помете в общем приемная мать (оба своих 1 день старого щенков, а также поперечное способствовали щенков). Перед размещением оперированной-на щенкаа в помете приемная мать, охватывают их в субстрат из приемной матери, содержащие оба ее кала и мочи, чтобы замаскировать любой не-знакомые запахи.
- Поместите клетки в спокойной обстановке и не беспокоить помета в течение 12 часов (на ночь).
- На следующий день, тщательно оценить выживаемость содействие путем подсчета всех щенков, делая различие между щенками приемная мать и оперированных-на щенков (отмечены китайской тушью и в среднем меньше, чем другие щенков). Сведите к минимуму манипуляции время этих щенков, чтобы избежать отказа от матери и, чтобы избежать переохлаждения. В общем, если щенки не имеют никакого молока в желудке (который виден из-за полупрозрачной природы новорожденных щенков), прогноз очень плохой для дальнейшего выживания этих животных.
5. Представитель Результаты
Общая схема эксперимента представлена на FigurE 2.
Определение оптимальных объемов для инъекций интратрахеального
Чтобы определить оптимальный объем для ИТ-инъекция, мы эмпирически выбрали разные объемы от 10, от 20 до 30 мкл (п = 3/volume). Для облегчения обнаружения, мы решили придать красных флуоресцентных молекул (fluospheres, молекулярные зонды, Лейден, Нидерланды) размером 100 нм. После того, как инъекция в E18 старых плодов, легкие были собраны 24 час позже, фиксировали в 4% параформальдегид в течение ночи при 4 ° С и 6 мкм замороженных срезов были сделаны. Ядрами и нитей актина окрашивают Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Bornem, Бельгия) и Alexa Fluor 488 фаллоидином (Invitrogen, Merelbeke, Бельгия), соответственно в течение 20 мин при комнатной температуре. Конфокальной изображения были сделаны с помощью Biorad Сияние 2100 конфокальной микроскопии с LaserSharp2000.6 программного обеспечения Carl Zeiss. Относительной флуоресценции (отношение красного до синего флуоресценции представляет fluospheres и ядерной staininг, соответственно) были количественно, используя программное обеспечение для онлайн ImageJ (рис. 3). Хотя в то время эмбриональной хирургии, обратный был обнаружен только после введения 30 мкл, указывая на излишек жидкости вводят 30 мкл дал наибольшее количество флуоресцентного сигнала в паренхиме легких, как количественно путем измерения относительной флуоресценции (дисперсионного анализа , сравнения для каждой пары использованием Стьюдента-тест, * р <0,05, *** р <0,001).
Количественная оценка fluospheres в легочной ткани и биораспределения в желудочно-кишечном тракте
Далее, мы хотели сравнить эффективность таргетинга плода легких мыши после того, как в сравнении с IA инъекций. Для этого 30 мкл fluospheres были доставлены на плод легких мыши после либо он или IA инъекции в E18 беременных мышей NMRI (п = 5 в группе). ИТ-инъекция в результате значительно выше, доставка fluospheres в легких плода по сравнению с IA. Маршрут (1,43 ± 0,56 и 0,05 ± 0,02 относительной флуоресценции (отношение fluospheres к Hoechst соответственно, дисперсионного анализа, Стьюдента-тест, *** р <0,001) (рис. 4 переменного тока). Необработанные плоды контроля были использованы для нормализации флуоресцентные фонового сигнала. желудочно-кишечного тракта было положительным как для ИТ и И.А. вводили животным (рис. 4 г). нет красной флуоресценции наблюдается и в других тканях из обработанных плодов или в отрицательных контрольных животных (данные не показаны).
Сравнение интратрахеального и внутри амниотической после инъекции rAAV2/6.2 опосредованной доставки гена в легких плода
После сравнения двух методов доставки путем введения флуоресцентных молекул, мы хотели, чтобы оценить эффективность вирусной трансдукции и последующие экспрессию генов после того, как И. А. инъекции с использованием rAAV векторов. rAAV2/6.2 кодирования люциферазы светляков (флуктуации) (3x10 10 GC / плода)под контролем курица-β-актин (ЦБА) промотор вводят IT (N = 8) или IA (N = 6) в эмбриональных мышах NMRI на E18. После кесарева сечения и укрепления, сохранившиеся щенки были последовать неинвазивной визуализации биолюминесценции (BLI) и контроля за деятельностью флуктуации (фотонов / сек, р / с) на 1 неделю возрасте (рис. 5). Общий поток фотонов для ИТ-группы был значительно выше, чем в группе IA и отрицательный контроль (дисперсионного анализа, сравнения для каждой пары использованием Стьюдента-тест, * р <0,05). Средний сигнал BLI в группе IA не было значительно выше, чем в группе негативного контроля.
Различие между правильным и неправильным плода интратрахеального инъекций
Различие между правильным и incorrectI.T. Инъекция может быть оценено на нескольких уровнях. В то время точкой операции, во время инъекций в трахею плода, никакого сопротивления будет замечен, когда needlе расположены в трахею. Тем не менее, более высокое сопротивление будет замечен при введении в паратрахеальных пространстве. Во-вторых, при кесаревом сечении, как плод полупрозрачным, можно увидеть легкие, а затем наличии видимых красителей (например, китайская тушь, флуоресцентные молекулы). Последний вариант для оценки правильного инъекции оптическими изображениями и более конкретно биолюминесценции изображений. BLI это элегантная система неинвазивного последующей экспрессии гена-репортера люциферазы светлячка генов, но пространственное разрешение и анатомические информации ограничен. Магнитно-резонансная томография (МРТ) обеспечивает высокое разрешение, томографических изображений, содержащих подробное анатомическое информации. Поэтому мы исследовали сочетание BLI с МРТ для получения наложения изображения, который сочетает в себе сигнал с поверхности BLI визуализации глубоких анатомических структур (внутренних органов). Нашей целью было получить более подробную информацию в естественных условиях местногоции экспрессии генов, чтобы быть в состоянии отличить правильное от неправильного IT инъекций.
Комбинированные BL-МРТ были получены от нескольких животных, которым вводили ИТ с rAAV2/6.2 CBA-Fluc и CBA-LacZnls (3x10 10 GC / плода для каждого вектора, п = 10) на одну неделю возраста (рис. 6). BL изображений показал, сигнал исходящий от шеи и грудной области. Co-регистрация МРТ с BLI расположен экспрессии гена люциферазы в легочной регионе после правильного инъекции (рис. 6), но в области шеи и живота после неправильного введения (рис. 6 б). Гистологический анализ X-Gal окрашивание подтвердили в естественных условиях совместной регистрации.
Выживание после интратрахеального и внутри амниотической инъекций
- Fluorospheres
Выживание поставки E18 старых плодов NMRI вводят ИТ или IA с 30 мкл 100 нм красного fluorescenт молекул составил 100% в обеих группах и была определена как количество введенного плодов живы на момент сбора урожая, через 24 часа после хирургического вмешательства плода (табл. 1). - rAAV вектор
Выживание доставки плодов вводят ИТ или IA с rAAV2/6.2, которая определяется как количество плодов жив в момент времени кесарева сечения 36ч сообщение плода инъекции, составила 85,3% и 86,3%, соответственно (табл. 1). Ранняя неонатальная выживаемость составила 53,3% (ИТ) и 74,5% (IA), соответственно, и рассчитывается путем сопоставления количества детенышей живых 1 день после укрепления с начальным количеством плодов инъекции. Чтобы получить эти последние выживаемости, мы оптимизировали хирургического периоперационной процедуры протокола с помощью (1) ингаляционного наркоза изофлуран как вместо того, чтобы администрацией смеси кетамина (75 мг / кг, IP) и medetomidine (1 мг / кг IP) , (2) грелку, чтобы предотвратить переохлаждение во время операции, (3),стереоскопического микроскопа масштаба и (4) операторы становятся все более опытными с хирургической процедуры.
Рисунок 1. Интратрахеальное инъекции в E18 плода мышей. На этом рисунке основные этапы хирургического вмешательства для плода инъекции IT изображены. На первом этапе один рог матки является экстериоризации. На следующем этапе, кисетный шов проходит через стенку матки и плодных оболочек (амниотической мембраны и теменной желточного мешка) на участках, где позже головки плода будут выставлены до конца. Далее, головы и шеи плода экстериоризируется через гистеротомии, после чего головка плода содержится в гиперэкстензии по 5-0 полиглактин 910 шов на двух щипцов между челюстями. Под стереоскопическим микроскопом зум (увеличение x10) трахеи плода визуализируются путем вертикальной шее Incisионный острыми и тупыми рассечение. В последнем шаге, общим объемом 30 мкл вещества вводят в трахею под контролем зрения через стереоскопического микроскопа масштаба.
Рисунок 2. Общий обзор эксперимента.
Рисунок 3. Определение оптимальных объемов для интратрахеального инъекций. Чтобы определить оптимальный объем для ИТ-инъекций, 10, 20 или 30 мкл (п = 3/volume) красного fluospheres размером 100 нм вводили в E18 старых плодов и легкие были собраны 24 часа в сутки позже. Ядрами и нитей актина окрашивают Hoechst 33258 и Alexa Fluor 488 фаллоидином соответственно. Относительной флуоресценции (отношение красного до синего флуоресценции представляет fluosphERES и ядерное окрашивание соответственно) количественно, используя программное обеспечение для онлайн ImageJ. Среднее ± SD, дисперсионного анализа, сравнения для каждой пары использованием Стьюдента-тест, * р <0,05, *** р <0,001.
Рисунок 4. Количественная оценка fluospheres в легочной ткани и биораспределения в желудочно-кишечном тракте. 30 мкл красного fluospheres были доставлены на плод легких мыши после (а) или (б) И. А. инъекции в E18 беременных мышей NMRI сравнить эффективность адресности фетальных легких мыши. Необработанные плоды контроля были использованы для нормализации флуоресцентный сигнал фона. Ядрами и нитей актина окрашивают Hoechst 33258 и Alexa Fluor 488 фаллоидином, соответственно. (С) относительной флуоресценции (отношение красного до синего флуоресценции представляет fluospХерес и ядерное окрашивание соответственно) количественно, используя программное обеспечение для онлайн ImageJ. (г) желудочно-кишечного тракта было положительным как для ИТ и И.А. вводили животным. Среднее ± SD, дисперсионного анализа, Стьюдента-тест, *** р <0,001. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 5. Сравнение интратрахеального и внутри амниотической после инъекции rAAV2/6.2 опосредованной доставки генов в крови плода легких. BLI сигнала на 1 неделю после инъекции rAAV2/6.2 (3 × 10 10 GC / плода CBA-флуктуации) с соответствующей количественной оценки общего потока фотонов . Все животные были отсканированы, разделенных черной перегородки, чтобы избежать рассеяния фотонов в соседних животных. Масштабы псевдо изображает поток фотонов в секунду, На квадратный сантиметр на стерадиан (P / S / см 2 / ср). Измерения были получены в 4,3 см 2 прямоугольных области интереса. Среднее ± SD, дисперсионного анализа, сравнения для каждой пары использованием Стьюдента-тест, * р <0,05. Рисунок адаптированы из Карлон и соавт., 2010. Перепечатано с разрешения из Macmillan Publishers Ltd: [Molecular Therapy] (DOI: 10.1038/mt.2010.153), авторского права (2010). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 6. Различие между правильным и неправильным плода внутритрахеальной инъекции после rAAV2/6.2 опосредованной доставки генов в крови плода легких. Комбинированный BL-МРТ были получены от нескольких животных, которым вводили ИТ с rAAV2/6.2 CBA-Fluc и CBA-LacZnls (3x10 10 GC / плод для каждого Vectoг) на одну неделю возраста. BL изображений показал, сигнал исходящий от шеи и грудной области. Co-регистрация МРТ с BLI расположен экспрессии гена люциферазы в легочной регионе после правильного введения (а), но в области шеи и живота после неправильного введения (б). Гистологический анализ подтвердил в естественных условиях совместной регистрации. Шкала бар = 100 мкм. Фигурное адаптированы из Карлон и соавт., 2010. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
| Инъекции веществ | Метод впрыска | Выживание доставки | Выживаемость содействие б | Ранняя неонатальная выживаемость с |
| fluospheres | IT | 100 (8/8) | не доступно | не доступно |
| Айова | 100 (5/5) | не доступно | не доступно | |
| rAAV2/6.2 | IT | 85,3 (64/75) | 62,5 | 53,3 (40/75) |
| Айова | 86,3 (44/51) | 86,4 | 74,5 (38/51) |
Таблица 1. Выживание после ПЛОДА интратрахеального и внутри амниотической инъекций. Выживание до поставки, т.е. после фетальной хирургии и при кесаревом сечении, до укрепления. Щенки были б только поощряется, если они были розовыми, двигаться, дышать нормально. С ранней неонатальной выживаемости выражается в зависимости от начального количества щенков инъекции. Сокращения: IT Интратрахеальное инъекций; И.А. Intra-амниотической инъекций; НС не применяется.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги
- Мыши штамма мы решили работать только NMRI мышей, потому что они имеют обильное количество щенков (средний размер помета 14,4 ± 1,8, собственные данные), терпит вмешательства хорошо и имеют хорошие материнские характеристики.
- Размещение кошелек строку через стенку матки и плодных оболочек является важным шагом, как вы только хотите, чтобы разоблачить головки плода, а не на плечах, в противном случае позиционирование практически невозможно без причинения травмы.
- Оптимальное ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
MC и AVdP являются научных сотрудников поддержана грантами Института продвижения инноваций по науке и технологиям во Фландрии (ВВТ-Vlaanderen). JT имеет неполный клинической стипендий исследований (Кур) от UZ Левен. DV является докторской диссертации поддержана грантом от KU Leuven, DBOF/10/062. ММДЦ является докторской диссертации поддержана грантом от Conselho Насьональ де Pesquisa электронной Desenvolvimento (CNPq) и Erasmus Mundus. Исследование было профинансировано ВВТ-Vlaanderen, ЕК грант DIMI (LSHB-CT-2005-512146) и в естественных условиях Molecular Imaging Research Group (IMIR) от KU Leuven. Мы хотели бы отметить UPenn основных векторных основана Джеймсом М. Уилсон в своем роде подарок AAV6.2 упаковки плазмиды для производства вектор rAAV.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (по желанию) |
| NMRI мышей | Janvier, Le Genest Санкт-Isle, Франция | ||
| Isoflurane | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Милтон Кейнс, Великобритания | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Бельгия | ||
| Викрил 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Бельгия | ||
| 50 мкл Hamilton стеклянный шприц, модель 1710,5 TLLX SYR | Гамильтон, Рено, Невада, США | 5495-20 | |
| Острой иглой 30G | Гамильтон, Рено, Невада, США | 7762-03 | |
| 2% ксилокаин | AstraZeneca, Zoetermeer, Нидерланды |
Ссылки
- Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
- Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
- Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
- Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
- Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
- Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
- Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
- Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
- Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
- Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
- Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
- Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
- Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
- Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
- Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
- Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
- Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
- Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
