Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Нейронных культур эксплантов от

12.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4232

⸱

15 октября 2012 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Культивирование нейронных эксплантов от расчлененного Xenopus Хепориз Эмбрионов, которые выражают флуоресцентных белков слияния позволяет изображений конуса роста динамики цитоскелета.

Аннотация

Сложный процесс руководства аксонов в значительной степени обусловлено ростом конус, который является динамическим подвижные структуры на кончике растущего аксона. Во время аксона результат, рост конуса должна включать различные источники информации руководства кия, чтобы модулировать ее цитоскелета того, чтобы продвинуть вперед конуса роста и точно перемещаться, чтобы найти его конкретных целей 1. Как эта интеграция происходит на уровне цитоскелета только формируется, и изучение цитоскелета, белки и эффектор динамику в пределах конуса роста может позволить выяснение этих механизмов. Xenopus конусов Хепориз роста достаточно большие (10-30 мкм в диаметре) для выполнения высокой разрешение изображений живых динамики цитоскелета (например, 2-4) и легко изолировать и манипулировать в лабораторных условиях по сравнению с другими позвоночными. Лягушка является классическим модельной системой для развития исследований нейробиологии, и важно раннее понимание рост микрофон конусаrotubule динамика изначально были найдены с помощью этой системы 5-7. В этом методе 8, яйца собирают и оплодотворенных в пробирке, вводили РНК, кодирующей флуоресцентно отмеченных белки цитоскелета слияния или другими конструкциями манипулировать экспрессии генов, а затем позволили разработать на стадии нервной трубки. Нейронные трубы изолированы путем рассечения, а затем культивируют, и рост шишек на перерастает нейриты загружаются. В этой статье мы расскажем, как выполнять этот метод, цель которой заключается в культуре Xenopus Хепориз конусы роста для последующих изображений с высоким разрешением анализ. Хотя мы и предоставляем пример + TIP гибридного белка EB1-GFP, этот метод может быть применен к любому количеству белков выяснения их поведения в конус роста.

Протокол

Примечание: Мы описываем действия, описанные в первых двух разделах только в краткой, так как отлично протоколы с подробной информацией были опубликованы в другом месте, что более конкретно об этих мерах (например, 8-12). Кроме того, общий протокол работы с Xenopus нейронов спинного мозга в живой культуре клеток был ранее опубликован в подробной статье методы 8. Мы настоятельно рекомендуем ознакомиться с этой статьей в качестве дополнения к этому видео, хотя и здесь мы предоставили достаточно информации для успешного выполнения и устранения нервного рассечение трубы и покрытия протокола в шаге 3.

1. Экстракорпорального оплодотворения из яйца Xenopus

  1. Получить яйца от самки лягушки, которые вводили хорионический гонадотропин (400 единиц / лягушки) 12-18 часа до сбора яиц. Сбор яиц в измененных Ringer 1X Марка раствора (MMR) (0,1 М NaCl, 2,0 мМ KCl, 1,0 мМ MgSO 4, 2,0 мМ CaCl 2, 5,0 мм HEPES, рН 7,4, 9).
  2. Оплодотворить яйца в пробирке с мясным яички, как описано выше 9.
  3. После по меньшей мере 20 минут, снимите пальто эмбриона желе путем инкубации эмбрионов в 2% цистеина в 1X MMR (доводят до рН 7,8 с помощью NaOH) в течение 3-5 мин. Промыть 0,1 X MMR (или 0,1 X MBS (модифицированный Saline Барта, 1X рецепт: 88 мм NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl 2, 1 мМ MgSO 4, 2,5 мМ NaHCO 3, 5 мМ HEPES, рН 7,8)) 3 -5 раз, и держать эмбрионы при комнатной температуре до инъекции, или, по желанию, место эмбрионов на 14-18 ° С, чтобы замедлить развитие.

2. Микроинъекция РНК

Примечание: в то время как мы используем инъекции РНК здесь, эти методы не ограничиваются РНК и ДНК, белков или модифицированных нуклеиновых кислот для генной манипуляции также могут быть использованы и были описаны ранее 12.

  1. До эксперимента, РНК для маркировки цитоскелета или других структур арэлектронной транскрибируется с линеаризованной ДНК с использованием шаблонов mMessage mMachine комплект (Ambion). мРНК требуют 5 'шапку и 3' полиаденилирования хвост, чтобы содействовать переводу и предотвращения деградации в эмбрионах. PCS2 + является широко используемым вектором для этой цели, и транскрипцию комплект входит крышка аналоговый во время реакции синтеза. Мы вновь приостановить транскрипции мРНК в нуклеазы DDH 2 0, на фондовом концентрации от 500 до 2000 нг / мкл, а затем быстрое хранения при температуре -80 ° C. Перед инъекцией, разбавленные РНК в DDH 2 0 до соответствующей концентрации для инъекций. Как только небольшой объем будет введен в эмбрионах, ресуспендирования в буфере не является необходимым. Наша конечная концентрация инъекции, как правило, 50-200 пг / п, в зависимости от конструкции, и мы обычно будет вводить до 4-п в зародыше, хотя во многих лабораториях традиционно вводят до 10 NL, что составляет примерно 1% от общего объема эмбриона. РНК могут быть токсичны в больших дозах, а доза в зародыше родовLLY колеблется от 10 мкг до 1 нг, хотя до 5 нг может быть терпимо в зависимости от конкретного гена и чистоты. Тем не менее, для работы с изображениями локализации белка, минимально возможном уровне должны быть введены, чтобы избежать чрезмерной экспрессии артефактов. РНК для EB1-GFP в этом протоколе используется при окончательном размере 250 пг на эмбрион.
  2. Подготовка иглы для инъекций, потянув капилляр с иглой съемник 9, наконечник диаметром ~ 0,2 мкм. С Саттер Р-87 Съемник, мы используем следующие настройки: тепло 644, тяга 125, скорость 70, время 250, но эти параметры различаются в зависимости от машины и должны быть заново отрегулировать после замены нити (мы в настоящее время используется 2,5 мм квадратная коробка нити, что составляет 2,5 мм). Под микроскопом, сломать кончик иглы с помощью пинцета под углом, чтобы создать перо-образную форму. Есть и другие методы для взлома и заполнения иглы для инъекций (например, 11,12), но мы заполняем иглу с РНК, создав небольшую каплю (0,5 - 1 мкл) к заднему концуиглу. Для microinjecting в эмбрионы, существует целый ряд коммерчески доступных систем впрыска, два наиболее распространенными из которых являются Pico-инжектор (Medical Systems), а Nanoject (Drummond Научный) (см. 11 для получения дополнительной информации). Мы используем PLI-100 Medical Systems Pico-форсунка, которая использует сжатый газ для цифровой установить период времени для того, чтобы доставить соответствует объемам nanoliter. Объем впрыска должен быть откалиброван для каждого нового микропипетки помощью микрометра, и время впрыска должны быть скорректированы для достижения желаемого количества вводили РНК.
  3. Место оплодотворенных эмбрионов на 1 - до 4-клеточной стадии в пластиковую чашку, содержащую 5% Ficoll в 0,1 X MMR. Холдинг эмбриона в месте с пинцетом или размещение в проведении платформа (пластиковые сетки, с ~ 1 мм сетки, присоединилась к нижней части блюда с пластилином или зубной воск), ввести желаемую громкость в животных бластомеров (см. шаг 2,1 Подробнее о инъекций томов). Распространение в несколько особъема всей эмбрион, по крайней мере, одной инъекции в каждое из животных бластомеров, чтобы получить более равномерное распределение (например, для 4-клеточной стадии эмбриона, мы обычно вводят 1-2 раз в каждую бластомеров, а в 2-клеточной стадии эмбриона, мы вводим 2-4 раз в каждую бластомеров). Благо ждать, пока 2-4 клеточной стадии является то, что вы обеспечиваете эмбрион начал расщеплять нормально. Однако, если время имеет существенное значение, вы можете начать в 1-клеточной стадии, с небольшой разницей в конечном результате, кроме нескольких эмбрионов нуждаются в инъекции. Старые эмбрионов на стадии могут быть использованы, а также, и это особенно полезно, если специфические типы клеток предназначены для инъекции, но, как мы обычно предпочитают более широкое выражение, мы вводим в младших эмбрионов уменьшить потребность в более многочисленных инъекций.
  4. Передача введенных эмбрионов в пластиковых блюдо, содержащее 0,1 X MMR и дать им возможность развиваться до стадии 20-23 13. Инкубируйте эмбрионов на 14 до 22 ° C в зависимости от желаемого SPEред развития. (Для рассечения нейронных трубы на следующий день, используйте ~ 22 ° C. Для послезавтра, использовать ~ 14 ° C)

3. Нейронные Dissection труб и покрытия

  1. Перед проведением вскрытия, подготовки блюд культуры 14. Во-первых, пальто покровные с достаточно решения 200 мкг / мл поли-лизина в PBS в бассейне на поверхности покровного стекла, либо Маттек или Lab-Tek блюд культуры и инкубировать в течение одного часа (в качестве альтернативы, можно использовать стеклянные покровные сидя насыпью в чашку Петри для последующего размещения на стеклах для работы с изображениями и иммуноцитохимия). Аспирируйте и мыть с избытком PBS 3 раза, и дайте высохнуть. Тогда пальто блюд с 10 мкг / мл ламинина в PBS (мы обычно используем 500 мкл на покровное, достаточно, чтобы бассейн на поверхности) в течение одного часа при температуре 37 градусов. Аспирируйте ламинин раствор и промыть 3 раза с избытком PBS, стараясь не допустить, чтобы ламинина покрытие поверхности стали подвергаться воздух. ЗаменяяPBS с электронной культуре средств массовой информации (50% Рингера, 49% L-15 средств массовой информации, 1% эмбриональной телячьей сыворотки, плюс 50 мкг / мл пенициллина / стрептомицина и гентамицина, рН 7,4 и фильтр стерилизованное). (Media Рингера, 115 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 10 мМ Hepes рН 7,4, 0,5 мМ EDTA). В то время как наш протокол использует средства массовой информации, следует отметить, что это обогащенный СМИ общие для старшего Xenopus сетчатки культур ганглий, где нейроны снизили энергию защищены. Молодые спинного культур шнур будет выживать и расти более чем на 24 часа в СМИ чистой Ringers без дополнительных факторов роста, и это действительно одно из преимуществ использования этой системы. Дополнительно: Добавить NT3 и BDNF (до конечной концентрации 25 нг / мкл) в культуральной среде, чтобы увеличить аксона вырост.
  2. В связи с изменчивостью выражения вводят мРНК, эмбрионы могут проявлять мозаика флуоресценции. Перед проведением вскрытий, экран эмбрионов на наличие флуоресценции, для выявления тех эмбрионов, которые EXPССГ флуоресцентного белка синтеза в нервной трубки. Место флуоресцентных эмбрионов на стадии 20-23 в агарозном покрытые пластиковой блюдо заполнены СМИ Штейнберг (58 мМ NaCl, 0,67 мМ KCl, 0,44 мМ Ca (NO 3) 2, 1,3 мМ MgSO 4, 4,6 мМ Трис, рН до 7,8, то автоклавного) 5. Для того, чтобы агарозном покрытием блюдо, пальто нижнюю часть пластиковой блюдо с расплавленным 1% агарозном в 0,1 X MMR, и пусть затвердевать. Это обеспечивает мягкую поверхность, так что повреждение не приходит в голову тонкой щипцы и вольфрамовой иглы, используемые во время последующих шагов рассечение. Вскрытие эмбрионов за этап 23 возможно, но это более сложный, как тканях придерживаться более тесно друг к другу и, следовательно, требуют более длительного лечения с коллагеназы.
  3. В рассекает сферу, удалить желточной мембраны с тонким пинцетом, а затем выделить весь спинной части эмбриона, сделав серию разрезов. Пока один щипцы удерживать эмбрион на месте, используйте второй, чтобы сделать разрез настороне эмбриона, чтобы открыть внутреннюю полость. Затем, с помощью щипцов и ущипнуть по ткани между спинной и брюшной половины эмбрионов, тем самым сокращая эмбриона в два раза, чтобы изолировать спинная часть, содержащую нервной трубки.
  4. Поместите спинного эксплантов в трубку Eppendorf с 2 мг / мл коллагеназы в средствах массовой информации Штейнберга в течение 15-20 мин на ротатор, чтобы ослабить ткани, а затем пипеткой спинного эксплантов в пластиковый агарозном покрытием блюдо с решением свежие Стейнберга. Кроме того, эксплантов может быть помещен в чашку Петри, содержащую коллагеназы решение в течение 15 мин, где весь рассечение могли бы быть выполнены.
  5. Используя пару щипцов, осторожно рассекают нервной трубки от спинного эпидермиса и вентральной хорды. Вставьте кончик пинцетом между эпидермисом и основной ткани и медленно вытяните назад эпидермиса, выявление нервной трубки под ним. Затем воспользуйтесь одним щипцы для хранения тканей и другое, чтобы скользить между кончикомнервной трубки и хорды. Наконец, используйте щипцы для удаления сомитов по обе стороны от трубы.
  6. Передача нервной трубки в агарозном покрытием блюдо наполнен культурой массовой информации, как описано в пункте 3.1.
  7. После сбора нескольких нейронных трубки, порежьте их на многочисленные кусочки (примерно 20, если вся труба изолирована), используя заостренный вольфрамовый иглы или пинцета, а затем пластины штук в культуре блюда заполнены средой (подготовлен в шаге 3,1), разводя эксплантов равномерно в строках.
  8. После покрытия, не двигаться блюд, потому что это нарушит присоединения клеток. Выдержите покрытие нейронных эксплантов трубки около 20-22 ° C. Мы обычно покидают блюдо из клетки на скамейке при комнатной температуре в течение ночи. Одним из преимуществ Xenopus Хепориз нейронов является то, что специальный инкубатор для культивирования клеток, регулирующий CO 2 уровня или температуры не требуется. Невриты и роста конусов можно наблюдать и отображаемого при комнатной температуре 12-24 Ч после посева, хотя результат может быть ускорена с добавлением факторов роста. В общем, выражение РНК или плазмиды продукта приведет к переменной выражение между клетками, и, следовательно, может быть целый ряд флуоресценции между уровнем экспрессии роста конусов. Мы наблюдали экспрессии РНК флуоресцентных белков сохраняются свыше 48 ч после посева, хотя это зависит от конкретной конструкции.

4. Представитель Результаты

После выполнения протокола, которые представлены на рисунке 1а, здоровые, правильно-расчлененные и культивировали нейронных эксплантов будет посылать многочисленные аксоны или нейритов в каждом направлении на ламинин / поли-лизин подложки, как показано на рисунке 1b. Конусов роста на концах аксонов может быть отображена либо DIC оптика, как показано на рисунке 1C, чтобы изображение общую динамику подвижности, или высокое разрешение флуоресцентной микроскопии для изучения лоcalization флуоресцентно-меченый белки цитоскелета, например, EB1-GFP показано на рисунке 1D.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Сводка экспериментальных протоколов и ожидаемые результаты. A) Протокол блок-схемы. Смотрите фильм для подробной информации о рассечение на 3 день. Вся нервная трубка должна быть поделена на примерно 20 одинаковых по размеру частей и распределены равномерно в строках на покровное. В этом мультфильме, ножницы изображены представляют резки ткани с тонкими щипцами. CG хорионический гонадотропин B) DIC изображение аксонов или невриты, растущие из эксплантов (эксплантов в верхнем левом углу). C) Высшее увеличения изображения конуса роста на верхушку растущего аксона. D) флуоресценции изображений микроскопии EB1-GFP в конус роста. Шкала бар 10 мкм. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Xenopus Хепориз нейронных эксплантов отправить нейритов в очень надежным способом, через 24 часа после покрытия на ламинин / поли-лизин подложку, если условия являются приемлемыми. При этом подложка, конусы роста очень подвижны и могут достичь аксона длиной до 1 мм, расширения во всех направлениях наружу от эксплантов, хотя типичные длины 100 мкм и более. Если нейриты не растут, Есть ограниченное количество причин, чтобы это было так. Одна возможность заключается в том, что нейронная эксплантов не правильно при...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Боба Фримена для обучения и Kirschner лабораторию для использования лягушка-центр и члены лаборатории Ван Vactor за поддержку. Мы благодарим Nikon Imaging Центр Медицинской школы Гарварда за помощью световой микроскопии для изображения на рисунке 1. Эта работа финансировалась в следующей редакции: АЯРБ NIH общение и NIH K99 общение с LAL, фундаментальной науки партнерства финансирования ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) для AEF, и NIH RO1 NS035909 для DVV

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу
Хорионический гонадотропин Серебряный химических лабораторий C-HCG-НА-10
Цистеин Sigma-Aldrich 52-90-4
mMessage mMachine комплект Ambion AM1340
Капиллярные Borosil иглы 1,2 мм (наружный диаметр) х 0,9 мм (ID) FHC 30-31-0
Ficoll Сигма F2637
Дюмон # 5 Biologie Inox пинцет Средства изобразительных наук 11252-20
Коллагеноз Sigma-Aldrich 9001-12-1
Маттек блюд Мат Tek корпорации P35G-1.5-14-C
L-15 Invitrogen 21083-027
Поли-L-ЛисиНебраска Сигма P-1399
Ламинин Сигма L2020
NT3 Сигма N1905
BDNF Сигма B3795

Ссылки

  1. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
  2. Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
  3. Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
  4. Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
  5. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
  6. Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
  7. Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
  8. Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
  9. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
  10. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890(2008).
  11. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
  12. Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
  13. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
  14. Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
  15. Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
  16. Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
  17. Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
  18. Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
  19. Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Нейронных культур эксплантов от
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.