Method Article

Аналитический инструмент, который количественно клеточные изменения морфологии от трехмерного изображения флуоресценции

DOI:

10.3791/4233

⸱

August 31st, 2012

 ,  , 
1Medications Development, Ernest Gallo Clinic and Research Center, University of California, San Francisco , 2Clinical Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of California, San Francisco , 3Translational Research Institute and the Institute for Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, Brisbane, Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали программную платформу, которая использует Imaris Neuroscience, ImarisXT и MATLAB для измерения изменений в морфологии неопределенная форма взята из трехмерного конфокальной флуоресцентной отдельных клеток. Этот новый подход может быть использован для количественной оценки изменений формы клеток после активации рецепторов и, следовательно, представляет собой возможный дополнительный инструмент для обнаружения наркотиков.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее распространенными программными инструментами анализа, доступными для измерения флуоресцентных изображений, являются двумерные (2D) данные, которые полагаются на ручные настройки для включения и исключения точек данных, а также компьютерное распознавание образов для поддержки интерпретации и результатов анализа. Все более важным становится возможность измерения флуоресцентных изображений, построенных на основе трехмерных (3D) наборов данных, чтобы иметь возможность уловить сложность клеточной динамики и понять основу клеточной пластичности в биологических системах. Сложные инструменты микроскопии позволили визуализировать 3D-флуоресцентные изображения за счет получения мультиспектральных флуоресцентных изображений и мощного аналитического программного обеспечения, которое реконструирует изображения из конфокальных стеков, которые затем обеспечивают 3D-представление собранных 2D-изображений. Усовершенствованные методы стереологии, основанные на дизайне, продвинулись от приближения и предположений исходной стереологии, основанной на моделях1, даже в сложных срезах тканей2. Несмотря на эти научные достижения в микроскопии, остается потребность в автоматизированном аналитическом методе, который в полной мере использует внутренние 3D-данные для анализа и количественной оценки сложных изменений в морфологии клеток, локализации белков и транспортировке рецепторов.

Современные методы, доступные для количественной оценки флуоресцентных изображений, включают Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) и Image J (NIH), которые обеспечивают ручной анализ. Программное обеспечение Imaris (Andor Technology, Белфаст, Северная Ирландия) предоставляет функцию MeasurementPro, которая позволяет вручную создавать точки измерения, которые могут быть размещены в объемном изображении или нарисованы на серии 2D-срезов для создания 3D-объекта. Этот метод полезен для измерения точек одним щелчком мыши, чтобы измерить расстояние между двумя объектами или для создания многоугольника, который охватывает интересующую область, но его трудно применять к сложным структурам сотовых сетей. Filament Tracer (Andor) позволяет автоматически обнаруживать 3D-нейроны, похожие на филаменты, однако этот модуль был разработан для измерения определенных структур, таких как нейроны, которые состоят из дендритов, аксонов и шипиков (древовидная структура). Этот модуль был гениально использован для проведения морфологических измерений ненейрональныхклеток3, однако выходные данные предоставляют информацию о расширенной клеточной сети с использованием программного обеспечения, которое зависит от определенной формы клетки, а не является клеточной моделью аморфной формы. Чтобы решить проблему анализа клеток аморфной формы и сделать программное обеспечение более подходящим для биологического применения, компания Imaris разработала приложение Imaris Cell. Это был научный проект совместно с Eidgenössische Technische Hochschule, который был разработан для расчета взаимоотношений между клетками и органеллами. В то время как программное обеспечение позволяет обнаруживать биологические ограничения, заставляя одно ядро на клетку и используя клеточные мембраны для сегментации клеток, оно не может быть использовано для анализа флуоресцентных данных, которые не являются непрерывными, потому что в идеале оно создает поверхность клетки без пустых пространств. Насколько нам известно, в настоящее время не разработан модифицируемый пользователем автоматизированный подход, предоставляющий морфометрическую информацию из 3D-флуоресцентных изображений, который позволяет получать клеточную пространственную информацию неопределенной формы (рис. 1).

Мы разработали аналитическую платформу с использованием основного программного модуля Imaris и Imaris XT, подключенного к MATLAB (Mat Works, Inc.). Эти инструменты позволяют проводить 3D-измерения ячеек без заранее определенной формы и с неоднородными компонентами флуоресцентной сети. Кроме того, этот метод позволит исследователям, которые обладают обширными знаниями в области биологических систем, но не знакомы с компьютерными приложениями, проводить количественную оценку морфологических изменений в клеточной динамике.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Трехмерная морфометрического анализа одной ячейке фенотипические изменения

  1. Эмбриональной почки человека (HEK293) клетки трансфицировали гемагглютинина (HA)-отмеченном кортикотропин рилизинг-фактор рецептора-2 (CRF-R2), G-белком рецептор (GPCR), как описано ранее 4, 5.
  2. Клетки лечить (без лечения, NT), стимулировали CRF-R2 эндогенных лигандов, кортикотропин рилизинг-фактор, CRF (1 мкМ, 30 мин), или предварительно с селективным CRF-R2 антагониста, анти-саувагин 30 (AS -30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов.
  3. Затем клетки фиксированы, проницаемость и обрабатывали анти-HA. CRF-R2 были визуализированы с помощью Alexa 594 нм сопряженных анти-мышиных (IgG 1) антител. DAPI был использован для визуализации сцены ядер митотической.
  4. Чтобы ограничить экспериментатор субъективности, условия эксперимента не были известны только после Изображения были получены и проанализированы.
  5. Мы приобрели изображенияа с фиксированной НЕК293 помощью план-апохромат 63x/1.4 масла ДВС объективных и Zeiss LSM 510 META конфокальной микроскопии связан с когерентной интегрированной двухфотонной лазерной системы, состоящей из Верди-V5 лазерных и Мира, 900-F лазерной системы.
  6. В процессе сбора данных, клетки были разграничены как по мультиспектральных срезов, 488 нм и 790 нм (~ 350 нм 2ph Ex.), Г-разбиения (0,5 мкм шагом), чтобы включить данные из ядерной мембраны к внешнему внеклеточных рецепторов конечностях.
  7. Флуоресценции данные впервые были обработаны с помощью Imaris, которая позволяет визуализировать и сегментации 3D наборов данных микроскопии и 3D-модели состоят из кубического вокселей был создан для морфометрического анализа.
    Тогда, Imaris XT модуль был использован для интерфейса Imaris с MATLAB язык компьютерную программу для определения координат места GPCR расширения.
    Для того чтобы учесть сотовой изменчивости, мы получили и проанализировали флуоресцентных изображений Takан из 22 клеток: отсутствие лечения (NT) (п = 7), агонистов (CRF) лечение (n = 8) и предварительной обработки с антагонистом (AS-30) до агонистов (п = 7) (рис. 2) .
    1. Область интереса (ROI) должна включать в себя одну ячейку, которая не находится в активной стадии митотического и не близко к другим клеткам. Таким образом, анализ будет включать в себя клетки с одним ядром и рецепторов расширения не возмущенной близости от других клеток.
    2. Ячеистая структура 3D впервые был реконструирован из мультиспектральных флуоресценции данных с использованием Imaris (v.7.1.1).
    3. Следуя алгоритму разработана Imaris, в первую поверхность рендеринга была использована для представления ядерной мембраны. Imaris будет определить, есть ли более одного ядра в ROI.
    4. Тогда пятна создания алгоритма была использована, чтобы найти CRF-R2 расширения. Места обнаружения была использована, поскольку она компенсирует фоновый шум и нерегулярные интенсивностисложная сеть аморфной формы клеток.
    5. Для максимального включения каждого блока флуоресценции обнаружения CRF-R2, диаметр пятна "был установлен до 0,2 мкм, что является наименьшей единицей в пределах изображения для различных экстраполировать информацию в форме измеряются интенсивности с использованием фильтра Гаусса. Пятно фильтрация была включена в местах автоматизированный процесс создания. Программное обеспечение, однако, дает пользователю возможность использовать фильтры, чтобы определить параметры.
    6. Чтобы избежать усечения данных, набор данных был преобразован из 8-битных (без знака) неподвижная точка, в 32-разрядные десятичные.
    7. Воксела данных интенсивности были обменены определить координаты данных с использованием Imaris XT модуля сопряжена с MATLAB и точное пространственное расположение каждого места была определена путем проведения расстояние преобразование с использованием ядерной мембраны в качестве точки отсчета (рис. 3).
  8. Полученные данные могут быть определены и представлены в графическом формате сТАТИСТИЧЕСКИЕ анализа. Сравнения между группами проводили с использованием двустороннего ANOVA и Bonferroni посттестовых. Данные представлены как среднее значение ± SD. Различия являются значительными в * р <0,05. Расчеты были сделаны с GraphPad Prism 5.02 (рис. 4).

2. Представитель Результаты

Чтобы продемонстрировать силу нашего подхода, мы количественно клеточные изменения, которые возникают в результате взаимодействия G-белком рецепторы (GPCRs) и кортикотропин рилизинг-фактор рецептора-2 (CRF-R2) с эндогенным лигандом CRF в трансфицированных НЕК293.

Мы показываем, что CRF-R2 рецепторы расположены в мембране плазмы и проект из конечных областей мембраны клетки (рис. 2A и кино 1). Использование обычных 2D анализ, можно обнаружить это подмножество внеклеточной CRF-R2 рецепторы только тогда, когда мы анализируем рецепторы адгезии роИнтс на стекло крышки. Следовательно, мы теряем любую другую информацию, полученную от г-уложены мультиспектральных данных (рис. 5).

Когда клетки обрабатывают с ХПН, внеклеточный рецепторов значительно снижается, как показано уменьшение расстояния пятна от плазматической мембраны. Они также перераспределяется преимущественно из конечных местах в ряде отдельных местах (2B рисунок и кино 2).

Эффект CRF на рецепторы мембраны распределения препятствует предварительной обработки с CRF-R2 специфического антагониста, antisavagine 30 (AS-30), и мы обнаружили, что CRF-R2 расширения не изменится (рис. 2C и кино 3).

Дистального распределения пятен, построенная в 5 мкм спектра цветом интервалов, используется для визуализации расстояния вокселей от ядерной мембраны. Никакого лечения и антагониста pretreatmЛОР (AS-30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов (CRF, 1 мкМ, 30 мин) не показывают значительное (нс) разница в GPCR сокращения. Лечение клеток с агонистом (CRF, 1 мкМ, 30 мин) постепенно уменьшается количество CRF-R2-содержащих вокселов по сравнению с отсутствием лечения, 0-5 мкм (нс), 6-15 мкм (** р < 0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005), или по сравнению с AS-30 лечения, 0-10 мкм (нс), 11-15 мкм (** р <0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005) (рис. 4).

figure-protocol-1
Рисунок 1. Схема имеющихся в настоящее время методов и их ограничений для анализа флуоресцентных изображений. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

figure-protocol-2
1) вторичные антитела; DAPI был использован для визуализации ядер. Изображения были получены с конфокальной лазерной сканирующей (CLS) микроскопом. Шкала бар 5 мкм.

figure-protocol-3
Рисунок 3. 3D-модель HEK293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2 восстанавливается CLS изображения с помощью Imaris программного обеспечения. Поверхность оказания ядра и места создания описания GPCR расширения превращается в мелкие пузырьки. Флуоресценции данные впервые были обработаны с помощью Imaris которая позволяет визуализировать и сегментации 3D набор данных микроскопии. Тогда, Imaris XT был использован для интерфейса Imaris с MATLAB. Воксела интенсивности были обменены наКоординаты места. Пятна спектр кодированием цвета (синий 0-5 мкм, зеленый, 6-10 мкм, желтый 11-15 мкм и красный> 15 мкм) представляют собой дистанционную форму ядерной мембраны. Масштаб 5 мкм.

figure-protocol-4
Рисунок 4. Графическое представление дистального распределения пятен построены в спектре цветов кодируется в 5 мкм интервалов используется для визуализации расстояния вокселей от ядерной мембраны. Никакого лечения и предварительной обработки с антагонистом (AS-30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов (CRF, 1 мкМ, 30 мин) не показывают значительное (нс) разница в GPCR сокращения. Лечение клеток с агонистом (CRF, 1 мкМ, 30 мин) постепенно сокращает расстояние число CRF-R2-содержащих вокселов по сравнению с отсутствием лечения 0-5 мкм (нс), 6-15 мкм (** р <0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005), или AS-30 лечения 0-10 мкм (нс), 11-15 мкм (** р <0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005).

figure-protocol-5
Рисунок 5. Ограничение 2D морфометрического анализа НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2. В середине плоского сечения клеток (3-4 мкм над стеклом покровное), показывающий центре ядра визуализируются с DAPI и HA-CRF-R2 исследовали с использованием анти-HA и визуализированы с помощью Alexa 488nm сопряженных анти-мышь (IgG 1) вторичный антитело и полученные с CLS показывает никакой разницы между (A) без лечения (NT) и (B) агонисты (CRF, 1 мкМ, 30 мин), а точки рецепторов адгезии значительно отличаются.

Фильм 1. Свободно вращающаяся 3D-модель в "превзойти" режим НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2, никакого лечения, для оценки сотовой различия между фенотипом рецепторных белков. Шкала бар от 5 до 20 мкм./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Фильм 2. Свободно вращающаяся 3D-модель в "превзойти" режим НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2, агонистов, ХПН (CRF, 1 мкМ, 30 мин), чтобы оценить сотовой различия между фенотипом рецепторных белков. Шкала бар от 5 до 20 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Фильм 3. Свободно вращающаяся 3D в "превзойти" режим НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2, предварительная обработка с антагонистом (AS-30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов (CRF, 1 мкМ, 30 мин ), чтобы оценить сотовой различия между фенотипом рецепторных белков. Шкала бар от 5 до 20 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы показали, что CRF лечении индуцированных значительные изменения в морфологии и расположение CRF-R2. Изменения в CRF-R2 ингибируется селективной очистки антагониста. Мы показали, что рецепторы изменений обнаружено не было и не может быть измерена с помощью стандартного 2D мультиспектральных методов. Возможность для изучения сложных 3D-изображения является критическим для включения сложности биологических параметров для морфометрического анализа. Мы смогли сделать 3D-измерений клетки без заранее определенной формы с не...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим биологических изображений Центр развития (BIDC), Университет Калифорнии, Сан-Франциско для использования Imaris, Imaris XT и Matlab. Мы благодарим В. Харазия для оказания технической помощи и на Генри, LK Флорен, Л. Саундэкс Дэйча за их вклад в редактирование рукописи. Эта работа была поддержана финансирование от штата Калифорния медицинских исследований по алкоголю и наркомании через UCSF в SEB, Национальные Институты Здоровья: 1R21DA029966-01 и NIH Быстрый награду трек на экран MLSMR коллекции SEB, UCSF школы фармации ( Деканат и клинической фармации) и Школы медицины (клинической фармакологии и экспериментальной терапии), чтобы CLHK.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Эмбриональной почки человека (HEK293) Американская коллекция типовых культур CRL-1573
Дульбекко изменения Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965118
Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) Invitrogen SH30070.03
AlexaFluor-488 (IgG2b) Invitrogen -11001
моноклональные анти-HA.11 (IgG 1) Covance 16B12
DAPI Vector Laboratories H-1200 ;
CRF Сигма C2917
Antisauvagine-30 (AS-30) Сигма A4727

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  2. Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262(2009).
  3. Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
  4. Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
  5. Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
  6. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
  7. Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
  8. Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
  9. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
  10. Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
  11. Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Fluorescence ImagingCellular Morphology AnalysisConfocal MicroscopyImaris SoftwareMATLAB IntegrationGPCR Receptor TrackingAutomated Morphometric QuantificationReceptor Trafficking AnalysisDrug Discovery AssayFluorescence Image Segmentation

Related Articles