Методическая статья

Аналитический инструмент, который количественно клеточные изменения морфологии от трехмерного изображения флуоресценции

14.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4233

⸱

31 августа 2012 г.

 ,  , 
1Medications Development, Ernest Gallo Clinic and Research Center, University of California, San Francisco , 2Clinical Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of California, San Francisco , 3Translational Research Institute and the Institute for Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, Brisbane, Australia

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали программную платформу, которая использует Imaris Neuroscience, ImarisXT и MATLAB для измерения изменений в морфологии неопределенная форма взята из трехмерного конфокальной флуоресцентной отдельных клеток. Этот новый подход может быть использован для количественной оценки изменений формы клеток после активации рецепторов и, следовательно, представляет собой возможный дополнительный инструмент для обнаружения наркотиков.

Аннотация

Наиболее распространенные программные инструменты анализа, доступные для измерения флуоресцентных изображений, предназначены для двухмерных (2D) данных и опираются на ручные настройки включения и исключения точек данных, а также на компьютерное распознавание образов для поддержки интерпретации и результатов анализа. Все более важным становится умение измерять флуоресцентные изображения, построенные на основе трехмерных (3D) наборов данных, чтобы иметь возможность зафиксировать сложность клеточной динамики и понять основы клеточной пластичности в биологических системах. Современные микроскопические приборы позволили визуализировать 3D-флуоресцентные изображения благодаря получению мультиспектральных флуоресцентных снимков и мощному аналитическому программному обеспечению, которое реконструирует изображения из конфокальных стеков, обеспечивая тем самым 3D-представление собранных 2D-изображений. Современные методы стереологии, основанные на дизайне, эволюционировали от аппроксимаций и допущений оригинальной стереологии, основанной на моделях1, даже в сложных срезах тканей2. Несмотря на эти научные достижения в микроскопии, сохраняется потребность в автоматизированном аналитическом методе, который в полной мере использует внутренние 3D-данные для анализа и количественной оценки сложных изменений морфологии клеток, локализации белков и трафика рецепторов.

Доступные в настоящее время методы количественного анализа флуоресцентных изображений включают Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) и Image J (NIH), которые обеспечивают ручной анализ. Программное обеспечение Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) содержит функцию MeasurementPro, позволяющую вручную создавать точки измерения, которые можно размещать на объемном изображении или рисовать на серии 2D-срезов для создания 3D-объекта. Этот метод полезен для однократного измерения расстояния между двумя объектами или создания многоугольника, охватывающего область интереса, однако его трудно применить к сложным структурам клеточных сетей. Filament Tracer (Andor) позволяет автоматически определять трехмерные нитевидные нейронные структуры, однако этот модуль был разработан для измерения определенных структур, таких как нейроны, состоящие из дендритов, аксонов и шипиков (древовидная структура). Данный модуль был успешно применен для морфологических измерений ненейронных клеток3, однако выходные данные предоставляют информацию о расширенной клеточной сети с использованием программного обеспечения, которое опирается на определенную форму клетки, а не на модель клетки аморфной формы. Чтобы решить проблему анализа аморфных клеток и сделать программное обеспечение более подходящим для биологических приложений, компания Imaris разработала Imaris Cell. Это был научный проект совместно с Eidgenössische Technische Hochschule, разработанный для расчета взаимосвязи между клетками и органеллами. Хотя программа позволяет учитывать биологические ограничения, принудительно назначая одно ядро на одну клетку и используя клеточные мембраны для сегментации клеток, она не может быть использована для анализа прерывистых данных флуоресценции, так как в идеале она выстраивает поверхность клетки без пустот. Насколько нам известно, в настоящее время не разработано ни одного автоматизированного подхода с возможностью модификации пользователем, который позволял бы получать морфометрическую информацию из 3D-флуоресцентных изображений и обеспечивал получение пространственной информации о клетках неопределенной формы (Figure 1).

Нами была разработана аналитическая платформа с использованием основного программного модуля Imaris и Imaris XT, сопряженного с MATLAB (Mat Works, Inc.). Эти инструменты позволяют осуществлять 3D-измерения клеток, не имеющих предопределенной формы и с неоднородными компонентами флуоресцентной сети. Кроме того, данный метод позволит исследователям, обладающим глубокими знаниями в области биологических систем, но не имеющим опыта работы с компьютерными приложениями, проводить количественную оценку морфологических изменений в динамике клеток.

Протокол

1. Трехмерная морфометрического анализа одной ячейке фенотипические изменения

  1. Эмбриональной почки человека (HEK293) клетки трансфицировали гемагглютинина (HA)-отмеченном кортикотропин рилизинг-фактор рецептора-2 (CRF-R2), G-белком рецептор (GPCR), как описано ранее 4, 5.
  2. Клетки лечить (без лечения, NT), стимулировали CRF-R2 эндогенных лигандов, кортикотропин рилизинг-фактор, CRF (1 мкМ, 30 мин), или предварительно с селективным CRF-R2 антагониста, анти-саувагин 30 (AS -30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов.
  3. Затем клетки фиксированы, проницаемость и обрабатывали анти-HA. CRF-R2 были визуализированы с помощью Alexa 594 нм сопряженных анти-мышиных (IgG 1) антител. DAPI был использован для визуализации сцены ядер митотической.
  4. Чтобы ограничить экспериментатор субъективности, условия эксперимента не были известны только после Изображения были получены и проанализированы.
  5. Мы приобрели изображенияа с фиксированной НЕК293 помощью план-апохромат 63x/1.4 масла ДВС объективных и Zeiss LSM 510 META конфокальной микроскопии связан с когерентной интегрированной двухфотонной лазерной системы, состоящей из Верди-V5 лазерных и Мира, 900-F лазерной системы.
  6. В процессе сбора данных, клетки были разграничены как по мультиспектральных срезов, 488 нм и 790 нм (~ 350 нм 2ph Ex.), Г-разбиения (0,5 мкм шагом), чтобы включить данные из ядерной мембраны к внешнему внеклеточных рецепторов конечностях.
  7. Флуоресценции данные впервые были обработаны с помощью Imaris, которая позволяет визуализировать и сегментации 3D наборов данных микроскопии и 3D-модели состоят из кубического вокселей был создан для морфометрического анализа.
    Тогда, Imaris XT модуль был использован для интерфейса Imaris с MATLAB язык компьютерную программу для определения координат места GPCR расширения.
    Для того чтобы учесть сотовой изменчивости, мы получили и проанализировали флуоресцентных изображений Takан из 22 клеток: отсутствие лечения (NT) (п = 7), агонистов (CRF) лечение (n = 8) и предварительной обработки с антагонистом (AS-30) до агонистов (п = 7) (рис. 2) .
    1. Область интереса (ROI) должна включать в себя одну ячейку, которая не находится в активной стадии митотического и не близко к другим клеткам. Таким образом, анализ будет включать в себя клетки с одним ядром и рецепторов расширения не возмущенной близости от других клеток.
    2. Ячеистая структура 3D впервые был реконструирован из мультиспектральных флуоресценции данных с использованием Imaris (v.7.1.1).
    3. Следуя алгоритму разработана Imaris, в первую поверхность рендеринга была использована для представления ядерной мембраны. Imaris будет определить, есть ли более одного ядра в ROI.
    4. Тогда пятна создания алгоритма была использована, чтобы найти CRF-R2 расширения. Места обнаружения была использована, поскольку она компенсирует фоновый шум и нерегулярные интенсивностисложная сеть аморфной формы клеток.
    5. Для максимального включения каждого блока флуоресценции обнаружения CRF-R2, диаметр пятна "был установлен до 0,2 мкм, что является наименьшей единицей в пределах изображения для различных экстраполировать информацию в форме измеряются интенсивности с использованием фильтра Гаусса. Пятно фильтрация была включена в местах автоматизированный процесс создания. Программное обеспечение, однако, дает пользователю возможность использовать фильтры, чтобы определить параметры.
    6. Чтобы избежать усечения данных, набор данных был преобразован из 8-битных (без знака) неподвижная точка, в 32-разрядные десятичные.
    7. Воксела данных интенсивности были обменены определить координаты данных с использованием Imaris XT модуля сопряжена с MATLAB и точное пространственное расположение каждого места была определена путем проведения расстояние преобразование с использованием ядерной мембраны в качестве точки отсчета (рис. 3).
  8. Полученные данные могут быть определены и представлены в графическом формате сТАТИСТИЧЕСКИЕ анализа. Сравнения между группами проводили с использованием двустороннего ANOVA и Bonferroni посттестовых. Данные представлены как среднее значение ± SD. Различия являются значительными в * р <0,05. Расчеты были сделаны с GraphPad Prism 5.02 (рис. 4).

2. Представитель Результаты

Чтобы продемонстрировать силу нашего подхода, мы количественно клеточные изменения, которые возникают в результате взаимодействия G-белком рецепторы (GPCRs) и кортикотропин рилизинг-фактор рецептора-2 (CRF-R2) с эндогенным лигандом CRF в трансфицированных НЕК293.

Мы показываем, что CRF-R2 рецепторы расположены в мембране плазмы и проект из конечных областей мембраны клетки (рис. 2A и кино 1). Использование обычных 2D анализ, можно обнаружить это подмножество внеклеточной CRF-R2 рецепторы только тогда, когда мы анализируем рецепторы адгезии роИнтс на стекло крышки. Следовательно, мы теряем любую другую информацию, полученную от г-уложены мультиспектральных данных (рис. 5).

Когда клетки обрабатывают с ХПН, внеклеточный рецепторов значительно снижается, как показано уменьшение расстояния пятна от плазматической мембраны. Они также перераспределяется преимущественно из конечных местах в ряде отдельных местах (2B рисунок и кино 2).

Эффект CRF на рецепторы мембраны распределения препятствует предварительной обработки с CRF-R2 специфического антагониста, antisavagine 30 (AS-30), и мы обнаружили, что CRF-R2 расширения не изменится (рис. 2C и кино 3).

Дистального распределения пятен, построенная в 5 мкм спектра цветом интервалов, используется для визуализации расстояния вокселей от ядерной мембраны. Никакого лечения и антагониста pretreatmЛОР (AS-30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов (CRF, 1 мкМ, 30 мин) не показывают значительное (нс) разница в GPCR сокращения. Лечение клеток с агонистом (CRF, 1 мкМ, 30 мин) постепенно уменьшается количество CRF-R2-содержащих вокселов по сравнению с отсутствием лечения, 0-5 мкм (нс), 6-15 мкм (** р < 0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005), или по сравнению с AS-30 лечения, 0-10 мкм (нс), 11-15 мкм (** р <0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005) (рис. 4).

figure-protocol-1
Рисунок 1. Схема имеющихся в настоящее время методов и их ограничений для анализа флуоресцентных изображений. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

figure-protocol-2
Рисунок 2. 3D мультиспектральных изображений флуоресценции HEK293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2 до и после агонистов и антагонистов лечение. Объединенные изображения, показывающие HA-CRF-R2-исследовали с использованием анти-HA и визуализированы с помощью Alexa 488 сопряженных анти-мышь (IgG 1) вторичные антитела; DAPI был использован для визуализации ядер. Изображения были получены с конфокальной лазерной сканирующей (CLS) микроскопом. Шкала бар 5 мкм.

figure-protocol-3
Рисунок 3. 3D-модель HEK293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2 восстанавливается CLS изображения с помощью Imaris программного обеспечения. Поверхность оказания ядра и места создания описания GPCR расширения превращается в мелкие пузырьки. Флуоресценции данные впервые были обработаны с помощью Imaris которая позволяет визуализировать и сегментации 3D набор данных микроскопии. Тогда, Imaris XT был использован для интерфейса Imaris с MATLAB. Воксела интенсивности были обменены наКоординаты места. Пятна спектр кодированием цвета (синий 0-5 мкм, зеленый, 6-10 мкм, желтый 11-15 мкм и красный> 15 мкм) представляют собой дистанционную форму ядерной мембраны. Масштаб 5 мкм.

figure-protocol-4
Рисунок 4. Графическое представление дистального распределения пятен построены в спектре цветов кодируется в 5 мкм интервалов используется для визуализации расстояния вокселей от ядерной мембраны. Никакого лечения и предварительной обработки с антагонистом (AS-30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов (CRF, 1 мкМ, 30 мин) не показывают значительное (нс) разница в GPCR сокращения. Лечение клеток с агонистом (CRF, 1 мкМ, 30 мин) постепенно сокращает расстояние число CRF-R2-содержащих вокселов по сравнению с отсутствием лечения 0-5 мкм (нс), 6-15 мкм (** р <0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005), или AS-30 лечения 0-10 мкм (нс), 11-15 мкм (** р <0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005).

figure-protocol-5
Рисунок 5. Ограничение 2D морфометрического анализа НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2. В середине плоского сечения клеток (3-4 мкм над стеклом покровное), показывающий центре ядра визуализируются с DAPI и HA-CRF-R2 исследовали с использованием анти-HA и визуализированы с помощью Alexa 488nm сопряженных анти-мышь (IgG 1) вторичный антитело и полученные с CLS показывает никакой разницы между (A) без лечения (NT) и (B) агонисты (CRF, 1 мкМ, 30 мин), а точки рецепторов адгезии значительно отличаются.

Фильм 1. Свободно вращающаяся 3D-модель в "превзойти" режим НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2, никакого лечения, для оценки сотовой различия между фенотипом рецепторных белков. Шкала бар от 5 до 20 мкм./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Фильм 2. Свободно вращающаяся 3D-модель в "превзойти" режим НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2, агонистов, ХПН (CRF, 1 мкМ, 30 мин), чтобы оценить сотовой различия между фенотипом рецепторных белков. Шкала бар от 5 до 20 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Фильм 3. Свободно вращающаяся 3D в "превзойти" режим НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2, предварительная обработка с антагонистом (AS-30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов (CRF, 1 мкМ, 30 мин ), чтобы оценить сотовой различия между фенотипом рецепторных белков. Шкала бар от 5 до 20 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы показали, что CRF лечении индуцированных значительные изменения в морфологии и расположение CRF-R2. Изменения в CRF-R2 ингибируется селективной очистки антагониста. Мы показали, что рецепторы изменений обнаружено не было и не может быть измерена с помощью стандартного 2D мультиспектральных методов. Возможность для изучения сложных 3D-изображения является критическим для включения сложности биологических параметров для морфометрического анализа. Мы смогли сделать 3D-измерений клетки без заранее определенной формы с не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарим биологических изображений Центр развития (BIDC), Университет Калифорнии, Сан-Франциско для использования Imaris, Imaris XT и Matlab. Мы благодарим В. Харазия для оказания технической помощи и на Генри, LK Флорен, Л. Саундэкс Дэйча за их вклад в редактирование рукописи. Эта работа была поддержана финансирование от штата Калифорния медицинских исследований по алкоголю и наркомании через UCSF в SEB, Национальные Институты Здоровья: 1R21DA029966-01 и NIH Быстрый награду трек на экран MLSMR коллекции SEB, UCSF школы фармации ( Деканат и клинической фармации) и Школы медицины (клинической фармакологии и экспериментальной терапии), чтобы CLHK.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Эмбриональной почки человека (HEK293) Американская коллекция типовых культур CRL-1573
Дульбекко изменения Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965118
Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) Invitrogen SH30070.03
AlexaFluor-488 (IgG2b) Invitrogen -11001
моноклональные анти-HA.11 (IgG 1) Covance 16B12
DAPI Vector Laboratories H-1200 ;
CRF Сигма C2917
Antisauvagine-30 (AS-30) Сигма A4727

Ссылки

  1. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  2. Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262(2009).
  3. Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
  4. Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
  5. Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
  6. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
  7. Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
  8. Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
  9. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
  10. Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
  11. Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ImarisMATLABGPCR

Похожие статьи