Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Glycan Профилирование Plant Cell стены полимеров с использованием Microarrays

14.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4238

⸱

17 декабря 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Australian Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of Botany, University of Melbourne, 2Plant Cell Biology Research Centre, School of Botany, University of Melbourne, 3CSIRO Plant Industry, Black Mountain Laboratories, 4Department of Plant Biology and Biotechnology, University of Copenhagen

В этой статье

Краткое содержание

Техника называется C Omprehensive M Icroarray P Olymer профилирования (CoMPP) для характеристики растений гликанов клеточной стенки описано. Этот метод сочетает в себе специфичность моноклональных антител, направленных на определенный гликана-эпитопы с миниатюрной микрочипов аналитическая платформа, позволяющая показ гликана вхождения в широкий спектр биологических контекстах.

Аннотация

Клеточные стенки растений представляют собой сложные матрицы из гетерогенных гликанов, которые играют важную роль в физиологии и развитии растений, а также служат источником сырья для человечества (например, в деревообрабатывающей, бумажной, текстильной и топливной промышленности)1,2. Тем не менее, понимание биосинтеза и функций этих компонентов по-прежнему остается сложной задачей.

Гликаны клеточной стенки химически и конформационно разнообразны из-за сложности их структурных единиц — гликозильных остатков. Они образуют связи в различных положениях и различаются по структуре кольца, изомерной или аномерной конфигурации, а также могут быть замещены различными несахаристыми остатками. Состав гликанов варьирует в зависимости от типов клеток и/или тканей или даже субдоменов одной клеточной стенки3. Кроме того, их состав изменяется в процессе развития1 или в ответ на воздействие факторов окружающей среды4.

Было предсказано, что более 2 000 генов участвуют в биосинтезе и модификации гликанов клеточной стенки Arabidopsis5. Однако функциональная характеристика была дана лишь для относительно небольшого числа биосинтетических генов 4,5. Применение подходов обратной генетики затруднено тем, что данные гены часто экспрессируются дифференциально, причем нередко на низком уровне, в зависимости от типа клеток6. Кроме того, исследования мутантов часто осложняются генной избыточностью или компенсаторными механизмами, обеспечивающими поддержание надлежащей функции клеточной стенки7. Таким образом, необходимы новые подходы для быстрой характеристики разнообразных структур гликанов и содействия методам функциональной геномики в понимании биосинтеза и модификации клеточных стенок.

Моноклональные антитела (мАТ)8,9 стали важным инструментом для определения структуры и распределения гликанов в растениях. Они распознают специфические эпитопы, присутствующие в основных классах гликанов клеточных стенок растений, включая пектины, ксилоглюканы, ксиланы, маннаны, глюканы и арабиногалактаны. В последнее время область их применения расширилась до крупномасштабных скрининговых экспериментов для одновременного определения относительного содержания гликанов в широком спектре типов растений и тканей9,10,11.

Здесь мы представляем метод скрининга гликанов на основе микрочипов, называемый комплексным профилированием полимеров на микрочипах (Comprehensive Microarray Polymer Profiling, CoMPP) (Рисунки 1 и 2)10,11, который позволяет проводить скрининг множества образцов (100 сек) с использованием миниатюризированной микрочиповой платформы с уменьшенным объемом реагентов и образцов. Сигналы пятен на микрочипе могут быть формально количественно определены для получения полуколичественных данных о наличии эпитопов гликанов. Этот подход хорошо подходит для отслеживания изменений гликанов в сложных биологических системах12 и обеспечения глобального обзора состава клеточной стенки, особенно когда предварительные сведения об этом отсутствуют.

Протокол

1. Коллекция тканей и подготовка

  1. Соберите 100 мг сырого веса ткани растений (минимум 10 мг сухого веса) по крайней мере в трех экземплярах для каждой ткани интерес. Следующие шаги описывают подготовку клеточного материала стены из растительной ткани. В случае хранения тканей, нежелательного крахмал ферментативно удалены прежде чем приступить к добыче полимеров клеточной стенки, как описано выше 13.
  2. Однородный образцов в мелкий порошок с жидким азотом использованием Qiagen TissueLyser II, с 24 трубка наборы и 3 мм из карбида вольфрама бисером (30 Гц, 2 х 30 сек). Либо, если только несколько образцов обрабатываются, ступка и пестик используются.
  3. Передача гомогенатах в 10 мл коническую пластиковых труб.
  4. Подготовить материал клеточной стенки, промывая гомогенатах в 10 мл 80% об / об этанола при комнатной температуре и встряхиванием энергично в течение 2 мин.
  5. Центрифуга образцов при 3500 мкг и отбросить супернатант. Повторите 70% этанола моет по крайней мере, три раза или до супернатант ясно, особенно для тканей, содержащих хлорофилл.
  6. Выполнение последней промывки со 100% ацетона и оставляют гранулы, содержащие алкоголь нерастворимых остатков (AIR) в воздушно-сухом ночь.
  7. Сито проб воздуха с 0,4 мм 2 сетки для достижения штрафа, однородный порошок и для удаления крупных, плохо измельченные частицы, которые иногда остаются в гомогената.
  8. Взвешивание 10 мг пробы воздуха в микропробирки, каждый из которых содержит 3 мм, стеклянная бусина, чтобы помочь перемешивания образцов.

2. Добыча Гликаны клеточной стенки

  1. Пектины, и полимеры, связанных с пектины выделяются из образцов путем добавления 500 мкл 50 мкМ CDTA (рН 7,5) в каждой пробе.
  2. Коротко вихревой трубы для обеспечения растворитель находится в контакте с образцом материала, а затем смешать помощью TissueLyser в течение 3 ч при 8 Гц.
  3. Центрифуга образцов при 12000 мкг, тщательно галить супернатанты и хранить при 4 ° C.
  4. Вымойте гранул в 1 мл деионизированной воды для разбавления и удаления остатков растворителя, вихрь и центрифуге при 13000 х г. Повторите этот шаг, не нарушая гранул и удалить всю жидкость из трубки, прежде чем переходить к следующему шагу.
  5. Сшивка гликанов последовательно извлечены из оставшихся клеточной стенки гранул с 500 мкл 4 М NaOH с 0,1% м / NaBH4, используя ту же процедуру, описанную в шагах 2,1 - 2,4 для извлечения CDTA. NaBH 4 добавляют к снижению альдегида (или кето) группы на сокращение конце полисахаридов с алкоголем тем самым предотвращая шелушение базе полисахаридов.
  6. После центрифугирования надосадочную жидкость снова снимается, хранится при температуре 4 ° С, а осадки промывают два раза в деионизированной воде, прежде чем переходить к следующей добычи.
  7. В качестве дополнительного шага, остаточная полимеры, такие как целлюлоза экстрагировали 500 мкл cadoxen (31% об / об 1,2-diaminoethane с 0,78 м CdO), используя ту же процедуру, как описано в пунктах 2.1 - 2.4. Кроме того, абсолютное целлюлозного содержание в оставшиеся гранулы можно определить с помощью уксусной / азотной анализов (см. обсуждение).

3. Печать Microarrays

  1. Центрифуга супернатантов, содержащих извлеченные полимеров клеточной стенки при 13000 мкг для удаления твердых частиц.
  2. Загрузите 50 мкл каждого образца в полипропилен 384-луночных планшет использованием заранее разработанных пользовательский макет, где образцы расположены в соответствии с типом ткани и добыча типа.
  3. Развести клеточной стенки полимера образца в 0, 5 и 25 × последовательный ряд разбавления деионизированной воды.
  4. Такие параметры, как высота контактный, сбор и время выдержки, и промывки устанавливаются на программное обеспечение управления microarrayer.
  5. Влажность печати камере контролируется на 60%, чтобы предотвратить испарение образца.
  6. Задание печати начали использовать LabNEXT SoftwaRe и программы, которые соответствуют макет микрочипов.
  7. Робот использует капиллярный канал контактов для печати Решения от образца пластину на 20 х 20 см нитроцеллюлозные мембраны, которая прикреплена к плоской пластине в машине. Каждое пятно на массив содержит 15 нл раствора и печатается в трех экземплярах.
  8. Идентичные микрочипы будут напечатаны рядом друг с другом на мембране и разрезать на отдельные массивы после выполнения задания печати завершена.
  9. В каждом эксперименте массивы могут быть модифицированы в целях удовлетворения более или менее образцов, разведения или репликации.

4. Зондирование Glycan Microarrays

  1. После печати блокировать отдельные микрочипы в 5% вес / объем сухого обезжиренного молока растворяют в фосфатном буферном растворе (MPBS) при комнатной температуре в течение 2 ч для уменьшения неспецифического связывания.
  2. Зонд микрочипов с помощью моноклональных антител, специфичных для клеточной стенки гликана эпитопов в течение 2 часов в MPBS. Большинство моноклональных Антибodies против гликанов клеточной стенки являются коммерчески доступными из трех компаний; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource Services ( www.carbosource.net ) и PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
  3. Включите отрицательного контроля, микрочип инкубируют только с MPBS и нет первичных антител.
  4. Вымойте микрочипов в 3 раза фосфатным буферным раствором (PBS) в течение 5 мин для удаления неспецифического связывания.
  5. Зонд микрочипы с вторичными антителами конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) в MPBS в течение 2 часов. Большинство моноклональных антител против гликанов клеточной стенки требуют анти-мышь или крысу анти-вторичными антителами.
  6. Повторите шаги стиральной 3 раза PBS буфера в течение 5 мин для удаления неспецифического связывания.
  7. Разработка микрочипов использованием хромогенного (3,3-диаминобензидина) или chemiluminecent (люминол) подложках.

5. Квантификация

  1. После разработки, сканировать отдельные микрочипы с использованием высокого разрешения (1200 точек на дюйм) настольный сканер и сохранять изображения как отрицательные, 16-разрядные файлы TIFF (рис. 3).
  2. Вычислить интеграл интенсивности каждой месте с помощью Xplore Image Processing Software (LabNEXT), оснащенный автоматизированным инструментом сетки. Интегральной интенсивности пятна, полученные от суммы пикселов в сетке окрестностях каждого пятна.
  3. Сетке данных для каждого микрочипов экспортируется в виде текстового файла и может быть вручную импортировать в электронную таблицу Excel для анализа. Онлайн-инструмент ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) была разработана для автоматического перевода и обработки данных из отдельных файлов TXT.
  4. Интегральной интенсивности пятна среднем по печати повторяет и разведения, чтобы получить "среднюю местеИнтенсивность 'значения для каждого образца (рис. 2). Кроме того, местная сигналы, соответствующие одной разведения значение в массиве используются для количественной оценки относительной эпитопа гликана изобилия для каждого образца.
  5. Относительная средняя интенсивность место между различными образцами представлены в виде HeatMap (рис. 4) с помощью условного форматирования в Excel или в Интернете heatmapper инструментов ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Данные для каждого типа антител корректируется до 100 и 5% пороговое значение накладывается для удаления фонового сигнала и ложных срабатываний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Относительное содержание гликанов в шести типов тканей (тычиночные нити, пыльца, яичников, лепестков, чашелистиков и стигма) из Nicotiana цветы Alata определяли с помощью CoMPP. 3А показывает представителя микрочипов, которые были исследовали с МАБ JIM5 специфичные для частичной (низкий) methylesterified homogalacturonan (HG), эпитоп, который происходит на пектиновые полисахариды 14. JIM5 эпитоп обнаружены в экстрактах CDTA всех цветов ткани, однако является самым высоким в пыльце и самая ни...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

CoMPP это быстрый и чувствительный метод для профилирования гликана составе сотни растительного происхождения образцов в течение нескольких дней. Этот метод дополняет уже имеющиеся бактерий и млекопитающих гликана платформ массив для высокопроизводительного скрининга углеводов взаимодействия с гликана-связывающие белки, такие как лектины, рецепторы и антитела 16. С большим разнообразием датчиков для обнаружения гликанов клеточной стенки, можно получить подробную информацию о эпитопов гликана принадлежащие ко ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

IEM хотел бы отметить датского исследовательского совета (FTP и FNU) для финансирования. ERL признает, поддержка ARC DP гранта. AB благодарит за поддержку АРК центра передового опыта в завод грант клеточных стенок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
3 мм из карбида вольфрама бисера Qiagen 69997
Коллекция микропробирок (1,2 мм) Qiagen 19560 Пробирки на 1,5 мл микроцентрифуге также может быть использована
Qiagen TissueLyser II Qiagen 85300
3 мм стеклянные бусины Sigma Aldrich Z143928
CDTA Sigma Aldrich 34588
Кадмий оксид Sigma Aldrich 202894
1,2-диаминоэтана Sigma Aldrich 03550
Нитроцеллюлозные мембраны (0,22 мкм размер пор) GE воды и технологических процессов EP2HY00010 различных размеров пор мембраны подходят для различных типов контактных
Xact II microarrayer робот Labnext 001A Xact II робот был оснащен пользовательской 20 х 20 см керамическая пластина, к которой нитроцеллюлозные мембраны прилагается
Xtend RM контакты микрочипов Labnext 0037-350 контакты должны быть пригодны для кровянистые выделения на мембранах
384-луночные планшеты для микротитрования (полипропилен) Greiner 781207
Anti-гликанов моноклональных антител Завод зонды /
CarboSource / Biosupplies 		Сайты, PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "целевых =" _blank "> www.carbosource.net) и Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ).
Anti-IgG крысы (целая молекула) - пероксидазой антитела производятся в козла. Сигма A9037 Тип вторичные антитела зависит от первичных антител использовали (например, подняли крысы, мыши, козы и т.д.).
SIGMA БЫСТРО 3,3 '-диаминобензидина таблетки Сигма D4293 Тип развивающихся реагента зависит от вторичных антител используется и метод обнаружения (colourmetric, или chemiluminecent).
SuperSignal Запад Pico хемилюминесцентный субстрат Thermoscientific 34080 см. выше
Xplore программное обеспечение для обработки изображений LabNext 008 многие виды программного обеспечения с автоматической гриддинга инструменты доступныДля измерения Значение пикселя микрочипов пятна.
Растительных полисахаридов Sigma / Megazyme
TR>

Ссылки

  1. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
  2. Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
  3. Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
  4. Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
  5. Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
  6. Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
  7. Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
  8. Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).
  9. Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
  10. Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
  11. Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
  12. Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506(2011).
  13. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , In Press (2012).
  14. Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
  15. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
  16. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
  17. McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
  18. Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
  19. Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
  20. Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
  21. 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
  22. Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
  23. Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
  24. Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
  25. Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CDTA
Glycan Профилирование Plant Cell стены полимеров с использованием Microarrays
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.