Техника называется C Omprehensive M Icroarray P Olymer профилирования (CoMPP) для характеристики растений гликанов клеточной стенки описано. Этот метод сочетает в себе специфичность моноклональных антител, направленных на определенный гликана-эпитопы с миниатюрной микрочипов аналитическая платформа, позволяющая показ гликана вхождения в широкий спектр биологических контекстах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Glycan Профилирование Plant Cell стены полимеров с использованием Microarrays
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клеточные стенки растений представляют собой сложные матрицы из гетерогенных гликанов, которые играют важную роль в физиологии и развитии растений, а также служат источником сырья для человечества (например, в деревообрабатывающей, бумажной, текстильной и топливной промышленности)1,2. Тем не менее, понимание биосинтеза и функций этих компонентов по-прежнему остается сложной задачей.
Гликаны клеточной стенки химически и конформационно разнообразны из-за сложности их структурных единиц — гликозильных остатков. Они образуют связи в различных положениях и различаются по структуре кольца, изомерной или аномерной конфигурации, а также могут быть замещены различными несахаристыми остатками. Состав гликанов варьирует в зависимости от типов клеток и/или тканей или даже субдоменов одной клеточной стенки3. Кроме того, их состав изменяется в процессе развития1 или в ответ на воздействие факторов окружающей среды4.
Было предсказано, что более 2 000 генов участвуют в биосинтезе и модификации гликанов клеточной стенки Arabidopsis5. Однако функциональная характеристика была дана лишь для относительно небольшого числа биосинтетических генов 4,5. Применение подходов обратной генетики затруднено тем, что данные гены часто экспрессируются дифференциально, причем нередко на низком уровне, в зависимости от типа клеток6. Кроме того, исследования мутантов часто осложняются генной избыточностью или компенсаторными механизмами, обеспечивающими поддержание надлежащей функции клеточной стенки7. Таким образом, необходимы новые подходы для быстрой характеристики разнообразных структур гликанов и содействия методам функциональной геномики в понимании биосинтеза и модификации клеточных стенок.
Моноклональные антитела (мАТ)8,9 стали важным инструментом для определения структуры и распределения гликанов в растениях. Они распознают специфические эпитопы, присутствующие в основных классах гликанов клеточных стенок растений, включая пектины, ксилоглюканы, ксиланы, маннаны, глюканы и арабиногалактаны. В последнее время область их применения расширилась до крупномасштабных скрининговых экспериментов для одновременного определения относительного содержания гликанов в широком спектре типов растений и тканей9,10,11.
Здесь мы представляем метод скрининга гликанов на основе микрочипов, называемый комплексным профилированием полимеров на микрочипах (Comprehensive Microarray Polymer Profiling, CoMPP) (Рисунки 1 и 2)10,11, который позволяет проводить скрининг множества образцов (100 сек) с использованием миниатюризированной микрочиповой платформы с уменьшенным объемом реагентов и образцов. Сигналы пятен на микрочипе могут быть формально количественно определены для получения полуколичественных данных о наличии эпитопов гликанов. Этот подход хорошо подходит для отслеживания изменений гликанов в сложных биологических системах12 и обеспечения глобального обзора состава клеточной стенки, особенно когда предварительные сведения об этом отсутствуют.
Протокол
1. Коллекция тканей и подготовка
- Соберите 100 мг сырого веса ткани растений (минимум 10 мг сухого веса) по крайней мере в трех экземплярах для каждой ткани интерес. Следующие шаги описывают подготовку клеточного материала стены из растительной ткани. В случае хранения тканей, нежелательного крахмал ферментативно удалены прежде чем приступить к добыче полимеров клеточной стенки, как описано выше 13.
- Однородный образцов в мелкий порошок с жидким азотом использованием Qiagen TissueLyser II, с 24 трубка наборы и 3 мм из карбида вольфрама бисером (30 Гц, 2 х 30 сек). Либо, если только несколько образцов обрабатываются, ступка и пестик испол....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Относительное содержание гликанов в шести типов тканей (тычиночные нити, пыльца, яичников, лепестков, чашелистиков и стигма) из Nicotiana цветы Alata определяли с помощью CoMPP. 3А показывает представителя микрочипов, которые были исследовали с МАБ JIM5 специфичные для частичной (низкий) methylesterified homogalacturonan (HG), эпитоп, который происходит на пектиновые полисахариды 14. JIM5 эпитоп обнаружены в экстрактах CDTA всех цветов ткани, однако является самым высоким в пыльце и самая ни.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
CoMPP это быстрый и чувствительный метод для профилирования гликана составе сотни растительного происхождения образцов в течение нескольких дней. Этот метод дополняет уже имеющиеся бактерий и млекопитающих гликана платформ массив для высокопроизводительного скрининга углеводов взаимодействия с гликана-связывающие белки, такие как лектины, рецепторы и антитела 16. С большим разнообразием датчиков для обнаружения гликанов клеточной стенки, можно получить подробную информацию о эпитопов гликана принадлежащие ко .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
IEM хотел бы отметить датского исследовательского совета (FTP и FNU) для финансирования. ERL признает, поддержка ARC DP гранта. AB благодарит за поддержку АРК центра передового опыта в завод грант клеточных стенок.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (по желанию) |
| 3 мм из карбида вольфрама бисера | Qiagen | 69997 | |
| Коллекция микропробирок (1,2 мм) | Qiagen | 19560 | Пробирки на 1,5 мл микроцентрифуге также может быть использована |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 мм стеклянные бусины | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Кадмий оксид | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-диаминоэтана | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Нитроцеллюлозные мембраны (0,22 мкм размер пор) | GE воды и технологических процессов | EP2HY00010 | различных размеров пор мембраны подходят для различных типов контактных |
| Xact II microarrayer робот | Labnext | 001A | Xact II робот был оснащен пользовательской 20 х 20 см керамическая пластина, к которой нитроцеллюлозные мембраны прилагается |
| Xtend RM контакты микрочипов | Labnext | 0037-350 | контакты должны быть пригодны для кровянистые выделения на мембранах |
| 384-луночные планшеты для микротитрования (полипропилен) | Greiner | 781207 | |
| Anti-гликанов моноклональных антител | Завод зонды / CarboSource / Biosupplies | Сайты, PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "целевых =" _blank "> www.carbosource.net) и Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ). | |
| Anti-IgG крысы (целая молекула) - пероксидазой антитела производятся в козла. | Сигма | A9037 | Тип вторичные антитела зависит от первичных антител использовали (например, подняли крысы, мыши, козы и т.д.). |
| SIGMA БЫСТРО 3,3 '-диаминобензидина таблетки | Сигма | D4293 | Тип развивающихся реагента зависит от вторичных антител используется и метод обнаружения (colourmetric, или chemiluminecent). |
| SuperSignal Запад Pico хемилюминесцентный субстрат | Thermoscientific | 34080 | см. выше |
| Xplore программное обеспечение для обработки изображений | LabNext | 008 | многие виды программного обеспечения с автоматической гриддинга инструменты доступныДля измерения Значение пикселя микрочипов пятна. |
| Растительных полисахаридов | Sigma / Megazyme |
Ссылки
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
