Chemoselective Модификация поверхности с помощью вирусного Bioorthogonal химии нажмите

Краткое содержание

Аденовирус частиц разработаны содержать либо неестественные аминокислоты azidohomoalanine аналог кислоты или азидо сахар O-GlcNAz. Азид группе каждый chemoselectively лигировали с помощью "мыши" химии реакции как средство вирусного модификации поверхности.

Аннотация

Модификации вирусных частиц получило значительное внимание его огромный потенциал для воздействия генной терапии, онколитических приложений и разработки вакцины. ^1,2,3 Современные подходы к изменению вирусной поверхности, которые в основном генетики основе, часто страдают от ослабления вируса производства, инфекционной и клеточной трансдукции. ^4,5 Использование chemoselective химии клик, мы разработали простой альтернативный подход которое обходит эти вопросы, оставаясь при этом и очень гибкой и доступной. ^1,2

Целью этого протокола является демонстрация эффективности использования bioorthogonal химии нажмите, чтобы изменить поверхность аденовируса типа 5 частиц. Это двухступенчатый процесс может быть использован как терапевтически ¹ или аналитически, ^2,6, поскольку оно позволяет chemoselective перевязки ориентации молекул, красителей или других молекул интереса на белкипредварительно помечены азид теги. Три главных преимущества этого метода в том, что (1) метаболический маркировки свидетельствует о практически не влияет на вирусную фитнес, ^1,7 (2) широкий спектр эффекторных лигандами могут быть использованы, и (3), удивительно быстрый, надежный и легко получить доступ. ^1,2,7

На первом этапе этой процедуры, аденовирус частицы рождаются либо несущих azidohomoalanine (Ага, метионин, суррогатная) или неестественной сахар O-связанных N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), оба из которых содержат азид (-N ₃₎ функциональный группы. После очистки азида модифицированных вирусных частиц, алкин зонд содержащие флуоресцентные часть TAMRA лигируют в chemoselective образом, чтобы предварительно меченых белков и гликопротеинов. Наконец, SDS-PAGE анализ проводится для демонстрации успешного перевязки зонда на вирусные белки капсида. Ага включение показано на этикетке все вирусного капсидабелки (Hexon, Пентон и волокон), а О-GlcNAz включение результатов в маркировке волоконно только.

В этой развивающейся области, несколько методов для азид-алкин перевязки были успешно разработаны, однако только два мы обнаружили, что наиболее удобным демонстрируется здесь - деформации способствует азид-алкин циклоприсоединения (SPAAC) и медно-катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC) под венозная атмосферу.

Протокол

См. Таблицу 1 для приготовления всех средствах массовой информации, буферов и решения, указанные в данном протоколе.

1. Производство Aha-Маркированный аденовирус

1. Подготовить одиннадцать 100-мм культуры тканей блюда человеческих эмбриональных клеток почки (НЕК 293) поддерживается в НЕК 293 среднего роста клеток (см. Таблицу 1) при 37 ° С, пока они не достигли 80 - 90% слияния. (Примечание:. Культуры, слияния более чем на 90% может быть трудным для заражения и не могут производить вирусы по желанию)
2. Ослабить клеток в одном из блюд, сначала удалив ростовую среду, промывки раз в 5 мл буфера TD, то инкубации клеток в течение одной минуты в 1 мл трипсина-ЭДТА (1 х).
3. Добавить 9 мл НЕК 293 среднего роста клеток, а также использовать гемоцитометра для подсчета количества заготовленной НЕК 293 клетках от этого блюда. Используйте этот номер для расчета количества аденовируса типа 5 (Ad5), необходимых для инфекции, используя multiplicitУ инфекций (МВД) стоимостью 10 БОЕ / клетка. Счет к тому, что для нормального Ad5, инфекционной индекс (отношение инфекционных частиц к общему числу частиц), как правило, 1:20.
4. Подготовить 10 мл инфекции буфера.
5. Медленно снимите НЕК 293 рост клеток среды из десяти оставшихся блюд культуры, затем промыть 5 мл буфера TD. Добавить 1 мл инфекции буфер к каждому блюду и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. В этот период инфекция, осторожно встряхнуть каждую сторону культуры блюдо в сторону на 15-минутными интервалами.
6. После заражения, добавляют 9 мл свежего НЕК 293 ячейки среднего роста и инкубируют при 37 ° C в течение 18 часов.
7. Подготовить 100 мл Ага маркировки среды (или встретил управление средой для контроля). Будьте уверены, чтобы фильтровать концентрированные растворы акции с 0,2-мкм стерильный шприц фильтр перед приготовлением маркировки средств массовой информации.
8. Аккуратно (чтобы не вымывать инфицированные клетки) удалить НЕК 293 рост клеток среду после 18 часовя мыть каждую культуру блюдо с 5 мл буфера TD.
9. Удалить TD промывочного раствора буфера и добавить 10 мл среды маркировки Ага каждой культуре блюдо. Для контроля, метионин контроля среды следует использовать вместо среды маркировки Ага на этот шаг.
10. Инкубируйте инфицированных клеток в маркировке среде при температуре 37 ° С в течение 6 часов. Маркировка может быть осуществлена ​​в любое время между 12 - 24 часов после заражения, но не должна превышать 6 часов в срок. Этот интервал был определен максимально пересекается с вирусным белком структурных перевода при обеспечении инфекционной существенно не уменьшилось ^7.
11. Осторожно снимите маркировки средних, чтобы не нарушить клетки. Добавьте 10 мл свежего НЕК 293 среднего роста клеток в каждом блюде и инкубировать клетки при 37 ° С в течение еще 18 часов. Чтобы свести к минимуму потери инфицированных клеток на этом этапе, это не необходимо снять маркировку решение полностью. НЕК 293 клеточного роста средней содержит избыток Mи др. которые будут вытеснять любые остаточные Ага.
12. Перейдите к шагу 3 для очистки.

2. Производство сахара-азидо-Маркированный аденовирус

1. Следуйте процедуре под названием Производство Aha-Маркированный аденовирус, вплоть до шага 1.5.
2. Подготовить 100 мл азидо сахара маркировки среды.
3. Крышка ячейки с 10 мл свежего азидо-сахар среднего маркировки и инкубируют при 37 ° C в течение 44 часов.

3. Очистка Азид-Маркированный Аденовирусные частицы

1. Извлеките носитель вместе с зараженной клетки от каждого блюда культуры и передачи конические трубки. Центрифуга в 2000 г в течение 10 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и осадок ресуспендируют в буфере TD (используя 8 мл TD буфер на 10 блюд).
2. Лизиса инфицированных клеток повторные (3 и более) циклов замораживания-оттаивания использовании сосуд Дьюара с жидким азотом и 37 ° С водяной бане. Центрифуга в 2000 г за 10 минпри 4 ° С в отдельной камере мусор из супернатанта.
3. Подготовка градиента плотности CsCl центрифуги трубы сначала пипетки 2,5 мл 1,25 г / мл раствора в CsCl Ultra Clear трубы центрифуги. Затем с помощью пипетки с наконечником расположены в нижней части трубки постепенно добавить 2,0 мл 1,4 г / мл CsCl решения, стараясь не нарушать градиент интерфейс.
4. Пипетировать супернатант из п. 3.2 в верхней части трубки CsCl градиента плотности, и при необходимости добавьте TD буфер для заполнения трубы. Центрифуга образцов в бакет ротора на 125 000 г в течение 1 часа при 15 ° С в ультрацентрифуге.
5. После завершения центрифугирования, вирусные частицы должны быть видны в густой белой полосы на стыке двух CsCl решений. Сделайте небольшой перфорацией в нижней части трубки стерильной иглой, чтобы решение слить по каплям.
6. Соберите толстой белой полосы, которая должна содержать меченые Ad5 частиц, возьмуг ухода, чтобы исключить превышение CsCl решение. Избегайте сбора клеточных белков, которые будут объединяться над вирусом слоя. Кроме того исключает пустой капсид вириона, которые образуют легкий слой чуть выше толстой белой полосы вируса.
7. При желании, выполнять окончательную очистку на меченые Ad5 частиц. Добавить собранные фракции шагом от 3,6 до 4 мл ультрацентрифуге трубы и заполнить трубу с 1,35 г / мл CsCl решение. Центрифуга на 125 000 г в течение 18 часов при 15 ° C и собрать толстую белую полосу, которая образует в середине трубки, как описано в пунктах 3.5 и 3.6. (Заметим, что если вирусный титр низкий, белая полоса не может быть видна после второго центрифугирования, и это не будет возможно восстановить меченого вируса).
8. Для хранения вирусных частиц в течение длительного периода времени, диализ собранных вирусов выписка должна быть выполнена против вируса буфер хранения. Хранить диализованной образцов вирусов при температуре -80 ° C.

4. Liдование изменения Аденовирусные частиц с помощью зондов алкин Штамм-Повышен Азид-алкин циклоприсоединения (SPAAC)

1. К раствору 50 мл азида модифицированный вирус Ad5 в буферной памяти, добавить 0,25 мкл маркировки SPAAC. (См. таблицу реагентов для списка продавцы коммерчески доступных напряженных алкинов).
2. Позвольте деформации способствует циклоприсоединения протекания реакции в течение ночи при комнатной температуре. Если светочувствительный датчик (например, TAMRA) используется, закройте реактор с алюминиевой фольгой.
3. Очисти меченого вируса в соответствии с п. 6.

5. Лигирование изменения Аденовирусные частиц с помощью зондов алкин меди (I)-Катализированный Азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC) в атмосфере венозная

1. Место 7,2 мг меди (I) бромид (CuBr) порошка в трубку Eppendorf, покрытые алюминиевой фольгой.
2. Внесите 1 мл ДМСО во вторую пробирку Эппендорфа.
3. Готовить50 мкл раствора маркировки CuAAC в третью пробирку Эппендорфа. Накрыть алюминиевой фольгой, если зонд алкин является светочувствительный (например, TAMRA-алкин).
4. Поместите три Эппендорф трубы, раскрытый в венозная сумку перчатки в течение 6 часов. Все образцы должны оставаться внутри перчатки мешок до завершения CuAAC реакции.
5. Подготовьте 50 × фондовый решение CuBr добавлением 1 мл ДМСО до 7,2 мг CuBr порошок, оба из которых были венозная согласно п. 5.4.
6. Начать CuAAC реакции с помощью пипетки 1 мкл этого решения акции CuBr до 50 мкл CuAAC решение маркировки, которая была венозная согласно п. 5.4. Позвольте протекания реакции в течение 12 часов внутри перчатки сумки.
7. Очисти меченого вируса в соответствии с п. 6.

6. Очистка и хранение Маркированный вирусных частиц

1. Очисти меченого вируса образцов с использованием Centri-Сен гель-фильтрации в спинуolumns уравновешенной вирусов буфера хранения, следующие рекомендации производителя.
2. Кроме того, очистка может осуществляться путем диализа против вируса буфера хранения.
3. Помечены вирусные частицы должны храниться при температуре -80 ° C.

7. SDS-PAGE с метками аденовирус и флуоресцентные сканирования геля

1. Добавить 20 мкл образца Laemmli буфера (2 ×) в 20 мкл очищенной помечены вируса и кипятить 10 мин. Центрифуга образцов в течение 30 секунд, чтобы удалить нерастворимые осадки. Если остаточная медь присутствует после очищения, кипячения образца может привести к толстые прожилки белка на SDS-геле, в результате чего трудности при визуализации. В этом случае отказаться от кипячения образцов на этом этапе.
2. Прикрепите гель кассеты электрофореза клеток и добавить работы буфера. Загрузите необходимое количество скважин образцы вирусов белки. Используйте один и загрузить предварительно СТАИопределена маркеры молекулярного веса. Запустите геля в течение 1 часа при 200 В. Имейте электрофорез клетка покрыта алюминиевой фольгой в течение всего периода уменьшить фотообесцвечивания флуорофора этикетке.
3. Для достижения наилучшего разрешения и удалить все свободные флуорофора, позволяют отслеживать краситель бежать из геля при электрофорезе. Остановить электрофореза и быстро перенести гель на люминесцентные сканер и сканировать гель гель для флуоресцентного излучения на соответствующей длине волны (574 нм для TAMRA).
4. Число молекул красителя сопряженных с каждым вирусных частиц может быть определена количественно путем измерения флуоресценции несколько стандартных концентрациях TAMRA и сопоставления с образцом, с шагом 7.3.

8. Представитель Результаты

Наблюдаемые результаты SDS-PAGE и люминесцентные сканирования геля TAMRA-сопряженных Ad5 показано на рисунке 3. Хотя эти флуоресцентные сканирования геля проводились на образцах модифицированнойFied через CuAAC, результаты должны быть сопоставимы, когда зонды лигируют через SPAAC. Эти гель сканирования показывают, что Ага маркировки приводит к модификации трех Ad5 капсид белков (Hexon, Пентон, и волокна), в то время как сахар маркировки изменяет только белки капсида волокон. Кроме того, увеличение концентрации Ага (4 мм против 32 мм) приводит к более высокой степени включения Ага, но это также было показано, что снижение инфекционной. До результатов ⁷ показывает, что для Ad5 производится в 4 мм Ага, примерно 5% подвергается метионин сайтов TAMRA модифицированные, с этим число увеличилось до 10% при 32 мм Ага используется. Это соответствует примерно 280 и 510, соответственно, краситель-меченных сайтов в Ad5 частиц. Анализ сахара маркировки ¹ показали, что примерно 22 из 36 сайтов гликозилирования на Ad5 заняты азидо сахар, а затем помечены TAMRA.

Если десять пластин культуре ткани используются для производства азида модифицированных Ad5, как описано В этом протоколе, 200 - 300 мл азида модифицированный вирус должен быть получен из белой полосы собраны в пункте 3.6, с титром 1,5 × 10 ¹² частиц / мл. Общей сложности эта процедура является отсутствие вирусной группы в этой стадии очистки, которая может быть связано с низкой вирусной титр. Это, как правило, в результате заражения клеток, которые являются либо более или недостаточно сливной или вымывания клеток - которые становятся ослабил от пластины после заражения - в то время как полоскание при шаге 1.

Рисунок 1. Обзор протокола. Азид содержащих Ага или GalNAz впервые включены в аденовирус частиц. Лигирование с флуоресцентный зонд алкин затем выполняется с помощью "мыши" химии. Наконец, SDS-PAGE используется для демонстрации перевязки флуоресцентный зонд.

Рисунок 2 "/>
Рисунок 2. Лигирование зонд алкин на азид модифицированный вирус через (а) SPAAC, (б) CuAAC под де-кислородом и (с) кислородом атмосферы.

Рисунок 3. Флуоресцентные сканирование SDS-PAGE азида-меченных аденовируса типа 5 (Ad5) после CuAAC сопряжения с TAMRA-алкин. (А) Ага-меченных Ad5, с использованием двух концентраций Ага. Маркировка видимому, происходят на аденовирус Hexon, Пентон и волоконно капсид белков, со степенью маркировки увеличивается с повышением концентрации Ага. (Б) AC ₄ GalNAz-меченных аденовирус, как представляется, помечены только на белок капсида волокон.

Решение	Подготовка	Примечания
Ad5 хранения буфера	5 мМ Трис-HCl буфером (рН 8,0), содержащего 0,5 мМ MgCl 2, 50 мМ NaCl, 25% (объем / объем), глицерин, и 0,05% (вес / объем), бычий сывороточный альбумин (BSA)	Хранить при температуре от -20 ° C
Ad5 инфекции буфер	2% (объем / объем) бычий телячьей сыворотки, 1 × TC решение, Ad5 в буфер хранения (объем определяется по МВД от 10 БОЕ / клетка и инфекционной индекс 1:20). Доведите раствор до конечного объема использования TD буфер	Ad5 концентрация может быть определена с помощью УФ-поглощения.
TC решения (200 ×)	136 мм CaCl 2, 100 мМ MgCl 2	Хранить при температуре 4 ° C
TD буфер	137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,07 мМ Na 2 HPO 4 и 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5	Хранить при температуре 4 ° C
НЕК 293 клеточного роста средней	Средний Дульбеко изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% (объем / объем) бычий телячьей сыворотки (BCS) и 1% (объем / объем) Pen Strep	Хранить при температуре 4 ° C
Cys маточного раствора (100 ×)	DMEM (-Met /-Cys) с добавлением 200 мМ L-цистеин	Подготовить свежие и фильтра с 0,2-мкм стерильный шприц фильтр перед использованием.
Ага маточного раствора (25 ×)	DMEM (-Met /-Cys) с добавлением 100 мМ L-Azidohomoalanine	Подготовить свежие и фильтра с 0,2-мкм стерильный шприц фильтр перед использованием.
Ага маркировки среднего	DMEM (-Met /-Cys) с добавлением 10% БКС, Ага маточного раствора (1 ×), 2 мМ L-цистеин	Подготовить свежие перед использованием. Это соответствует 4 мм сoncentration из Ага, хотя различные концентрации могут быть использованы (см. представитель результаты).
Met маточного раствора (25 ×)	DMEM (-Met /-Cys) с добавлением 100 мМ L-метионин	Подготовить свежие и фильтра с 0,2-мкм стерильный шприц фильтр перед использованием.
Метеорологическое управление средой	DMEM (-Met /-Cys) с добавлением 10% БКС, встретил маточного раствора (1 ×), 2 мМ L-цистеин	Подготовить свежие перед использованием.
AC 4 GalNAz маточного раствора (1000 ×)	50 мМ peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) в метаноле	Хранить при температуре 4 ° C. AC 4 GalNAz является метаболическим предшественником GlcNAz.
Азидо сахара маркировки среднего	100 мкл AC 4 GalNAz маточный раствор, 100 мл НЕК 293 клеточного роста средней	Позвольте метанол испаряется до добавления НЕК 293 рост клеток среды.
Цезий растворов хлорида	CsCl растворяется в буфер TD: 1,25 г / мл (18,08 г / 50 мл H 2 O) 1,35 г / мл (25,60 г / 50 мл H 2 O) 1,40 г / мл (31,00 г / 50 мл H 2 O)	Плотность градиентов для ультрацентрифугирования
Буфер хранения вирусов	Фосфатного буфера (PBS), рН 7,2, содержащем 0,5 мМ CaCl 2, 0,9 мМ MgCl 2, и 10% (объем / объем) глицерин	Хранить при температуре от -20 ° C
TAMRA-BCN (SPAAC) маркировка решение	TAMRA-BCN в ДМСО: Использование УФ-поглощенияsorbance (OD 260 тест), чтобы определить титр вируса решение в шаге 4,1 Определите общее количество вирусных частиц в 50 мкл (N Ad5) TAMRA-BCN молярность (в М) определяется с помощью: С BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Аво) N = 6,022 Аво × 10 23 (Так что реакция смеси, приготовленной на шаге 4 содержит 100 алкин зондов в вириона)	Штамм раскрученной алкин зонд Для SDS-PAGE, вирусный титр примерно 10 12 частиц / мл рекомендуется
TAMRA-алкин (CuAAC) маркировка решение	50 мкл азид модифицированный вирус Ad5 в буфер хранения (N Ad5 определяется как выше), 1,5 мМ Бато фенантролин дисульфонат (т.е. 1,5 × конечной концентрации CuBr), TAMRA-алкин. TAMRA-алкин молярность (в М) определяется с помощью: с Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Аво) (Так что реакция смеси, приготовленной в шаге 5 содержит 100 алкин зондов в вириона)	Трис-буфера, как известно, быть конкурентоспособным и тормозных лиганд меди 8.
Laemmli буфера образца (2 ×)	125 мМ Трис-HCl (рН 6,8), 4% (вес / объем) SDS, 20% (объем / объем), глицерин, 10% (объем / объем) 2-меркаптоэтанол, и 0,004% (вес / объем) бромфенола синий
Запуск буфер	187 мм глицин, 19 мМ Трис-HCl, 3,5 мм SDS в H 2 O	Хранить при температуре 4 ° C

т "> Таблица 1. Подготовка буферов и решений, необходимых этим протоколом.

Обсуждение

Развитие chemoselective и нажмите bioorthogonal реакций, в том числе азиды, является быстро развивающейся областью исследований, а затем растет число этих реакций на выбор для bioconjugation приложений. Мы ограничили рамки этого протокола, чтобы включать только два метода, которые были выбраны из-за их полезности в нашей лаборатории и коммерческой доступности всех реагентов.

В первый такой маршрут - деформации способствует азид-алкин циклоприсоединения (SPAAC) - алкин содержится в кольце cyc...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Аденовирус типа 5 (Ad5), содержащий GFP трансгенов	BCBC	391
Человеческих эмбриональных почек (НЕК 293) клеток	ATCC	CRL-1573
Дульбекко изменения Eagle среднего (DMEM), высокий уровень глюкозы	Invitrogen	11965-092
Дульбекко изменения Eagle средний, не метионин, цистеин нет (DMEM-Met /-Cys), высокий уровень глюкозы	Invitrogen	21013-024
Говядина телячьей сывороткой	Invitrogen	16170-078
Пенициллин - стрептомицин 100 × Решение (Pen Strep)	Invitrogen	15140-122
0,5% Трипсин-EDTA (10 ×)	Invitrogen	15400-054
100 мм культуре клеток Dish, культуры тканей обработанных полистирола	BD Сокол	353003
Клеточные культуры CO 2 инкубатор
Гемоцитометра
Механизм кабинет
Стерильные шприцы фильтра (0,2 мкм, ацетат целлюлозы)	VWR	28145-477 (NA), 514-0061 (Европа)
Avanti JE центрифуги	Beckman Coulter	369001
Конические трубы (50 мл, стерильные)	BD Сокол	352098
Труба, тонкостенных, Ultra-Clear, 13,2 мл, 14 х 89 мм	Beckman	344059
Ультрацентрифуге оснащен SW 41 и SW 60 тOTOR	Beckman
Эппендорф Biopur безопасной блокировки трубы, 1,5 мл	Эппендорф	0030 121.589
Центрифуга 5418	Эппендорф	5418
Centri-Сен гель столбцов фильтрации спина	Принстон Separations	CS-901
Стерильная игла, 18 калибр
Азот перчатки мешок (если венозная CuAAC должна быть выполнена)
Сосуд Дьюара
Жидкий азот
Электрофорез клетки
Флуоресцентный сканер гель
Готовый гель Трис-HCl гель	Bio-Rad	161-1105
L-Azidohomoalanine	AnaSpec	63669
Йена Biosciences	CLK-AA005
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz)	Invitrogen	C33365
Thermo Scientific	88905
Sigma-Aldrich	A7480
Bathophenanthroline дисульфокислоты (BDA) динатриевая соль	MP Biomedicals	0215011201
Диметилсульфоксид (ДМСО)
Метанол
Трис базы (трис (гидроксиметил) аминометан)
Динатрия фосфат (Na2 HPO 4)
Фосфатного буфера (PBS)
1М HCl
Глицерин
Бычьего сывороточного альбумина
L-цистеин
L-метионин
SDS (сульфат натрия додецилсульфата)
2-меркаптоэтанол
Глицин
Bromophenol синий
Хлорид цезия (CsCl)		И яBSP;
Медь (I) бромид (CuBr)
Хлорид кальция (CaCl 2)
Хлорид калия (KCl)
Хлорид магния (MgCl 2)
Хлорид натрия (NaCl)
Алкин зонд для * CuAAC
TAMRA алкин	Invitrogen	T10183
Напряженные зонд алкин для * SPAAC
TAMRA DIBO алкин	Invitrogen	C10410