Использование LysoTracker обнаружить запрограммированной смерти клеток в эмбрионы и дифференциации эмбриональных стволовых клеток

Краткое содержание

Приведем простой протокол для визуализации регионов запрограммированной клеточной смерти (PCD) у эмбрионов мышей и дифференциации эмбриональных стволовых (ЭС) клеточных культур с использованием высоко растворимых красителей называют LysoTracker.

Аннотация

Запрограммированная клеточная смерть (PCD) происходит у взрослых для поддержания нормального гомеостаза тканей и во время эмбриологического развития для формирования тканей и органов^1,2,6,7. Во время развития токсичные химические вещества или генетические изменения могут вызвать увеличение PCD или изменить паттерны PCD, что приведет к аномалиям развития и врожденным дефектам^3-5. Чтобы понять этиологию этих дефектов, изучение эмбрионов может быть дополнено анализами in vitro, в которых используются дифференцировочные эмбриональные стволовые клетки (ЭС).

Апоптоз - это хорошо изученная форма PCD, которая включает в себя как внутреннюю, так и внешнюю передачу сигналов для активации каскада ферментов каспаз. Характерные изменения клеток включают блеббинг мембраны, сжатие ядра и фрагментацию ДНК. Другие формы ПКД не включают активацию каспаз и могут быть конечным результатом длительной аутофагии. Независимо от пути ПЦД, умирающие клетки необходимо удалять. У взрослых особей эту функцию выполняют иммунные клетки, в то время как у эмбрионов, где иммунная система еще не развилась, удаление происходит по альтернативному механизму. Этот механизм включает в себя соседние клетки (называемые «непрофессиональными фагоцитами»), которые берут на себя фагоцитарную роль — они распознают сигнал «съешь меня» на поверхности умирающей клетки и поглощают его^{в 8-10} раз. После поглощения мусор выводится в лизосому для деградации. Таким образом, независимо от механизма ПЦД, увеличение лизосомальной активности может коррелировать с увеличением гибели клеток.

Для изучения PCD может быть полезен простой анализ для визуализации лизосом в толстых тканях и многослойных дифференцирующих культурах. Краситель LysoTracker представляет собой высокорастворимую малую молекулу, которая удерживается в кислых субклеточных компартментах, таких как лизосома^11-13. Краситель поглощается путем диффузии и через циркуляцию. Поскольку проникновение не является препятствием, возможна визуализация ПХД в толстых тканях и многослойных культурах^12,13. В отличие от этого, анализ TUNEL (терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP nick end labeling)¹⁴ ограничен небольшими образцами, гистологическими срезами и монослойными культурами, поскольку процедура требует входа/проницаемости терминальной трансферазы.

В отличие от анилинового синего, который диффундирует и растворяется растворителями, LysoTracker Red DND-99 является поправимым, ярким и стабильным. Окрашивание может быть визуализировано с помощью стандартной флуоресцентной или конфокальной микроскопии в цельном монтаже или в разрезе с использованием водной или сольвентной среды^12,13. Здесь мы описываем протоколы с использованием этого красителя для изучения PCD в нормальных и звуковых эмбрионах мышей с нулевым содержанием ежа. Кроме того, мы демонстрируем анализ PCD в дифференцировке культур клеток ES и представляем простой метод количественной оценки. Подводя итог, можно сказать, что окрашивание с помощью LysoTracker может стать отличным дополнением к другим методам обнаружения PCD.

Протокол

1. LysoTracker Окрашивание эмбрионов мыши

1. Создание эмбрионов мыши, поместив молодых (5-6 недель) женщин в мужских клетках студ. Монитор на следующий утрам для появления вагинального вилку о том, что спаривание произошло. Если женщина беременна, в полдень в этот день называют 0,5 DPC (дней после полового акта). Процедура, представленная здесь, идеально подходит для эмбрионов 7-13 DPC.
2. На день эмбрионального развития интереса, усыпить женщин в соответствии с утвержденными протоколами и удалить матку. Снимите эмбрионы из децидуальной в 10 см чашки Петри с Хэнксом BSS (без фенола красного). Удалить экстра-эмбриональных мембран и сделать по крайней мере одно полоскание с Хэнксом BSS для удаления посторонних тканей и крови.
3. Подготовка LysoTracker эмбрионов красящим раствором (5 мМ LysoTracker в Хэнкс BSS). Удобном объеме в течение 1-2 пометов в 5 мл. Аккуратно перемешайте, чтобы выплатить краситель равномерно.
4. Добавить эмбрионов для окрашивания Solut эмбрионов LysoTrackerиона в микроцентрифужную пробирку или флакон и инкубировать при 37 ° С в течение 45 мин.
5. Промыть очень осторожно в Хэнкс BSS в четыре раза, в 5 минутах каждого мытья.
6. Исправить в 4% параформальдегид в течение ночи.
7. Промыть раз в Хэнкс BSS, 10 мин, чтобы удалить исправление.
8. Высушить с помощью метанола ряд (50%, 75%, 80%, 100%, 5 мин каждый шаг), чтобы устранить фон окрашивания. Это важно для достижения хорошего отношения сигнал-шум во время съемки.
9. В этот момент вы можете хранить образцы эмбрионов на неопределенный срок в метаноле при -20 ° C, в защищенном от света.

Примечание: образец ткани может быть принято на любом этапе для генотипирования ДНК, однако, это может быть наиболее удобной, чтобы взять образец перед хранения, так что до этого шага все образцы, может быть пакетной обработке. Сбор образца ткани из хвоста, конечностей, головы или из каждого эмбриона и поставить все на отдельные трубы. Увлажняет образец ткани и подготовиться к genotyпинг.

2. LysoTracker Окрашивание Дифференцируя ES культур

1. Подготовка эмбриоидные тела через подвесной ¹⁵ Метод выпадения со стартовой плотностью 500 клеток в 20 мкл капли.
2. После 3 дней, передает эмбриоидных органов к приостановке культуры на 10 см не соблюдают чашках Петри (т.е. те, которые используются для бактериологического работы). Культура в течение 5 дней, изменение средств массовой информации каждые 2 дня.
3. На 7-й день, передает эмбриоидных органов желатинизированный 8-а слайды камера (0,1% добавить желатин в камерах, подождите 5 минут, удалять и добавлять средства массовой информации). Передача 1-2 эмбриоидные тела в камере.
4. Культура в течение 10 дней, меняя средства массовой информации каждый день. Будьте осторожны, чтобы поместить пипеткой на углу камеры слайда, чтобы не возмущать эмбриоидных тела прикрепления к поверхности стекла. Кроме того, при добавлении свежей информации также поместить пипеткой в ​​углу камеры и освободить средства массовой медленно.
5. После 10 дней культомЮр, чтобы индуцировать апоптоз в качестве положительного контроля, лечить некоторые из скважин с 0,1 мМ и 1,0 мМ H ₂ O ₂ (добавить H ₂ O ₂ в свежей среде, перемешать, затем добавить к клеткам) в течение 60 мин. Промыть два раза с D-PBS и культуры в течение ночи в регулярном СМИ.
6. Аккуратно аспирации существующих средств массовой информации и добавить LysoTracker сотовых красящим раствором (500 Нм LysoTracker (конечная концентрация) в средствах массовой информации, 300 мкл на камеру).
7. Инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
8. Промыть два раза с D-PBS 2 раза, 5 мин.
9. Исправить в 4% параформальдегид в течение 15 мин при комнатной температуре.
10. Промыть два раза с D-PBS, 5 мин.

3. Просмотр LysoTracker Витражи эмбрионов или ES культур

1. Подготовка образцов клеток для микроскопии путем аспирации D-PBS, удаление камеры от слайда; сушки на воздухе в течение 5 мин, а затем добавляют водный монтаж среды (Vectashield с DAPI или аналогичный). Поместите фольги барьер в то время как dryinг снизить отбеливания флуорофора. Установите эмбрионов в глубокую депрессию, стеклянное блюдо или небольшой чашке Петри в Vectashield или аналогичный.
2. Визуализация с рассечения или составной микроскоп оснащен родамина или Texas Red фильтр (LysoTracker RED DND-99, возбуждение / излучение: 577/590 нм). Окрашивание, как правило, довольно яркая так долго воздействия, как правило, не требуется.

4. Количественное результатов с использованием методов визуализации

1. Возьмите цифровой фотографии ваших образцов в тех же условиях экспозиции в ручном режиме.
2. Открытие изображений в Adobe Photoshop или аналогичной программой визуализации. Для определения количества LysoTracker окрашивания, выберите красный канал и пороговых изображения (преобразует изображение в черно-белое), что красное окрашивание в настоящее время представлены белые пиксели. Выберите белых пикселей и использовать гистограмму функции для получения общего количества.
3. Используйте синий канал для подсчетачисло ядер в этой области. Это может быть полезно вести учет счетчик на аннотирования изображений.
4. Запишите значения, а затем вычислить средний уровень окрашивания в клетке. Повторите этот анализ с той же настройкой порога для всех изображений Вы хотите попробовать.

5. Представитель Результаты

Существует нормальная картина PCD во время эмбрионального развития, что может измениться, когда гена фактора роста, такие, как ежик Соник (Shh), удаляют ^16,17. С LysoTracker небольшая молекула красителя, который очень диффузии, весь эмбрион может быть представлена ​​для оценки областей PCD даже глубоко внутри мезенхимы ^12,13 рисунке 1 показана схема LysoTracker окрашивания для нормальной и Shh ^{-. / -} Мутантных эмбрионов мыши на 10.5dpc. На данном этапе, PCD значительно увеличивается в Shh ^{- / -} мутантных эмбрионов, особенно в конечностях и сомита регионс. Части эмбрион может быть отображена в целом крепление при большем увеличении (1В), чтобы оценить общую картину. Расчлененный часть также может быть разрез с вибрирующим микротома (1С) или криостат (DF), чтобы показать PCD регионах более подробно.

TUNEL анализа лучше всего делать на тонких участках, где проникновение терминальной трансферазы менее проблематично. Окрашивание LysoTracker и анализа TUNEL может быть сделано в той же ткани (рис. 1D-G). Эти результаты показывают, что, хотя не существует строгая корреляция между 1:01 и LysoTracker TUNEL окрашивания, общая регионов PCD перекрытия значительно. При большем увеличении, то можно увидеть, что puncta пятно с положительным анализом TUNEL, но не с LysoTracker краситель, puncta, что пятно только с LysoTracker краситель, и puncta, которые перекрывающихся пятен.

Когда EB покрыт на желатин покрытием поверхности, дифференциации клеток будет перемещающихсяэлектронной наружу. После 10 дней культуры, клетки дифференцировались в различные типы клеток, в том числе нейроны, клетки мышц, и кардиомиоциты. Культурах показано на рисунке 2 содержит смешанные популяции этих типов клеток, однако можно было бы адаптировать наш протокол для изучения PCD конкретного типа клеток интерес. Например, EB может рассматриваться с ретиноевой кислотой для повышения дифференциации нейронов ^19, а затем LysoTracker анализ может быть использован для оценки гибель нейронов в различных условиях. В нормальной культуре дифференцированных клеток ES, есть несколько клеток, которые подвергаются PCD, и они могут быть обнаружены с LysoTracker и / или TUNEL анализов (рис. 2A). PCD может быть вызвано различными цитотоксическими агентами, такими как перекись водорода (H ₂ O _2), который вызывает окислительные повреждения и инициирует апоптоза ^20,21. Низкие дозы H ₂ O ₂ увеличивает какLysoTracker и TUNEL окрашивания по сравнению с отсутствием лечения, в то время как высокие результаты в дозе усадки клеток и распространение LysoTracker и TUNEL положительности. Подобный результат в зародыше, то можно увидеть, что puncta пятно с положительным анализом TUNEL, но не с LysoTracker краситель, puncta, что пятно только с LysoTracker краситель, и puncta, которые перекрывающихся пятен. Следствием применения цитотоксическим агентом, который индуцирует apopotosis по сравнению с сывороткой условиях голода, которые вызывают аутофагии (рис. 2D). Клетки, которые подверглись период сывороточного голодания (1 час) демонстрируют иную картину, где LysoTracker и TUNEL окрашивания не сильно коррелируют. LysoTracker окрашивания значительно увеличилось по сравнению с необработанными культурами, однако TUNEL положительности находится на нормальном уровне.

Применение стандартных инструментов, доступных в Adobe Photoshop, LysoTracker окрашивания может быть определена количественно с простой способ сегментации, что позволяет вычислить средний уровень окрашивания для популяции клеток. 3А-B показано, как выглядит изображение образца в количественном процесса. Начиная с базовой изображение с LysoTracker окрашивание в красный канал и DAPI-окрашенных ядер в синем канале (панель 3А), красный канал этого образа был thresholded, чтобы преобразовать изображение в черно-белом и белые пиксели были Затем выбираются и подсчитывали (рис. 3А). Порога уровня был выбран, которая представляет картины LysoTracker окрашивания. Как и в любой количественного метода, который использует изображения, важно, чтобы избежать передержки ваши фотографии так как это может потенциально привести к более подчеркивая различия. Число ядер в поле можно считать, глядя на только синего канала (рис. 3В) и маркировки ядер с использованием инструмент для рисования, такие как кисти, считая (рис. 3В). Тогда можно выразить йэлектронной уровень окрашивания, вычисляя средний уровень окрашивания в клетке (количество пикселей / ядер счет). Если мы хотим использовать этот алгоритм для высоких по-пут скрининга, большинство пакетов скрининга можно измерить яркость в определенном канале, а также имеют функцию идентификатора объекта, что будет считать ядер в поле, однако для большинства типовых применений ручной метод является быстрым и простой. К примеру, образец область из рис 2A-C количественно и результаты подтверждают, что повышение концентрации H ₂ O ₂ приводит к более высокому уровню LysoTracker окрашивания (рис. 3).

Рисунок 1. LysoTracker окрашивание в нормальных и Shh ^{- / -} эмбрионов. А, А 'Нормальные и Shh ^{-. / -} Эмбрионов мышей на 10,5 DPC, окрашивали LysoTracker Красная, установленный в Vectashield и фотографировали подepiflourescence рассекает микроскопом. Скобки указывают расположение передних конечностей B, B 'лапы нормальной и Shh ^{-.. / -} Эмбрионов отображаемого при большем увеличении. Обратите внимание на нормальные области клеточной гибели, в том числе "Задняя зона некроза (отмечены звездочкой) и региона в проксимальных мезенхиме зачатка конечности (отмечена стрелкой). Shh конечностей нулевой проявляют сильное окрашивание в медиальной и дистальной части . C, C '. медиальной разрезы передней конечности почки как нормального, так и не имеющими почки конечности. Обратите внимание на наличие окрашивание в проксимальных мезенхимы (стрелка) и AER (стрелки) нормальной почки конечности и сильное окрашивание в спинных и брюшных и дистальной мезенхиме в нуль почки конечности. DF. Же разделе (12 микрон, замороженные раздел) отображаемого на LysoTracker и TUNEL окрашивания (Roche 1684795). В разделе проходит через дистальной части Shh нулевой mesenchyme. Стрелка указывает на AER. Обратите внимание, как общая картина очень похожа помощью обоих методов, однако окрашивание не перекрывается полностью. G, G '. На более высоком увеличении AER и мезенхимы, можно увидеть, как наличие puncta, которые LysoTracker или TUNEL-позитивных Только, а также puncta, которые перекрытие окрашивания.

Рисунок 2. LysoTracker окрашивание в дифференцированных клетках ES. Дифференцируя клетки высевают на 8-камеру слайды в отсутствие LIF. Чтобы показать, как LysoTracker и TUNEL окрашивания сравнения, апоптоз путем вызывали с 2 разных доз H ₂ O _2, в то время как путь аутофагии вызывали использовании 1 час сывороточного голодания. Эти изображения были сделаны с помощью Zeiss LSM5 конфокальный микроскоп-A''. Необработанные культуры показывают некоторые нормальные апоптоза как указано LysoTРэкера и TUNEL окрашивания. Шаблон с использованием обоих методов главным образом перекрывается (белые стрелки), однако, можно увидеть несколько puncta, которые LysoTracker только положительные (красные стрелки) B-B'', CC ". Обращения с увеличением количества H ₂ O ₂ стимулирует апоптоз . низкие дозы показывает более LysoTracker и TUNEL положительные puncta по сравнению с необработанными клетками. высокой дозе вызывает в еще более LysoTracker и TUNEL положительные puncta. Белые стрелки указывают на перекрытие окрашивания, в то время как красные стрелки указывают на puncta, которые являются положительными для LysoTracker только. Это также можно увидеть puncta, которые являются только положительные для TUNEL окрашивания (зеленые стрелки) DD ". сывороточного голодания могут вызвать аутофагии, который может стимулировать накопление материала в лизосомах и autophagolysosomes. Обратите внимание, как много puncta LysoTracker видны по сравнению с необработанными культурами. TUNEL положительные puncta присутствуют (большинство из которых перекрытия LysoTracker пятнония, белые стрелки), однако число не сильно увеличилось по сравнению с необработанными условиях. Кроме того, в сыворотке условиях голода, LysoTracker только положительные puncta широко распространены (красные стрелки).

Рисунок 3. Количественный метод оценки уровня окрашивания в популяции клеток, используя Adobe Photoshop. A: часть рис. 2A был выбран и LysoTracker (красный канал) и DAPI окрашивания (ядра, синий канал) показано на этой панели ». Красного канала 3А был thresholded чтобы преобразовать его в черно- -белом изображении. Белые пиксели могут быть выбраны и рассчитывали с использованием гистограммы функции B-B ':. Синий канал показывает ядер и при подсчете их изображения могут быть нанесены с помощью функции рисования, такие как кисти C:. Это бывшиедостаточное количественное выборки из панелей 2А-C. Данные представлены в виде точек на ядрах. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Обсуждение

Важные признаки апоптоза включают обнаружение повреждений ДНК с анализом TUNEL, наряду с обнаружением активности каспазы (обнаружен с МАТ или связывающей молекулы, такие как ZVAD-FMK), наблюдение клеточные изменения, и представление фосфатидилсерина (PS ) на поверхности мембраны (обнаружен аннексина V обязательным). Есть некоторые недостатки каждого из этих анализов. Например, терминальной трансферазы, используемых в анализе TUNEL не проникает за пределы нескольких слоев клеток. Также аннексина V можно выделить клетки, ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания		Номер в каталоге
LysoTracker Красной DND-99	Invitrogen	# L-7528
Хэнкс BSS	Invitrogen	14025-076
Параформальдегид	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Номера для незаменимых аминокислот	Cellgro	25-025-ДИ
Пирувата натрия	Cellgro	25-000-ДИ
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
б-меркаптоэтанола, 50 мМ	Invitrogen	21985-023
LabTek-II палаты слайды (8-а)	Nalge Nunc Международного	154534
0,1% желатина	Millipore	ES-006-B
Дульбекко PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Решение рецепты 4% параформальдегида На 100 мл: Смешайте 4 г параформальдегида, 90 мл H 2 O и NaOH (капли 2N NaOH). Параформальдегид не буду вдаваться в решение пока не будут добавлены некоторые NaOH для увеличения рН. Перемешать и тепла при температуре 60 ° C, пока все порошка в раствор (~ 10-20 мин.) Не перегревать. Добавить ~ 10 мл PBS 10x для достижения конечного объема 100 мл. Хранить при -20 ° C в удобное (~ 10 мл или ~ 40 мл) аликвоты. ВНИМАНИЕ: Параформальдегид в «жабо» форме (сжатый небольшие гранулы) меньше, порошкообразные и поэтому может быть измерена вне капюшона. Однако вы все равно должны носить защитную маску от пыли (N95по крайней мере) во время обработки. EB Культура СМИ Для 500 мл EB Media: DMEM: 404,5 мл FBS: 75,0 мл L-Глютамин: 5,0 мл Пенициллина / стрептомицина: 5,0 мл Номера для незаменимых аминокислот: 5,0 мл Пирувата натрия: 5,0 мл β-меркаптоэтанол: 500мкл