Модели костных метастазов

Краткое содержание

Животные модели часто используются для изучения раковых метастаз в костях. В этом протоколе мы опишем два распространенных метода инокуляции опухоли для исследования костного метастазирования, и кратко описать некоторые из анализов используются для мониторинга и количественной оценки этих моделей.

Аннотация

Метастазы в костях часто встречаются при различных злокачественных новообразованиях, включая рак молочной железы, предстательной железы и легких. После заселения костной ткани опухоли становятся причиной значительной заболеваемости и смертности¹. Таким образом, существует острая необходимость в понимании молекулярных механизмов, контролирующих возникновение, рост и активность опухолей в костях. Для изучения этих процессов было создано несколько моделей in vivo, каждая из которых имеет свои преимущества и ограничения. В наиболее часто используемой модели применяется внутрисердечное введение опухолевых клеток непосредственно в артериальный кровоток атимических (обнаженных) мышей линии BalbC. Эту процедуру можно применять к многим различным типам опухолей (включая рак предстательной железы PC-3, карциному легкого и опухоли жировой подушки молочной железы мыши); однако в данной работе мы сосредоточимся на модели рака молочной железы MDA-MB-231. В этой модели мы используем высокоселективный к костной ткани клон, первоначально полученный в группе доктора Мунди в Сан-Антонио², который впоследствии был трансфектирован для экспрессии GFP и повторно клонирован нашей группой³. Данный клон представляет собой костнометастатический вариант с высокой степенью остеотропности и очень низким уровнем метастазирования в легкие, печень или надпочечники. Хотя внутрисердечные инъекции чаще всего используются для изучения костных метастазов², в некоторых случаях более подходящими являются внутрибольшеберцовые⁴ инъекции или введение в жировую подушку молочной железы. Внутрисердечные инъекции обычно проводятся при использовании опухолевых клеток человека с целью мониторинга поздних стадий метастазирования, а именно способности раковых клеток задерживаться в кости, выживать, пролиферировать и формировать опухоли, которые приводят к развитию индуцированного раком заболевания костей. Внутрибольшеберцовые инъекции выполняются, если внимание сосредоточено на взаимодействии раковых клеток и кости после метастазирования опухоли в кость, что примерно соответствует развившемуся метастатическому поражению костей. Ни одна из этих моделей не воспроизводит ранние этапы метастатического процесса, предшествующие эмболии и попаданию опухолевых клеток в кровоток. Если необходимо отслеживать рост первичной опухоли или метастазирование из первичного очага в кость, обычно предпочитают инокуляцию в жировую подушку молочной железы; однако очень немногие линии опухолевых клеток последовательно метастазируют в кость из первичного очага, исключением являются костно-предпочтительные клоны 4T1, представляющие собой карциному молочной железы мыши ^5,6.

В данной рукописи подробно описаны процедуры инокуляции и выделены ключевые этапы послеоперационного анализа. В частности, она включает культивирование клеток, процедуры инокуляции опухолевых клеток при внутрисердечном и внутрибольшеберцовом введении, а также краткую информацию о еженедельном мониторинге с помощью рентгенографии, флуоресцентного и гистоморфометрического анализов.

Протокол

1. Сотовые обслуживание

1. Многие кости метастатического подклонах MDA-MB-231 существуют, которые имеют переменную склонность к колонизации костей и роста. Для наших экспериментов мы используем клон происходит от GFP с метками MDA-MB-231 разработан в UTHSCA ^2. Этот конкретный суб-клон образуют видимые остеолитические поражения костей примерно в 3 прививки сообщению недель, с жертвоприношением в течение 4 недель.
2. Поддерживать клеток в DMEM, содержащей 10% FBS и 0,1 мг / мл пенициллина-стрептомицина при 37 ° С в 5-8% CO ₂ ^7.
3. Прохождение клеток на 80-90% слияния и повторно пластины при разведении 1:10 (это зависит от типа клеток и размер пластины. Для MDA-MB-231 клеток в Т-75 это примерно 6х10 ^5), который примерно каждые 72 часа.
4. MDA-MB-231 поддерживают клеток фибробластов в целом внешний вид с многочисленными псевдоподии. Любой округления свидетельствует о перенаселенности или других нежелательных стрессов, и его следует избегать, так как этоможет повлиять на метастатического потенциала в естественных условиях.
5. В идеале, клетки должны поддерживаться в культуре только на короткое время перед прививкой (мы рекомендуем менее 1 недели или пока у вас есть достаточное количество клеток для эксперимента), и новый флакон следует разморозить при округлении или изменения в клетке темпы роста происходит.

2. Сотовые подготовка

1. Trypsinize клеток на 80-90% слияния с 0,15% трипсин / ЭДТА (разбавлять 0,5% Gibco Трипсин EDTA 1:2 в PBS). Такая концентрация позволяет быстро отряда (<2 мин) и уменьшает слипание клеток.
2. Немедленно снять клеток из пластины с 10 мл ледяной DMEM, содержащей 10% FBS, пипетки на 15 мл коническую трубку и центрифуги при 200 мкг в течение 5 мин.
3. Ресуспендируют гранул в 50 мл коническую трубку в 25 мл ледяной PBS (без Са и Mg) и считать.
4. Центрифуга повторно гранул, и ресуспендируют на 10 ⁶ клеток на мл (внутрисердечных) или на 250000 cells/10 мкл (intratibial) в ледяной PBS. Температуратуры ФСБ важно для предотвращения слипания клеток и последующей эмболии после инъекции. Суспензии клеток должны оставаться на льду при выполнении инъекций и будет жизнеспособным и остаются без слипаются в течение 30 мин. Хотя точное число пластин необходимо будет варьироваться от следователя к следователю, мы обычно используем 1 Т-75 по цене от 8-10 мышей.

3. Прививка Внутрисердечные

1. 4-6 недельных самок (Foxn ню-/ -: Харлан) мышей используют для этих экспериментов, хотя другие с нарушением иммунной системы мышей (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID, и т.д.) также может быть использованы с человека экспериментов раковых клеток.
2. Голым мышам следует кормить Teklad 2920x диеты 5-10 дней до инъекции для уменьшения смертности от введения процедуры и сократить фоновой флуоресценции в процедурах томография (так как еда является люцерна бесплатно).
3. При использовании мыши, кроме ню / ню, удаление волос после бритья или использования Наир (в нашем опыте Nair работает лучше) на вентральной брюшной арEA перед началом процедуры.
4. Anesthetize мыши в изоляции камеры с использованием изофлурана испаритель (2,5% Iso: 2-3 л / мин O ₂₎ или другим предпочтительным анестезии (в нашем опыте изофлуран лучше переносится внутрисердечных прививки).
5. Перемещение на одну мышь в то время, в носовой конус из наркоза машину внутри нержавеющая сталь вентилируемый капот.
6. Поместите каждую мышь на спине, с грудью вверх.
7. Мыть грудь с 10% повидон / йода тампон / раствором с последующим 70% этанола, повторяя 2 раза.
8. Все мыши груди для инъекций (с помощью стерильного маркером или маркировка немного в сторону, чтобы сохранить место инъекции стерильными). Мы используем полпути знак расположен между выемкой грудины и верхнюю часть xyphoid процесс, и немного влево (анатомическая) от грудины. Нарисуйте маленький пузырек воздуха в шприц, чтобы создать пространство между поршнем и мениск (важно для видя сердечные импульсы) в 300 мкл 28 г ½ инсулиновый шприц, исоставляет 100 мкл клеток.
9. Держите иглу в вертикальном положении. Удерживая кожу мыши туго с другой стороны, вставить иглу.
10. Успешное включение в левый желудочек сердца должны привести различные ярко-красные импульса крови в шприце. На этой глубине, осторожно нажмите поршень шприца (100 мкл), без существенного движения иглы, чтобы избежать прокалывания сердца или разлив клеток в грудной полости.
11. После клетки вводили, подтянуть немного на поршень, чтобы создать небольшое количество отрицательное давление, чтобы уменьшить капает клеток в грудной полости.
12. Вытяните иглу прямо из груди, будучи уверены, чтобы избежать наклона иглы во время удаления, которая может разорвать оболочки сердца и вызвать кровотечение.
13. Применить мягкое давление на грудь на месте инъекции для уменьшения кровотечения.
14. Удалить мыши из носовой конус и продолжают применять светового давления примерно на 1 мин.
15. Подведите курсор к грелку до полного консознательной.
16. Если мышь начинает вращаться или дергаться после восстановления, вероятной причиной является эмболия. Inject мыши intraperitonally с 80-120 мг / кг кетамина, чтобы увеличить поток крови и сердечного выброса при снижении сосудистого сопротивления. Это должно помочь мышь проходит сгусток. После этого происходит, то лучше изменить клеточных препаратов, а это означает, что клетки слипания. Мы меняем клеточных препаратов примерно через 8 мышей, или 30 мин.

4. Intratibial

1. Inject мыши с Buprenex (0,1 мг / кг) или аналогичные утвержденной обезболивающего непосредственно перед процедурой.
2. Anesthetize мыши, используя изофлуран, а затем перейти к носовой конус и поддержания анестезии.
3. Очистите обе ноги с 10% повидон / йода тампон / раствор, а затем этанолом, повторять 2 раза. Депилировать ног (с Наир или аналогичного продукта) перед очисткой, если мех присутствует.
4. Аккуратно понять латеральной лодыжки, медиальной лодыжки и нижней половины голени с большим и указательным йUMB, затем согните ноги (сочетание сгибания и боковое вращение, так что колено видна и доступна.
5. Смочите кожу с 70% этанола, чтобы увеличить видимость, лежащие в основе связки коленной чашечки, которая должна быть видна как отдельное, толстая, белая линия. В то время как крепко держа лодыжки / ног мыши вставки 28g ½ иглы под коленную чашечку, до середины коленной связки, а в передней межмыщелковое в верхней части голени.
6. При установке иглы в кость, руководство внимательно за счет роста пластины с использованием устойчивой, твердой давления с небольшим действием бурения.
7. После проникновения большеберцовой пластины роста, игла встретит заметно меньшим сопротивлением.
8. Используйте мягкое, боковое движение иглы для обеспечения игла находится в голень и за счет роста пластины. Движение будет ограничено, если игла находится в нужном месте в голени.
9. Медленно нажать на поршень, вводят 10 мкл клеточной решение. Практически не сопротивление должно быть чувствовал в этот момент.
10. Slowly извлечения иглы.
11. Следуя той же процедуре, переходите к следующему ноги для введения 10 мкл PBS.
12. Удалить мышь от наркоза и держать на грелку, пока восстановлены.
13. Следить за мышами в течение следующих 24 часов и ввести дополнительные Buprenex каждые 12 часа, если животные продолжают демонстрировать признаки бедствия.

5. Изображениями время курса

1. Luciferase Imaging: Где это применимо, люциферазы изображений следует использовать, начиная с 7 дней после инокуляции опухолевых клеток (хотя в большинстве моделей костных метастазов, обнаруживаемых день ближе к 14). Мышь внутрибрюшинно вводили 150 мг / кг люциферин, под наркозом, и отображаемого 8 мин после инъекции с использованием ИВИС оборудования ^8.
2. GFP изображений: как правило GFP-экспрессирующих опухоли начинают быть обнаружены около 10-14 дней для intratibial инъекции и 16-21 внутрисердечных эксперименты с использованием Maestro съемочной аппаратуры (CRI) ^9. Коротко, мышей анестезировали изофлурана (3%) И выдерживают под наркозом через носовой конус в камеру Maestro изображений. Для наших EGFP-клеток, экспрессирующих мы используем сине набор фильтров (498 excitation/515 выбросов для EGFP) на 500 мс экспозиции с шагом 10 нм.
3. Faxitron (X-Ray): X-лучи принимаются еженедельно, начиная с 7-й день до 14. Поражения будет видна в внутрисердечных модели на 21 день и на неделю раньше в intratibial инъекций ^3. Наши рентгенографические данные для естественных бывших и в естественных условиях были получены с помощью Faxitron LX-60 на 35 кВ в течение 8 секунд воздействия.
4. Другие изображения: изображения условиях будет полностью основано на конкретных исследованиях. В дополнение к вышеуказанным методам, изображений живых животных на основе 3D микро-компьютерная томография (μCT), микро-позитронной эмиссионной томографии (μPET), и другие условия ^10,11 могут предоставить ценную информацию.

6. Мышь жертвы

1. Каждая модель имеет несколько иной ход времени. С MDA-MB-231 клеток мышей обычно становятся худосочные или страдающий параличом нижних конечностей от 21 до 35 дней, а обычно около 28-й день (IT вводили мышам между 21-28 дней).
2. После нескольких мышей развиваются поражения, которые начинают разрушаться через кортикальной кости, стал страдающий параличом нижних конечностей, или потерять 10-20% от веса тела, пожертвовать всем мышам в исследовании с использованием кетамина / ксилазина передозировки смещения шейных позвонков (или другой IACUC утвержденным методом).
3. Удалить кости, необходимых для дальнейшего исследования и хранить в буфере 4% формалином.
4. У мышей с опухолями груди является признаком пропустили инъекцию и должны быть исключены из исследования.

7. Ex Vivo анализ

1. μCT: сканирование в 70% этанола позволяет структурных и гистологических параметров, измеренных на того же образца кости.
2. Контура и анализа в соответствии с индивидуальными опытно-конструкторских и имеющегося оборудования ^10. Наши данные были получены с Scanco μCT 40 с использованием 12 мкМ резолюции.
3. Histomorphometry: Процесс образцы использованием предпочтительного гистологических методов и окраска гематоксилин / эозином ⁷

8. Представитель Результаты

После внутрисердечного или intratibial инокуляции опухолевых клеток (рис. 1) мышей контролируется еженедельно с помощью рентгенографии и флуоресценции (или люминесценции). Поражения обычно проявляются на рентгеновских неделю между 2 и 3, в то время как они могут быть видимой флуоресценции и люминесценции в начале недели 2, в зависимости от модели (рис. 2). Поражения видны как темные отверстия в кости, и становятся более выраженными с течением времени (рис. 3). Поражения были количественно, используя Metamorph анализа рентгенограмм и флуоресценции измеряли с помощью Maestro (CRI) приобретение визуализации и анализа программного обеспечения. Как поражений начинают расти, мышей часто становятся худосочные. Жертва необходима при мышей потеряли 10-20% своего первоначального веса. Состоянии мышах могут быстро меняться и должны быть проверены несколько раз в течение дня. В период с 3-4 недель мышей стали тащить один или оба задних конечностей и всего исследования была принесена в жертву. Изображения были приняты до жертвовать. После анестезии передозировки, брали кровь для измерения маркеров костного или других факторов. После смещения шейных позвонков, кожа была лишена от мыши и кости вырезали и очищены для бывших естественных изображений (рис. 3), которая позволит визуализации опухолевых очагов по крайней мере 7 дней раньше, чем в естественных методов визуализации. Как только изображение было завершено кости были помещены в маркированных кассеты и хранятся в формалине для фиксации и дальнейшей гистологической обработки или μCT анализа. Гистоморфометрия проводился на образцах для обозначения опухоли и BV / TV после μCT был выполнен на голени, чтобы определить количество костной деструкции (рис. 4).

/ 4260/4260fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Правильное размещение инъекций. Брюшной радиографический (A) взрослого грудной клетки мыши показывает правильное размещение иглы в ^4-м межреберье и в левый желудочек для прививки внутрисердечной. Анатомические ориентиры показано с горизонтальной пунктирной линии на грудине (они изложены в белом). На коже мыши грудины качество и xyphoid процесса служат в качестве ориентиров, а игла немного слева от грудины. Брюшной зрения радиографический (B) взрослого ногу мыши показывает правильное размещение иглы в проксимальных голени, соответствие между мыщелков. Из боковой перспективе кончике иглы помещается за бугристости большеберцовой кости и глубоко, чтобы эпифизарных пластин. Идеальное место для инъекций показан белым кругом.

Рисунок 2. Время хода кости модели метастазов. Прогрессирование окncer вызванных заболеванием костей показано с Х-лучами и GFP + флуоресцентные изображения опухолей в естественных условиях от intratibial инъекций (A) и внутрисердечной инъекции (B).

Рисунок 3. Время конечно внутрисердечной MDA-MB-231 модель Верхний ряд:. Ex изображение естественных условиях флуоресцентного микроскопа показывает на 0 день, 14, 21 и 28 после внутрисердечной инъекции MDA-MB-231. Обратите внимание, что опухолевых очагов на 14 день видны только в бывших естественных условиях после удаления мягких тканей. Нижний ряд: EX VIVO рентгенографических изображений одного и того же бедра иллюстрирующие остеолитические поражения костей. Обратите внимание, что разрушения кости обычно не видно, пока через 3 недели после сердечных инъекций.

Рисунок 4. Количественная оценка кости метастатического прогрессирования. GFP + опухоли, как визуализируется Maestro изображения бывших естественных условиях из Тибип. в неопухолевой подшипник мыши (А) и мышей через 4 недели после внутрисердечной инъекции GFP выражение MDA-MB-231 субклона (B). Опухолевых очагов коррелируют с участками костной деструкции, как показано Faxitron (D) по сравнению кости без опухоли (C). Кость структурных и минеральных данные из microCT измерений отображаются как 3D изображение здоровой кости (E) и опухоли костей подшипника (F), где области костной деструкции показано, как пустота области. Дальнейшие подробности костей и опухоли наблюдается в соответствующем H & E окрашенных гистологических срезов (G & H).

Обсуждение

Исследование индуцированного опухолью болезни костей полагаются на нескольких животных моделях из которых два наиболее часто используемых внутрисердечной и intratibial прививок. Во многих случаях внутрисердечной является лучшим вариантом для изучения метастазы в кости, однако она не представляет полной метастатического процесса, и, следовательно, молочной жировой ткани или других ортотопической инъекции в идеале должны быть использованы в этом направлении. Опухолевые клетки не метастазируют легко с основного сайта в бол...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
MDA-MB-231 человеческих клеток рака молочной железы	Первоначально ATCC-Внутренне клонировали и выбранные
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
FBS	Атлас биологического	F-0050a
Трипсин	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
Маэстро	CRi
μCT сканер	Scanco
Бестимусным голых мышей	Харлан	Fox ню - / -
Инсулиновые шприцы (300 мкл, 28,5 г)	Becton Dickinson	309300
ИВИС	Каверномер
Облученных диета грызунов	Teklad	2920x