Биохимически определенные крупные однослойные везикулы (LUVs) представляют собой удобную модельную систему для анализа взаимодействий белков семейства BCL-2, что имеет непосредственное значение для более глубокого понимания митохондриального пути апоптоза. В данной работе представлен метод получения LUVs, а также стандартные комбинации белков семейства BCL-2 и контроли для изучения пермеабилизации LUVs.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Экспертиза BCL-2 Семья функции с большим однослойные везикулы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Семейство BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) состоит примерно из двадцати белков, которые взаимодействуют друг с другом для поддержания выживаемости клеток или инициации апоптоза1. В ответ на клеточный стресс (например, повреждение ДНК) активируются проапоптотические эффекторы семейства BCL-2 — BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) и/или BAX (BCL-2 associated X protein), что нарушает целостность внешней мембраны митохондрий (OMM) посредством процесса, называемого пермеабилизацией внешней мембраны митохондрий (MOMP)1. После наступления MOMP проапоптотические белки (например, цитохром c) выходят в цитоплазму, стимулируют активацию каспаз, и быстро развивается апоптоз2.
Для того чтобы BAK/BAX могли индуцировать MOMP, им требуются кратковременные взаимодействия с представителями другого проапоптотического подмножества семейства BCL-2 — белками, содержащими только BH3-домен (BH3-only proteins), такими как BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Антиапоптотические белки семейства BCL-2 (например, BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) регулируют выживаемость клеток, жестко контролируя взаимодействия между BAK/BAX и BH3-only белками, способными напрямую индуцировать активацию BAK/BAX7,8. Кроме того, доступность антиапоптотических белков BCL-2 также определяется BH3-only белками-сенсибилизаторами/дерепрессорами, такими как BAD (BCL-2 antagonist of cell death) или PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), которые связывают и ингибируют антиапоптотические члены семейства7,9. Поскольку большая часть антиапоптотического репертуара BCL-2 локализована в OMM, решение клетки о сохранении выживаемости или индукции MOMP определяется множеством взаимодействий белков семейства BCL-2 на этой мембране.
Большие однослойные везикулы (БОВ) представляют собой биохимическую модель для изучения взаимосвязи между взаимодействиями белков семейства BCL-2 и пермеабилизацией мембран10. БОВ состоят из определенных липидов, собранных в соотношениях, установленных при исследовании липидного состава митохондрий Xenopus, экстрагированных растворителем (46,5% фосфатидилхолина, 28,5% фосфатидилэтаноламина, 9% фосфатидилинозитола, 9% фосфатидилсерина и 7% кардиолопина)10. Это удобная модельная система для прямого изучения функций семейства BCL-2, так как белковые и липидные компоненты полностью определены и доступны для манипуляций, что не всегда возможно при работе с первичными митохондриями. Хотя содержание кардиолопина в наружной мембране митохондрий (НММ) обычно не столь высоко, данная модель достоверно имитирует НММ для обеспечения функционирования белков семейства BCL-2. Более того, более recent модификация вышеописанного протокола позволяет проводить кинетический анализ белковых взаимодействий и измерения пермеабилизации мембран в режиме реального времени; этот метод основан на использовании БОВ, содержащих полианионный краситель (ANTS: 8-аминонафталин-1,3,6-трисульфокислота) и катионный гаситель (DPX: p-ксилен-бис-пиридиний бромид)11. По мере пермеабилизации БОВ краситель ANTS и гаситель DPX диффундируют друг от друга, что приводит к увеличению флуоресценции. В данной работе описаны общепринятые комбинации рекомбинантных белков семейства BCL-2 и контроли с использованием БОВ, содержащих ANTS/DPX.
Протокол
1. Смешивание липидов и создание липидной пленки
- Работая в вытяжном шкафу при минимальном освещении, перенесите растворенные в хлороформе липиды в янтарный стеклянный флакон объемом 1,5 ml, используя газоплотный стеклянный шприц Hamilton, промытый хлороформом. В результате смешивания получится примерно 4 mg липидов (Рисунок 1A).
- Кардиолипин 10 mg/ml (CL) — 63 μl
- Фосфатидилхолин 10 mg/ml (PC) — 84 μl
- Фосфатидилэтаноламин 10 mg/ml (PE) — 125 μl
- Фосфатидилинозитол 10 mg/ml (PI) — 59,5 μl
- Фосфатидилсерин 10 mg/ml (PS) — 65 μl
- Для удаления хлороформа направьте в флакон слабую струю инертного газа (напр., азота или аргона). После высыхания, что обычно занимает 2–3 часа, на дне и стенках флакона станет видна липидная пленка (Рисунок 1A).
2. Приготовление раствора липосом
- В микроцентрифужных пробирках объемом 1.7 ml приготовьте 500 μl 12.5 mM ANTS в буфере для LUV (0.2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ) и 500 μl 45 mM DPX в буфере для LUV (Рисунок 1B).
- Смешайте растворы ANTS и DPX, перемешайте на вортексе в течение 1 мин и подвергните воздействию ультразвука в течение 1 мин при комнатной температуре. Соникацию проводят в ультразвуковой водной бане (например, Branson 3510MTH, без специальных настроек, просто в режиме «вкл»). Это обеспечивает полное растворение и гомогенизацию растворов.
- Добавьте раствор ANTS/DPX к липидной пленке и запечатайте флакон парафильмом (Рисунок 1B).
- Проведите соникацию липидной пленки в указанной водной бане в течение 5 мин. После соникации раствор приобретет молочный вид. Убедитесь, что липидная пленка полностью растворилась, так как небольшие липидные агрегаты будут отрицательно сказываться на последующих этапах. Также проверьте стенки и дно флакона, чтобы убедиться в отсутствии остатков липидной пленки (Рисунок 1B).
3. Экструзия и очистка липосом
- Соберите экструдер в соответствии с инструкциями производителя, используя буфер LUV для увлажнения опор фильтра и поликарбонатной мембраны. Затяните корпус устройства так, чтобы не было потери объема при экструзии, но не слишком сильно, чтобы не разорвать мембрану. Также рекомендуется протестировать экструдер с буфером LUV, чтобы убедиться в отсутствии утечек или проблем.
- Поместите липидный раствор в правый шприц, проведите экструзию липидного раствора 31 раз; в итоге LUV окажутся в левом шприце; это гарантирует, что все липиды прошли через мембрану как минимум один раз. Первые несколько раз может потребоваться чуть большее давление для прохождения через мембрану. Если раствор внезапно быстро проходит через мембрану, проверьте мембрану на наличие разрывов и при необходимости замените её (Рисунок 1C).
- Подготовьте колонку для гравитационного разделения Sepharose S-500 объемом 10 ml (1,0 cm x 20 cm, объем сорбента 10 ml). Промойте колонку 3 объемами буфера LUV, дождитесь остановки потока и закройте крышкой. Поскольку этот этап занимает некоторое время, рекомендуется начать промывку, когда липиды объединяются для высушивания. Держите колонку закрытой до начала использования.
- Добавьте экструдированные LUV в колонку одним этапом, стараясь не нарушить поверхность сорбента. Дождитесь, пока буфер полностью вытечет из колонки, поток остановится, и закройте пробкой. Осторожно заполните колонку буфером LUV. Снова будьте осторожны при добавлении буфера, чтобы не потревожить гранулы сорбента (Рисунок 1C).
- Удалите пробку и соберите 6 фракций по 1 ml. LUV обычно элюируются в 3-й и 4-й фракциях, которые можно определить по мутному виду. После сбора фракций промойте колонку 5 объемами воды и 2 объемами 20% этанола. Храните колонку при 4 °C (Рисунок 1C).
- Храните фракции при 4 °C в темном месте до проведения анализа.
4. Анализ фракций колонки
- Теперь проверяют фракции колонки на флуоресценцию, сравнивая буфер LUV и буфер LUV с добавлением 0,5% CHAPS. Фракции, в которых флуоресценция возрастает в присутствии CHAPS, содержат LUV. В шесть лунок внесут по 100 μl буфера LUV или буфера LUV + 0,5% CHAPS, затем добавят по 5 μl соответствующей фракции и перемешают. Для всех исследований LUV используют непрозрачные черные необработанные 96-луночные планшеты (Рисунок 1D).
- Планшет считывают при 37 °C со следующими параметрами: длина волны возбуждения: 355 nm; длина волны эмиссии: 520 nm; усиление (напряжение): 125; положение оптики: сверху (Top); высота считывания: 5,5 mm. Данные настройки приведены для прибора BioTek H1 Synergy с использованием программного обеспечения Gen 5 2.0 (Рисунок 1D).
- Фракции 3 и 4 обычно демонстрируют 5–10-кратное увеличение флуоресценции. После анализа объединяют фракции, содержащие LUV, и хранят их при 4 °C в темноте; будет очищено примерно 2 ml липида с концентрацией ~ 2 mM (Рисунок 1D).
5. Исследования семейства BCL-2 с использованием LUV
- Белки BCL-2 тестируют на способность напрямую индуцировать пермеабилизацию LUV, а также на регуляцию этой активности. Анализы LUV обычно проводят в объемах 100 μl при 37 °C; анализ может выполняться либо в одной временной точке через 30–60 мин (Рисунки 2A-C, 3A-B), либо с помощью кинетических исследований каждые 1–2 мин на протяжении до 1 ч (Рисунок 2D). Представлен пример дизайна анализа с описанием компонентов, исходных/конечных концентраций и порядка их добавления (Таблица 1). Также рекомендуется настроить микропланшетный ридер на осторожное встряхивание планшета перед каждым измерением. Первые несколько минут часто дают спорадические показания (вероятно, из-за изменения температуры, перемешивания и т.д.), поэтому в кинетическом исследовании мы обычно учитываем данные после 2–3 измерений. Также нередко возникают большие планки погрешностей для некоторых условий из-за вариабельности партий LUV и эффективности белковых взаимодействий при пограничных концентрациях активации или ингибирования.
- Стоковые растворы белков семейства BCL-2 следует разводить в буфере для LUV до концентрации 100x. Необходимо провести титрование BAX, BID и всех остальных белков, чтобы определить минимальные концентрации, необходимые для обнаружения минимальной BAX-зависимой пермеабилизации LUV в отсутствие BID, а также значительного синергизма между BAX и BID. Кроме того, для всех остальных белков требуется титрование, чтобы сократить расход белка и минимизировать концентрации при последующем добавлении белков.
6. Репрезентативные результаты
Существует множество способов наблюдения и изучения регуляции пермеабилизации LUV, зависимой от белков семейства BCL-2. Для создания положительного контроля пермеабилизации LUV мы используем активированный детергентом BAX12. Детергент n-октил-β-D-глюкозид (OG) искусственно запускает активацию BAX (для 100 μl 2,3 μM OG-BAX: 5 μg BAX + 0,7% OG в буфере для LUV, инкубировать в течение 60 min при 4 °C, разделить на аликвоты и хранить при -80 °C), поэтому OG-BAX (10 - 100 nM) может быть использован в качестве надежного положительного контроля. Следует отметить, что концентрации OG ниже 0,025% не оказывают прямого влияния на пермеабилизацию LUV. Обработка 0,5% CHAPS используется для определения максимальной интенсивности флуоресценции LUV в одном анализе, и это значение принимается за 100%. Все варианты обработки должны быть выполнены в трех повторностях. Пример схемы контрольного анализа LUV приведен в Table 1, а соответствующие данные представлены на Figure 2A.
Необходимым отправным пунктом для изучения пермеабилизации LUV белками семейства BCL-2 является определение концентраций BAX и BID, обеспечивающих оптимальный выход. Поскольку отдельные препараты белков будут демонстрировать разную фоновую активность пермеабилизации, перед проведением более сложных анализов рекомендуется выполнить титрование. BAX (50 - 200 nM) и BID (0 - 10 nM) должны быть титрованы для достижения минимального фонового выхода и оптимального синергизма, как показано на рисунках 2B-C соответственно. Различные формы белка BID можно приобрести в R&D Systems; в качестве альтернативы пептид BH3-домена BID доступен в Anaspec. Коммерческих форм BAX, подходящих для анализов с LUV, не существует, поэтому его необходимо экспрессировать и очистить с использованием опубликованных методов3,13.
После установления концентраций BAX и BID, а также их синергизма, стандартным анализом является определение влияния антиапоптотических белков на пермеабилизацию LUV, зависящую от BAX и BID. BCL-xL представляет собой коммерчески доступный антиапоптотический белок семейства BCL-2, который дозозависимым образом ингибирует активность BAX и BID, как правило, при молярном избытке от 5 до 10 раз по отношению к BAX или BID (Рисунок 3A). Этот ингибирующий эффект может быть отменен путем последующего добавления белков, содержащих только BH3-домен (молярный избыток в 2–5 раз по отношению к BCL-xL), или пептидов BH3-домена (молярный избыток в 5–10 раз по отношению к BCL-xL), которые связываются с BCL-xL, тем самым позволяя BAX и BID синергически воздействовать и пермеабилизировать LUV (Рисунок 3B). На Рисунке 3B показан эффект полноразмерного рекомбинантного белка PUMAβ человека; пептид BH3-домена PUMA функционально аналогичен (данные не представлены)8. Этот эксперимент обычно называют «анализом депрессии» (de-repression assay), поскольку белок PUMA снимает ингибирующий эффект BCL-xL на BAX и BID. В идеале добавление депрессирующего белка/пептида с BH3-доменом должно оказывать минимальное влияние на активацию BAX14.
Рисунок 1. (A) Липиды, растворенные в хлороформе, объединяют, высушивают до образования липидной пленки и закрывают крышкой. (B) Готовят растворы ANTS и DPX, объединяют их и подвергают соникации для обеспечения полного растворения и гомогенизации. Раствор добавляют к липидной пленке, флакон герметизируют парафильмом и соникают в течение 5 min в водяной бане. Раствор приобретает молочный вид. (C) Соникатированный липидный раствор загружают в мини-экструдер, пропускают через него 31 раз и вносят в подготовленную колонку Sepharose S-500 для последующей очистки. (D) Фракции, полученные после эксклюзионной хроматографии, анализируют путем сравнения относительных единиц флуоресценции (RFU) в буфере для LUV и в буфере для LUV + 0.5% CHAPS. Показатель в «буфере для LUV» указывает на фоновую флуоресценцию интактных LUV; условие «буфер для LUV + 0.5% CHAPS» покажет увеличение флуоресценции, вызванное лизисом, что свидетельствует о наличии LUV. Фракции 3 и 4 обычно содержат LUV и объединяются после анализа. Фракции 5 и 6 содержат неинкорпорированный ANTS (т. е. не входящий в состав LUV после экструзии), который демонстрирует высокую флуоресценцию независимо от присутствия CHAPS. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Контрольные эксперименты с белками семейства BCL-2 и титрование BAX/BID с использованием LUV. (A) Контрольные эксперименты. LUV обрабатывали только буфером для LUV, 0,025% октилглюкозидом «OG», 50 nM BAX или 50 nM OG-BAX. LUV инкубировали в течение 60 min при 37 °C. Процент (%) пермеабилизации определяли путем вычитания флуоресценции образца с буфером из всех остальных образцов; 100% пермеабилизацию определяли по образцу, солюбилизированному 0,5% CHAPS; экспериментальные значения делили на значение для CHAPS для получения % пермеабилизации LUV. OG-BAX — это активированный детергентом BAX, который служит надежным положительным контролем пермеабилизации LUV. (B) Определение оптимальной концентрации BAX. LUV обрабатывали возрастающими концентрациями BAX (50 - 200 nM) в присутствии 10 nM C8-BID «BID» или только буфером. (C) Определение оптимальной концентрации BID. LUV обрабатывали возрастающими концентрациями BID (0 - 10 nM) в присутствии 100 nM BAX. (D) Пример набора данных кинетики пермеабилизации LUV. LUV обрабатывали BAX (100 nM) ± BID (10 nM). Измерения проводили каждые две min в течение 30 min с легким встряхиванием планшета в течение двух сек перед каждым измерением. Первые три измерения (0, 2 и 4 min) не включены в график. Минимальные и максимальные относительные единицы флуоресценции (RFU) определяли, как описано в разделе 4.3. Планки погрешностей на рисунках 2A-C представляют стандартное отклонение по данным трех повторностей. Данные на рисунке 2D представляют собой результаты дублирующего анализа.
Рисунок 3. Примеры распространенных взаимодействий белков семейства BCL-2, изученных с использованием LUV. (A) Пермеабилизация LUV, опосредованная BAX и BID, ингибируется BCL-xL. LUV инкубировали с 100 nM BAX, 10 nM BID и возрастающими концентрациями BCL-xL (0 - 500 nM). Инкубацию LUV проводили в течение 60 min при 37 °C. (B) PUMA снимает репрессию BCL-xL, стимулируя функцию BAX и BID. LUV инкубировали с комбинациями 100 nM BAX, 10 nM BID, 500 nM BCL-xL и (0 - 2.5 μM) PUMA в течение 60 min при 37 °C. PUMA в концентрации 2.5 μM использовали только с BAX. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение данных трех повторностей.
| Порядок добавления: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| УСЛОВИЯ | LUV Буфер | OG (0.7%) | BAX (2.3 μM) | OG-BAX (2.3 μM) | CHAPS (10%) | LUVs (2 mM) | ИТОГО |
| Буфер | 95 μl | 5 μl | 100 μl | ||||
| OG (0.015%) | 92.83 μl | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| BAX (50 nM) | 92.83 μl | - | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | ||
| OG-BAX (50 nM) | 92.83 μl | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| CHAPS (0.5%) | 90 μl | 5 μl | 5 μl | 100 μl |
Таблица 1. Пример контрольного анализа для определения влияния OG-BAX на пермеабилизацию LUV.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный метод получения LUV обеспечивает быстрый и эффективный способ тестирования функций различных белков семейства BCL-2, пептидов и соответствующих реагентов в биохимически определенной мембранной среде, аналогичной OMM. При использовании конечных значений для определения проницаемости LUV можно подготовить несколько планшетов для анализа сотен условий за один день. Мы обнаружили, что лимитирующими реагентами в этих анализах, как правило, являются качество и количество рекомбинантных белков, поэтому выделение доста...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов не заявлен.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории Чипука (Chipuk Laboratory) за коллегиальность и поддержку. Кроме того, мы выражаем признательность Томоми Куване и Дональду Ньюмейеру за разработку экспериментальной основы данной работы. Эта работа была поддержана грантами NIH CA157740 (J.E.C.) и пилотным проектом NIH P20AA017067 (J.E.C.). Данная работа также была частично поддержана исследовательским грантом 5-FY11-74 фонда March of Dimes (J.E.C.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо–этаноламин "PE" | Avanti | 850725C | |
| L-α-фосфатидилхолин (яйцо куриное) "PC" | Avanti | 840051C | |
| L-α-фосфатидилинозитол (печень говяжья) "PI" | Avanti | 840042C | |
| L-α-фосфатидилсерин (мозг свиной) "PS" | Avanti | 8400320 | |
| Кардиолипин (сердце говяжье — натриевая соль) "CL" | Avanti | 840012C | |
| Набор для мини-экструдера | Avanti | 610023 | |
| Мембрана PC 0,2 µm | Avanti | 610006 | |
| Черный 96-луночный планшет Costar | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| Расщепленный каспазой-8 человеческий BID | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| Человеческий BCL-xL (без C-конца) | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| Пептиды BH3-доменов BID/PUMA | Anaspec | 61711/62404 | |
| Гибридный многорежимный микропланшетный ридер Synergy H1 | BioTek | None |
Ссылки
- Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
- Gavathiotis, E. BAX activation is initiated at a novel interaction site. Nature. 455, 1076-1081 (2008).
- Dewson, G. To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions. Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).
- Dewson, G. Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices. Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).
- Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX. Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).
- Kuwana, T. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).
- Chipuk, J. E. Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).
- Letai, A. Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).
- Kuwana, T. lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. Cell. 111, 331-342 (2002).
- Lovell, J. F. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
- Hsu, Y. T., Youle, R. J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family. J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).
- Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization. Cell. 103, 645-654 (2000).
- Du, H. BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak. J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
