Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований

26.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4322

⸱

26 декабря 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Group Immune Regulation, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Research Group Infection Immunology, Institute of Medical Microbiology, Otto-von-Guericke University , 3Department of Experimental Immunology, Helmholtz Centre for Infection Research

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем быстрого выделения первичных мышиных тип II альвеолярных эпителиальных клеток (AECII) методом проточной цитометрии отрицательного отбора. Эти AECII показывают высокую жизнеспособность и чистоты и подходят для широкого спектра функциональных и молекулярных исследований в отношении их роли в респираторных заболеваний, таких как аутоиммунные и инфекционные заболевания.

Аннотация

В последние годы все чаще признается вклад альвеолярных эпителиальных клеток II типа (AECII) в различные аспекты иммунной регуляции в легких. Было показано, что AECII участвуют в продукции цитокинов в воспаленных дыхательных путях и даже могут выступать в качестве антигенпрезентирующих клеток как при инфекциях, так и при Т-клеточно mediated аутоиммунитете 1-8. Поэтому они представляют особый интерес и в таких клинических контекстах, как гиперреактивность дыхательных путей к чужеродным и собственным антигенам, а также при инфекциях, которые прямо или косвенно воздействуют на AECII. Однако наши представления о детальных иммунологических функциях, выполняемых альвеолярными эпителиальными клетками II типа в здоровых легких, а также при воспалении, остаются фрагментарными. Многие исследования функций AECII проводятся с использованием линий альвеолярных эпителиальных клеток мыши или человека 9-12. Работа с клеточными линиями, безусловно, дает ряд преимуществ, таких как доступность большого количества клеток для обширного анализа. Однако мы полагаем, что использование первичных AECII мыши позволяет лучше понять роль этого типа клеток в таких сложных процессах, как инфекция или аутоиммунное воспаление. Первичные AECII мыши могут быть изолированы непосредственно из животных, страдающих такими респираторными заболеваниями, а значит, они подвергались воздействию всех дополнительных внешних факторов, играющих роль в анализируемой ситуации. Например, жизнеспособные AECII могут быть выделены из мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа А, который в первую очередь использует эти клетки для репликации 13. Важно отметить, что путем инфекции ex vivo AECII, выделенных из здоровых мышей, можно расширить исследования клеточных ответов, возникающих при инфицировании.

Наш протокол выделения первичных AECII мыши основан на ферментативном переваривании легкого мыши с последующим мечением полученной клеточной суспензии антителами, специфичными к CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 и CD16/CD32. Гранулярные AECII затем идентифицируются как немеченая популяция клеток с высоким боковым светорассеянием (SSChigh) и отделяются методом сортинга клеток с флуоресцентной активацией 3.

По сравнению с альтернативными методами выделения первичных эпителиальных клеток из легких мыши, наш протокол проточной цитометрической изоляции AECII путем негативной селекции позволяет получить нетронутые, высокожизнеспособные и чистые AECII за относительно короткое время. Кроме того, в отличие от традиционных методов изоляции путем паннинга и обеднения лимфоцитов с помощью связывания с магнитными бусинами, конъюгированными с антителами 14, 15, проточная цитометрическая сортировка клеток позволяет проводить дифференциацию по размеру и гранулярности клеток. При наличии оборудования для проточной цитометрической сортировки описанная процедура может быть реализована с относительно низкими затратами. Помимо стандартных антител и ферментов для дезинтеграции легких, дополнительные реагенты, такие как магнитные бусины, не требуются. Выделенные клетки пригодны для широкого спектра функциональных и молекулярных исследований, включая культивирование in vitro и анализы стимуляции Т-клеток, а также анализ транскриптома, протеома или секретома 3, 4.

Протокол

Подробная информация о необходимых реактивов и материалов, перечисленных в таблице в конце протокола ниже. Перед началом работы, подготовить 15 мл трубки (по одному на мышь), содержащий 4 мл диспазы и предварительно нагреть их до 37 ° С на водяной бане. В нагревательный блок, вскоре нагревать небольшие аликвоты 1% легкоплавкой агарозы (в воде) до 95 ° C, пока сжиженный, а затем охлаждают до 45 ° C до использования.

1. Подготовка мышь легких

  1. Жертва мыши, CO 2 удушья. Примечание: Не выполняйте смещения шейных позвонков, так как это повредит трахеи, так что следующие шаги протоколов, таких как установка легких жидкость, не может быть выполнена успешно. Убедитесь, потеря ноцицептивных рефлексов.
  2. Спрей мыши с этанолом и сделать длинный разрез вдоль вентральной срединной линии тела. Потяните брюшной меха и кожи, а затем и аккуратно вырезать и удалить брюшины.
  3. Обескровитьмышь за счет сокращения левой и правой яремной вены (Vena jugularis), а также почечной артерии (Arteria renalis). Удалить течет кровь с ткани.
  4. Осторожно прокола, а затем удалить диафрагму, чтобы открыть сердца и легких путем срезания ребер. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не повредить легкие.
  5. С 26G канюли и 10 мл шприц, заполненный холодным фосфатным буферным раствором (PBS), прокол правого желудочка сердца и заливать легких с PBS до бесплатного крови.
  6. Вырезать и удалить слюнные железы, чтобы разоблачить трахеи. Также аккуратно вырезать мышцы окружающие трахею.
  7. Вставьте канюлю 22G пребывающего в трахею, извлеките иглу и нажать на пластиковый катетер к легким. Закрепить катетер, связывая небольшой кусочек пряжи вокруг трахеи и катетер.

2. Ферментативного расщепления ткани легких

При желании, бронхоальвеолярного лаважа образцы жидкости может бытьподготовленный промывки легкие через катетер, введенный в трахею с PBS или среднего до следующего шага.

  1. Использование 2 мл шприц, тщательно привить максимальный объем 2 мл диспазы (от 4 мл аликвоты) в легких через катетер, чтобы все лепестки раскрываются полностью. Заменить шприц с 1 мл шприц, содержащий 0,5 мл сжиженного агарозы, а также вселить в легких.
  2. Оставьте шприц катетера для предотвращения обратного потока из агарозы и сразу покрытия легкого с лабораторией бумаги и льда. Пусть агарозном геле в течение нескольких минут.
  3. Снимите салфетку, лед, шприцы и катетеры, сократить трахеи и акцизных легких, сердца и вилочковой железы из груди. Затем промыть легких в блюдо с PBS и удалить сердце, вилочковой железе и оставшиеся трахеи.
  4. Положить легких в оставшиеся 2 мл диспазы и инкубировать при комнатной температуре в течение 45 мин.

3. Подготовка легкихСуспензии клеток

  1. Удалить из легких диспазы и передать его в чашку, содержащую 7 мл anti-CD16/32 антитела (1 мкг / мл конечная концентрация) в среде DMEM и 100 мкл ДНКазы.
  2. Используя щипцы, полностью разрушаются ткани легких, потянув ее на части и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре, мягко покачиваясь на рокера составляет 200 оборотов в минуту. При желании, суспензии клеток можно хранить при температуре 4 ° C до следующего шага.
  3. Фильтр клеточной суспензии через нейлоновые сетки сначала с 100 мкм, а затем с 70 мкм, 48 мкм и 30 мкм поры. Позаботьтесь, чтобы промыть каждой сетки, а также труб и посуда тщательно DMEM, чтобы минимизировать потери клеток и увеличить доходность. Если вы объединения образцов, это может быть достигнуто здесь в дальнейшем прохождение клеток суспензии от мышей одной группы через тот же фильтр. Обновление фильтра в случае засорения.
  4. В зависимости от объема, передает фильтрата с одним или более 50 мл пробирок ицентрифуге в течение 15 мин при 160 мкг и 4 ° C. Удалить супернатант.
  5. Ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (0,15 М NH 4 Cl, 0,01 М KHCO 3, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,2) и быстро прекратить лизис путем добавления 13 мл среды DMEM. Перенесите раствор в 15 мл трубки и центрифуги в течение 12 мин при 160 мкг и 4 ° C.

4. Окрашивание антител для проточной цитометрии Cell-сортировкой

  1. Ресуспендируют клеток в 3 мл первичного коктейль антител, подготовленный в среде DMEM в разведении подходит для проточной цитометрии. (Антитела были ранее титровать для оптимальных рабочих разведений путем окрашивания 1 х 10 6 спленоцитов в объеме 100 мкл. 3 мл использование первичных коктейль антител содержащих оптимальные концентрации для каждого из используемых антител к клеткам объединения с пяти мышей. Если больше мышей, объединяют в одном образце, регулировать громкость).
  2. Для окрашивания, инкубировать клетки в течение 10 минут в темнотепри 4 ° C.
  3. Вымойте клетки путем заполнения 15 мл трубки с DMEM среде и центрифугирования в течение 12 мин при 160 мкг и 4 ° C.
  4. В случае несвязанных или биотинилированные антитела были использованы в 4.1: Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 2 - 3 мл вторичном коктейль антител. Пятно в течение 10 мин при 4 ° С в темноте.
  5. Вымойте клетки путем заполнения трубы с DMEM и центрифугирования в течение 12 мин при 160 мкг и 4 ° C.
  6. Ресуспендируют клеток в 1 мл DMEM и фильтр предварительной очистки через 50 мкм фильтр в трубе для мобильных сортировки. Дополнительно: Считаем клетки, чтобы получить общее количество клеток в суспензии клеток легких.

5. Cell-сортировка

  1. Смешать клеток путем перемешивания до сортировки. Используйте 100 мкм насадка для клеточной сортировки AECII. Оболочка давления жидкости, а также лазерного излучения и обнаружения длин волн зависят от инструментов, используемых для проточной цитометрии клеточного сортировки, а также флуорохромы используется в Антибоды окрашивания процедура.
  2. Ворота на SSC высококачественных элементов, которые являются негативными для флуорохромы используется для окрашивания и сортировки в пробирке, содержащей DMEM. Используйте вперед разброс высоты (FSC-H) по сравнению области (FSC-A) и в сторону разброс высоты (SSC-H) по сравнению области (SSC-A) окна, чтобы исключить любые дублеты или клеточных агрегатов (подробнее см. строб-стратегии в Рисунок 1).
  3. В целях сбора отсортированных клеток центрифуге в течение 20 мин при 280 мкг и 4 ° C.
  4. Ресуспендируют клеток в культуре среднего или буфера, необходимого для последующего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При сортировке клеток легких суспензий изолированы от здоровых мышей, ворота AECII, как правило, составляет около 42 ± 10% от всех событий. Этот процент может быть значительно ниже, если мышах с респираторными заболеваниями, такими как вирусные инфекции используются, в качестве начальной суспензии клеток будет содержать значительно выше доля лимфоциты и другие клетки иммунной системы на работу в дыхательные пути. Для AECII изолированы от IAV инфицированных легких на 3-й день после заражения мы наблюдали снижение частоты...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наш протокол для выделения мышиных AECII с помощью проточной цитометрии предлагает быстрый способ доступа к первичной клетки из легких мышей целый ряд функциональных и молекулярных исследований. Описанная процедура дает весьма жизнеспособной и чистых популяций AECII, достаточные количества прямых последующего анализа, такие как выделения РНК (см. рисунок 2b) и транскриптом исследований. Для функциональных приложений, также можно культуре изолированных клеток, что позволяет, например, генерация ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить М. Höxter для оказания технической помощи в сортировке первичных мышиных AECII от уровня биобезопасности 2 пробы.

Эта работа была поддержана грантами от Немецкого исследовательского фонда (DFG) в БД (SFB587, TP 12 и BR2221/1-1) и стипендию от Ганновера биомедицинских исследований Школы (DFG GSC 108) до AA. DB поддерживает инициативу Президента и сети Фонда имени Гельмгольца немецких научно-исследовательских центров (HGF) по контракту W2/W3-029 номер.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
постоянная канюля 22G Introcan Braun REF 4252098B
Диспазы, 100 мл (5000 caseinolytic единиц) BD Biosciences 354235 аликвоты по 4 мл на 15 мл пробирок, хранить при -20 ° C
Biozym налет Агароза Biozym 840101 1% вес / объем в H 2 O
Дезоксирибонуклеазы я из бычьей поджелудочной железы, 2000 Куниц ЕД / флакон Sigma-Aldrich D4263 недавно растворить содержимое 1 флакона в 300 мкл DMEM
DMEM Gibco 22320-022 используется в качестве предоставляемых производителем (Low Glucose, пируват, HEPES)
ячейки сита (100 мкм, 75 мкм) BD Falcon 352360, 352350
нейлоновая сетка (48 мкм, 30 мкм) Buckmann GmbH 03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 мкм фильтр PARTEC 04-0042-2317
антимышиным CD16/CD32 BioLegend 101302 Клон 93; очищенный
антимышиным F4/80 BioLegend 123116 Клон BM8; APC связанная
антимышиным CD11b BioLegend 101208 Клон M1/70, ЧП связанная
антимышиным CD11c BioLegend 117310 Клон N418, связанных APC
антимышинымCD45 BioLegend 103102 Клон 30-F11; очищенный
анти-CD19 мыши eBioscience 12-0193-83 eBio 1D3, связанных PE
поликлональные козьи анти-IgG крысы BD Pharmingen 550767 поликлональных, PE связанных

Антитела, связанные с альтернативными флуорохромы могут быть использованы, в зависимости от цитометра и лазеры доступны.

Ссылки

  1. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
  2. Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
  3. Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47(2007).
  4. Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
  5. Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
  6. Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
  7. Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
  8. Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
  9. Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
  10. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
  11. Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
  12. Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15(2012).
  13. Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
  14. Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
  15. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
  16. Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
  17. Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
  18. Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
  19. Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Primary Murine CellsLung Tissue DigestionNegative Selection SortingCD11c CD11b F4 80Sideward Scatter HighFluorescence Activated Cell SortingErythrocyte Lysis BufferFunctional Molecular Assays
Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.