Методическая статья

Использование РНК-опосредованного вмешательства стратегии кормления для выявления генов, участвующих в размерах тела регулированию в Нематода C. Элеганс

DOI:

10.3791/4373

⸱

13 февраля 2013 г.

 ,  , 
1Department of Science, Borough of Manhattan Community College, City Universtiy of New York (CUNY), 2Department of Biology, Queens College, The City University of New York (CUNY), 3Biochemistry Program, The Graduate Center, Queens College, The City University of New York (CUNY)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы продемонстрируем, как использовать технику RNAi кормления, чтобы сбить генов-мишеней и оценка размеров тела фенотип C. Элеганс. Этот метод может быть использован для большого экрана масштаба для выявления потенциальных генетических компонентов интереса, таких как тех, кто участвует в размерах тела регулирования DBL-1/TGF-β сигнализации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двухцепочечной РНК-опосредованного вмешательства (RNAi) является эффективной стратегией, чтобы сбить цель экспрессии гена 1-3. Это была применена для многих модельных систем, включая растения, беспозвоночных и позвоночных животных. Существуют различные методы для достижения RNAi в естественных 4,5. Например, ген-мишень может быть преобразована в векторе RNAi, а затем постоянно или временно превращаются в клеточные линии, или первичные элементы для достижения эффекта гена нокдаун, можно также синтезировать двунитевых олигонуклеотидов от специфических генов-мишеней (RNAi олигонуклеотиды) может быть временно превращаются в клеточные линии или первичные клетки, чтобы заставить замолчать гены-мишени, или синтезированные двухцепочечной молекулы РНК могут быть микроинъекции в организм. Так как нематоды C. Элеганс используется бактериями как источник пищи, кормление животных с бактериями, выразив двухцепочечной РНК против генов-мишеней обеспечивает жизнеспособную стратегию 6. Здесь мы представляем кормления RNAiМетод забить фенотип размера тела. Размер тела в C. Элеганс регулируется, прежде всего, TGF-β - как лиганд DBL-1, так что этот тест подходит для идентификации TGF-β сигнализации компоненты 7. Мы использовали различные штаммы в том числе два RNAi гиперчувствительной штаммов, чтобы повторить эксперименты RNAi кормления. Наши результаты показали, что СБР-3 штамма дали нам лучшее ожидаемый фенотип RNAi. Метод прост для выполнения, воспроизводимые и легко поддаются количественной оценке. Кроме того, наш протокол сводит к минимуму использование специализированного оборудования, поэтому она подходит для небольших лабораторий или те, в основном студентов учреждений.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка RNAi кормления Плиты Проведение последовательности гена-мишени

  1. При использовании коммерчески доступных RNAi библиотеки (например, от источника BioScience Lifesciences), переходите к шагу 1.4. Кроме того, клонирование последовательности целевого гена в вектор L4440, обычно используемые червем RNAi плазмиды 8, по стандартному протоколу клонирования.
  2. Преобразование рекомбинантной плазмиды в бактериальном штамме HT115 (DE3), культуру их на пластинах LB агар с 25 мкг / мл карбенициллин и 12,5 мкг / мл тетрациклина, и выбрать одного клона для использования в будущем.
  3. Между тем, преобразовать пустые L4440 вектор в бактериальном штамме HT115 для использования в качестве контроля для экспериментов.
  4. Культура и рекомбинантные и пустые L4440 несущих бактерий в 1 мл бульона LB с 100 мкг / мл ампициллина в течение ночи при 37 ° C. Тетрациклин не добавил в связи с тем, что она снижает эффективность РНК-интерференции.
  5. Добавить еще 5 мл LB бульоне с 100 мкг / мл ампициллина в ночь cultuповторно, инкубировать в течение еще 4-6 ч при 37 ° C.
  6. Семенной 0,5 мл рекомбинантного или пустой L4440 несущих бактериальной культуры на пластинах RNAi червей. Этикетка все пластины с клоном имя.
  7. Отметить пластины и инкубировать в течение ночи при 37 ° C рост бактериальных газонов; эти RNAi пластины с или без целевой последовательности гена. По крайней мере, 2 пластины должны быть подготовлены для каждого условия.

2. Культура червей на пластинах RNAi кормления

  1. Пламя стерилизации кончик червя выбор платиновой проволоки. Используйте червя выбрать, чтобы подобрать 6-10 четвёртую личиночной стадии (L4) гермафродиты на каждой пластине РНК-интерференции, который содержит либо рекомбинантные или пустой L4440, животные будут использовать бактерии в качестве источника пищи.
  2. Пусть гермафродиты расти при 20 ° C (стандартное условие культуры C. Элеганс) в течение ночи, они станут молодые люди на следующий день.
  3. Передача 6-10 молодых людей в новую соответственно промаркированы и подготовлены пластины RNAi.
  4. ПустьВзрослые откладывают яйца в течение 4-6 ч, затем удалить все взрослые от пластины; этот шаг, чтобы синхронизировать потомства. Как только матерям будут удалены, начинают отсчитывать время. Это время нуля.
  5. Инкубируйте пластины при температуре 20 ° C, чтобы животные растут конкретные стадии развития, и в этом протоколе, мы выбираем молодых людей для фенотипического анализа. Для нокдаунов, которые развиваются на нормальной скорости, 72 ч инкубации является достаточным для животных, чтобы стать молодые люди. Тем не менее, различные гены влияют на развитие животных по-разному. Если RNAi вызывает животные расти с разной скоростью, молодые люди могут быть определены как те, не более 24 часов с прошлым L4 завершена разработка и вульвы 2-6 эмбрионов в матку (если плодородный). Для выявления других стадиях развития, следователь должен использовать половых и вульвы развития в качестве ориентира.

3. Оценка Размер тела Фенотипы RNAi Обработанные черви

  1. Поместите два слоя цветного ленты этикетки на стекле. Сделайте дваслайды себе стекло. Затем поместите новое предметное стекло между двумя слайдами с лентой. Растопить 2% агарозном в воде; применять одну каплю в центре нового предметное стекло, а затем нажмите вторую предметное стекло на верхней, чтобы сделать тонким слоем 2% агарозном как описано выше 9.
  2. После агарозном затвердевает, снимите верхнюю предметное стекло, стекло с агарозном площадка готова для загрузки червей. Этикетка слайд с названием клон.
  3. Добавить 10 мкл 25 мМ NaN 3 в агарозном площадку, возьмите 30-40 животных в NaN 3 решения, чтобы обездвижить их, затем положить покровное на вершине; повтора как для рекомбинантного и пустые L4440 несущих RNAi-обработанных животных.
  4. Изображение червей под рассекает микроскопом, используя 2.5x объектив, здесь мы используем Leica цифровой камеры с поддержкой программного обеспечения Qcapture.
  5. Для калибровки, в первую захвата изображения стандартной линейки микрометра. Затем откройте изображение в Image-Pro программного обеспечения, нажмите на "мера" и выберите "калибровка" выберите"Пространственной мастер калибровки". С "Калибровка активного образа" выбраны, нажмите на кнопку "Далее". Введите имя для калибровки и убедиться, что пространственные единицы ссылкой установлены на микрометр. Затем проверьте, "создать ссылку калибровка" и нажмите кнопку "Далее". Нажмите на "опорной линии ничья". Бар ссылкой шкале появится. Переместите шкалы в соответствии с концами микрометр, то указать, что ссылка указывает 1000 единиц. Нажмите "OK", "Next" и "Finish".
  6. После того как программа откалибровать, открыть червь изображения. Затем выберите в соответствии с "мерой" меню выберите пункт "калибровка", а затем нажмите на кнопку "Выбрать пространственные". В выпадающем меню выберите имя файла создается для калибровки микрометров. Затем, в соответствии с "мерой" меню выберите пункт "измерений". В открывшемся окне выберите свободно рисовать инструментом и проследить линию через центр тела животного от головы до хвоста с компьютерной мыши (рис. 1). Длина будут представлены в окне. Сейчасу вас есть две группы данных: длина тела животных, получавших целевого гена РНК-интерференции и контроля животных, получавших с пустыми L4440 вектор.
  7. Экспорт измерения длины в файл Microsoft Excel или другого подходящего статистического программного обеспечения. Анализ данных путем вычисления среднего значения и стандартного отклонения для каждого образца. Затем сравнить образцы с использованием Стьюдента-тест.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нашем исследовании мы ориентируемся на размер тела регулирования DBL-1/TGF-β пути. Потеря функции DBL-1 путей приводит к небольшим размером тела, в том числе короче длины тела по сравнению с диким типом животных 7,10,11. Таким образом, экраны для C. Элеганс мутантов размером тела способны выявлять TGF-β сигнализации компоненты и модификаторы. DBL-1 сигнализации опосредовано консервативных TGF-β пути передачи сигнала, которая включает клеточной поверхности рецепторов и внутриклеточных Smad преобразо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе, мы описываем наш метод для определения размера тела дефектных мутантов C. Элеганс от кормления RNAi. Этот метод применим для выявления TGF-β компоненты сигнализации. Поскольку такие компоненты высоко консервативны в процессе эволюции 15, такие экраны имеют отношение к выяснению молекулярных механизмов TGF-β сигнализации во всех многоклеточных. Важным фактором при проектировании такой экран является исходным штаммом. Мы показали, что оба эри-1; лин-15b и СБР-3 являю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Джеймса Кларка для обеспечения фигурки животных в различные моменты времени развития. C. Элеганс штаммов в этом исследовании, были получены из Caenorhabditis генетический центр, который поддерживается NIH Национальный научно-исследовательский центр ресурсов (NCRR). Эта работа была поддержана CIRG 1817 от CUNY, чтобы JL и CSD, а также путем NIH 1R15GM073678-01 и 1R15GM097692-01 до CSD Мы благодарим д-р Уильям Дж. Райс, д-р Наталья Хольцман, и Мелисса Сильвестрини замечания по рукописи. Эта работа была проведена в частичное выполнение требований к степени кандидата наук в Высшей центра Городского университета Нью-Йорка (С. Xiong).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пластинами RNAi червей
17,7 г Worm средний Mix
60 г агара
Добавить H 2 O до 3 литров. Автоклав.
Добавьте 3 мл 1М IPTG (стерильная) и 3 мл 25 мг / мл Карбенициллин (стерильная), а затем вылейте в 60 мм чашки Петри.

Червь пластины
17,7 г Worm средний Mix
0,6 г стрептомицина сульфат
60 г агара
Добавить H 2 O до 3 литров. Автоклав. Налейте в 60 мм чашки Петри.

Mix Worm Средний
55 г Трис-Cl
24 г Трис-OH
310 г Bacto Пептон
800 мг холестерина
200 г NaCl
Тщательно перемешайте и обязательно, чтобы избежать куски, это порошкообразную смесь можно хранить в течение многих месяцев до начала использования.

2% агарозном
0,5 г агарозы
ОбъявлениеD 25 мл дН 2 O. Тепло в микроволновой печи до полного растворения.

1M изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG)
2 г IPTG
Растворите in10 мл дН 2 O

1M NaN 3
6,5 г NaN 3
Добавить дН 2 O в 100 мл

25 мМ NaN 3
2,5 мл 1М NaN 3
Добавить дН 2 O в 100 мл

Caenorhabditis Элеганс от Caenorhabditis генетический центр
L4440 плазмиды (ампициллин несет ген устойчивости)
Бактерии напрягать HT115 (DE3) (содержит IPTG индуцибельной T7-полимеразы; недостаточно для РНКазы III гена (dsRNAse), которая также осуществляет тетрациклину ген устойчивости) 16
60 мм чашки Петри
100 мм чашки Петри
14 мл с круглым дном трубы Сокол культуры
стеклах
покровные стекла
1-20 мкл пипетки
20-200 мкл пипетки
200-1000 мклпипетки
1-200 мкл советы пипетки
200-1000 мкл советы пипетки
1,5 мл Eppendorf трубы
платиновой проволоки червя выбор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
  2. Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
  3. Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
  4. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
  5. Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
  6. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
  7. Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
  8. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  9. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
  10. Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
  11. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
  12. Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
  13. Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
  15. De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
  16. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RNA InterferenceRNAi FeedingGene KnockdownTGF beta SignalingMicroscopic ImagingLength MeasurementStudent s T testWorm Strains

Похожие статьи