Внутрисосудистое перфузии Ink Углерод позволяет надежно визуализации сосудов головного мозга

Mohammad R. Hasan; Josephine Herz; Dirk M. Hermann; Thorsten R. Doeppner

doi:10.3791/4374

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутрисосудистое перфузии Ink Углерод позволяет надежно визуализации сосудов головного мозга

15.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4374

⸱

4 января 2013 г.

Mohammad R. Hasan¹ , Josephine Herz¹ , Dirk M. Hermann¹ , Thorsten R. Doeppner¹

¹Department of Neurology, University of Duisburg-Essen Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Анализ грызунов цереброваскулярных анатомии играет важную роль в экспериментальных исследованиях инсульта. В этом контексте внутрисосудистого перфузии с цветным латексом была рассмотрена в качестве стандартного инструмента в течение нескольких лет. Однако, этот метод предполагает различные технические ограничения, которые подрывают его воспроизводимости. Здесь мы рассмотрим простой способ для визуализации сосудов головного мозга в воспроизводимым образом. Инъекции смесь двух коммерчески доступных углерода черные чернила через левый желудочек инфаркт результатов в достаточном наполнении сосудов головного мозга с высоким визуализация контраста. Мы успешно применять эту технику, чтобы определить анастомоза между точками церебральных сосудистых территорий мышей с различным генетическим фоном. Мы, наконец, дать показания, что это новый и простой способ окрашивания судна могут быть объединены с трифенилтетразолий хлорид (TTC) окрашивание - широко используемый инструмент для наблюдения и анализа объемов инфаркта у мышей.

Аннотация

Анатомического строения сосудов головного мозга является ключевым фактором для мозга гемодинамики, а также от степени серьезности травмы после ишемических инсультов. Церебральной сосудистой динамически реагирует на различные патофизиологические состояния и оно проявляет значительные различия между штаммами и в условиях генетических манипуляций. По сути, надежная техника для окрашивания внутричерепного судна необходимо в целях изучения патогенеза ишемического инсульта. До недавнего времени, множество различных методов был использован для визуализации мозговой сосудистой включая инъекции смола низкой вязкости, Araldite F, желатина смешивают с различными красителями ¹ (т.е. карминно-красные, тушь) или латекса с ² или без ³ сажи. Перфузии белого латекса соединение через восходящую аорту была впервые сообщил Койл и Jokelainen ^3. Maeda и др. ^2. Изменили протокол, добавив карбоп черные чернила на латекс соединения для улучшения визуализации контрастности сосудов после солевого перфузии головного мозга. Тем не менее, неэффективная и неадекватная перфузия заполнения сосудов часто испытывал из-за высокой вязкости соединения латекса ^4. Таким образом, мы описали простой и экономически эффективный метод, используя смесь двух коммерчески доступных углерода черные чернила (CB1 и CB2) для визуализации мозговой сосудистой воспроизводимым образом ^5. Мы показали, что перфузия CB1 + CB2 у мышей приводит к окрашиванию значительно меньших сосудов головного мозга в более высокую плотность по сравнению с латексом перфузии ^5. Здесь мы описываем наш протокол для определения точки анастомоза между передней (ACA) и средней мозговой артерии (СМА), чтобы изучить судно изменений у мышей с различным генетическим фоном. Наконец, мы демонстрируем возможности нашей техники в переходном церебральной ишемии модели у мышей путем объединения CB1 +CB2-опосредованной судна окрашивания TTC окрашивания в различные степени ишемического повреждения.

Протокол

1. Животные

Эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены местными властями. Для всех экспериментов, C57BL6 / J мышей дикого типа, ApolipoproteinE ^{- / -} (ApoE нокаутом) и SV129 мышей (12-16 недель, 26-30 г массы тела, 5-6 животных в опытной группе) были использованы.

2. Окрашивание сосудов головного мозга с цветной латекс

Приготовить смесь из 25 мкл углерода черными чернилами (Herlitz, Германия) с 0,5 мл соединения латекса (Пебео, Франция) в соотношении 1:20 в EP трубку и нагреть смесь при 37 ° С на водяной бане. Сбор смеси в 2 мл шприц с иглой 28-30G до обезболивания животных.
Растворите 50 мг papavarine порошок гидрохлорида в 1 мл стерильного физиологического раствора. Сбор решение в инсулиновый шприц. Оторвать иглы из другой стерильный шприц инсулина. Разместите эту иглу в конце 20 вм PE10 трубку. Теперь придаем этому PE10 трубки на иглу инсулина шприц, содержащий раствор гидрохлорида papavarine, который будет введен через бедренную вену, чтобы обеспечить расширение сосудов и надлежащего заполнения сосудов.
Подготовьте еще два шприца инсулина, каждая из которых содержит 1 мл физиологического раствора. Инсулиновые шприцы позволяют бесперебойное предоставление закачиваемой жидкости в точном месте. Однако, из-за высокой вязкости латекса, альтернативные 1 мл шприца со съемной широкой иглы должен быть использован.
Возьмите все шприцы и стерилизовать инструменты рассекает близко к операционной стадии. Распространение хирургических лист Draper вокруг стадии эксплуатации. Стадии эксплуатации должна быть достаточно освещена и операционный микроскоп может быть использован в случае необходимости.
Теперь измерения веса тела C57BL6 / J мыши, а затем вызвать анестезию с 5% испаряется изофлурана в 70% N ₂ O и 30% O _2. Продолжить анестезии 1% испаряется изофлурана. После надлежащего ПОЗИЦИОНИРОВАНИЕг мышью на спине и фиксации конечностей, оценить глубину анестезии. Затем порезать кожу над левой бедренной вены и найдите вену. Вставьте резкий кончик иглы размещены на PE10 трубку и медленно вводят раствор гидрохлорида papavarine в размере 100 мкл в минуту (50 мг / кг массы тела).
После инъекции, разрезать брюшную полость и прокалывают мембрану. Вырезать ребра, чтобы разоблачить сердца без повреждения и кровоподтеки она. Клип нисходящей грудной аорты артерии пинцетом. Сделать резкий рассечение над правым предсердием, чтобы позволить венозной крови стечь. Вводят 2 мл физиологического раствора в левый желудочек, а затем с помощью инъекций цветной латекс вручную с небольшим давлением в течение 18-20 сек. Используйте предварительно заполненных шприцах один за другим. Избегайте любых инъекционных пузыри.
После инъекций из латекса, оставить животное в течение 5 мин. Обезглавьте животных и тщательно удалить весь мозг. Заботьтесь, чтобы не повредить сосуд и архитектуры Corteх при удалении костей черепа и мозговых оболочек. Поместите мозга в 60 мм блюдо клеточной культуры содержащей 6-8 мл 4% PFA, чтобы сделать снимок. Поместите измерительную линейку под прозрачной блюдо. Возьмите фотографии на 25x увеличением спинной и брюшной поверхности головного мозга с камеры, подключенной к операционным микроскопом. Фотографии должны быть приняты под углом 90 ° между чашку Петри и объектива микроскопа в целях количественного оригинальный расстояния.
Повторите процедуру в другой 4-5 животных.

3. Окрашивание сосудов головного мозга смесью сажи чернила

Для сравнения результатов из латекса на основе мозговых сосудов окрашивание с нашим протоколом, приготовить смесь из 100 мкл Herlitz Stempelfarbe чернил (CB1) с 900 мкл Pelican Scribtol Schwarz чернил (CB2) в 1,5 мл трубки EP. Приготовьте две трубы EP, чтобы сделать общим объемом 2 мл смеси CB1 и CB2 в 1:09 отношение. Соберите смесь в двух отдельных шприцах инсулин (1мл каждая). Закройте шприц и разместить их на водяной бане нагреть до 37 ° C. Сбор 2 мл физиологического раствора в другой два шприца инсулина, и поместить их в ванну с водой, а также.
Анестезию животного и повторите ту же процедуру, как описано выше, за исключением введения papavarine гидрохлорида. После инъекций по 2 мл salaine в левый желудочек, вводят 2 мл смеси углерода черные чернила вместо цветного латекса. Выполнять инъекции вручную с небольшим давлением в течение 18-20 сек на мл. Клип нисходящей грудной аорты до инъекции.
Жертвоприношение животного, удалить мозг и сделать фотографии.
Для длительного сохранения мозга, положил мозг в 4% PFA в течение ночи с последующей инкубацией с сахарозой с постепенно возрастающей концентрации до плавающий мозг погружается полностью (5% затем 15%, затем 30%). Мозг животных перфузии с цветным латексом также может быть сохранена в том же пути.
ВыполнитьПроцедура в другой 4-5 животных. Чтобы сравнить разницу в церебральной сосудистой анатомии в связи с различным генетическим фоном или штаммы, повторить протокол в равном количестве ApoE KO и SV129 мышей, соответственно.
Для изучения сосудистой анатомии при ишемическом условий, вызывать переходные церебральной ишемии в течение 45 мин или 90 мин в соответствии со стандартным протоколом внутрипросветного окклюзии СМА под глубоким наркозом (подробное описание операции выходит за рамки настоящей статьи; Мы отсылаем читателя к Doeppner и соавт., 2010). В конце периода реперфузии планируется (1 день или 5 дней), выполните сосудистой окрашивания CB1 CB2 + чернила только и пятно весь мозг с 2%-ным раствором TTC при 37 ° С в течение 5-10 минут, чтобы определить объем инфаркта . TTC сводится к красной формазана в митохондриальных ферментов (в частности, сукцинатдегидрогеназы). После окрашивания ТТК, метаболически активных тканей пятна темно-красный, а инфарктом ткани остается unstaiНед и появляется белый в связи с неблагополучной и денатурированной митохондриальных ферментов. Сбор изображений таким же образом, как описано выше.

4. Изучение мозговых сосудов территорий

Для анализа валовой анатомии сосудов головного мозга, изображения спинной поверхности мозга или окрашенные цветной латекс или CB1 CB2 + чернила могут быть проанализированы с ImageJ программного обеспечения (Java на основе программных средств для обработки и анализа изображений). Мозги перфузии с цветной латекс может показать различной степени окрашивания судно находится на спинной поверхности, в то время как CB1 + CB2 перфузии запятнал все суда как на брюшной и спинной поверхности.
Откройте файл изображения с помощью программного обеспечения ImageJ. Определите все точки анастомоза между ПМА и СМА. Точка анастомоза определяется как место, где диаметр сосуда является узким или половину расстояния между ближайшими точками ветвления ПМА и СМА филиалов, соответственно ^2. провести воображаемую линию (линии анастомоза), установив анастомоза точки с помощью инструмента рисования сегментированные строки и плагин "пунктирной линии".
Установите шкалу в мм. Измерьте расстояние между линией анастомоза и срединной линии на 4 мм каудально к лобного полюса мозга с помощью прямой инструмент для рисования линий и «мера» инструмент. Сделайте то же самое на 6 мм каудально от лобного полюса. Анализ 3-4 изображений на животных и рассчитать среднее значение. Сравните значения между различными группами животных, чтобы определить изменение мозгового анатомии. В C57BL6 / J животных, линии анастомоза между ПМА и СМА можно проследить ближе к срединной линии на 4 мм, чем на 6 мм каудально от лобного полюса. ApoE KO мышей не представляют существенной разницы в этом отношении. Напротив, в SV129 мышей линии анастомоза будет лежать дальше и параллельно средней линии, как на 4 мм и 6 мм каудально от лобного полюса.
Для анализа сосудистой анатомии яп ишемическая условиях, выполняют те же расчеты, упомянутые выше. Определить миокарда границы, красный и белый цвет края ткани представляет метаболически активных тканей и некротических тканей неокрашенные, соответственно. Измерьте расстояние от инфаркта границы от срединной линии на 4 мм и 6 мм в хвостовой от лобного полюса головного мозга. Сбор среднее значение от 3-4 изображений на животных. Сравнение результатов между различными ишемии и реперфузии периоды.