Method Article

РНК-след Анализ Transcriptomes в тромбин обращению и контролю человека легочной микрососудистой эндотелиальных клеток

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой полный и подробный порядок применения РНК-след, мощный следующего поколения секвенирования ДНК технологии, профиль transcriptomes в человеческой легочной микрососудистых эндотелиальных клеток с лечением или без тромбина. Этот протокол является обобщением различных клеток или тканей под влиянием различных реагентов или болезненных состояний.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика экспрессии генов в клетках путем измерения уровней мРНК является полезным инструментом для определения того, как внешние сигналы (например, медикаментозное лечение) влияют на транскрипционный механизм клетки, или как клетки различаются между здоровым и больным состоянием. С появлением и постоянным совершенствованием технологии секвенирования ДНК нового поколения, секвенирование РНК (РНК-секвенирование) становится все более популярным методом анализа транскриптома для каталогизации всех видов транскриптов, определения транскрипционной структуры всех экспрессируемых генов и количественной оценки изменяющихся уровней экспрессии общего набора транскриптов в данной клетке, ткани или организме1,2 . РНК-секвенирование постепенно вытесняет ДНК-микрочипы в качестве предпочтительного метода анализа транскриптома, поскольку он имеет преимущества профилирования полного транскриптома, предоставления цифрового типа датума (номера копии любого транскрипта) и не полагается на какую-либо известную геномнуюпоследовательность3.

Здесь мы представляем полный и подробный протокол применения РНК-секвенирования для профилирования транскриптомов в микрососудистых эндотелиальных клетках легких человека с лечением тромбином или без него. Этот протокол основан на нашем недавнем опубликованном исследовании под названием «РНК-секвенирование выявляет новый транскриптом генов и их изоформ в микрососудистых эндотелиальных клетках легких человека, обработанных тромбином»4, в котором мы успешно выполнили первый полный транскриптомный анализ микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека, обработанных тромбином, с использованием РНК-секвенирования. Это дало беспрецедентные ресурсы для дальнейших экспериментов, чтобы получить представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе тромбин-опосредованной эндотелиальной дисфункции в патогенезе воспалительных состояний, рака, диабета и ишемической болезни сердца, и обеспечивает потенциальные новые зацепки для терапевтических мишеней для этих заболеваний.

Описательный текст этого протокола разделен на четыре части. В первой части описывается лечение микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека выделением тромбина и РНК, анализ качества и количественная оценка. Во второй части описывается построение библиотеки и секвенирование. В третьей части описывается анализ данных. В четвертой части описывается валидационный анализ ОТ-ПЦР. Отображаются репрезентативные результаты нескольких ключевых шагов. Полезные советы или меры предосторожности для повышения успеха в ключевых шагах представлены в разделе «Обсуждение». Хотя в этом протоколе используются легочные микрососудистые эндотелиальные клетки человека, обработанные тромбином, он может быть обобщен для профилирования транскриптомов в клетках как млекопитающих, так и других млекопитающих, а также в тканях, обработанных различными стимулами или ингибиторами, или для сравнения транскриптомов в клетках или тканях между здоровым состоянием и состоянием болезни.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Блок-схема изложением этот протокол отображается на рисунке 1.

1. Обработка клеток тромбина, РНК изоляции, оценке качества и количественной оценки РНК

  1. Культура легких микрососудистой эндотелиальных клеток (HMVEC-LBL) до 90-100% слияния в 6-луночные планшеты в EGM-2 среды с 5% FBS, факторы роста и антибиотиков (Lonza, кошки # CC-3202).
  2. Изменение средств массовой информации к голоду СМИ (0% FBS) 30 мин до начала лечения с тромбином.
  3. Относитесь к клеткам с 0,05 ЕД / мл тромбина или оставить необработанными в качестве контроля в течение 6 часов при температуре 37 ° C и 5% CO 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для Шаг 1: 28s: 18 лет соотношение традиционно используется как показатель деградации РНК. В идеале, 28s пика должны быть примерно в два раза площадь 18 лет группе (соотношение 2), однако это идеальное соотношение часто не видел на практике. Кроме того, 28s: 18 лет соотношение получается из спектрофотометрический методы могут недооценивать количество деградации РНК. Для более точной количественной деградации, и, следовательно, качества образцов РНК, система Experion рассчитывает показатель качества РНК .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ключевые шаги

РНК-разгрузочные работы: РНКаз будет деградировать даже самого высокого качества РНК, поэтому необходимо соблюдать осторожность во время выделения, хранения и использования РНК-10. Перчатки всегда носили, чтобы предотвратить загрязнение РНКазы найдены на человеческих рук. Перчатки следует менять часто, особенно после контакта с кожей, дверные ручки или другие общие поверхности. Набор из пипетки должна быть посвящена исключительно РНК работы и все советы.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить д-р Стивен Kingsmore и детской Центра медицины генома в Детской милосердия Больницы и клиники для использования их вычислительных кластеров для анализа данных, поле Illumina служба команды (Elizabeth Бойер, Скотт Кук и Марк Кук) и технические Консультант команды для их быстрого реагирования и полезные советы на функционирование нового поколения секвенирования ДНК инструмент, HiScanSQ, а также данные анализа качества. Эта работа была выполнена при частичной поддержке Национального института здоровья Грант HL080042 (для SQY) и пуско-наладочные фонд и фонд детского милосердия Больницы и клиники Университета Миссури в Канзас-Сити (в SQY). <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Реагенты и оборудование Компания Номер в каталоге Комментарии
Легких человека микрососудистой эндотелиальных клеток Lonza CC-2815
Lonza, Bullet Kit Lonza CC-3202 Содержит EGM-2, FBS, факторы роста и антибиотики
Тромбин Сигма T4393
Ambion мир Vana Kit Life Technologies AM 1560
РНКазы-Zap Life Technologies AM9782
Experion StdSens РНК Bio-Rad 700-7103
TruSeq РНК подготовкаКит Illumina FC-122-1001
AMPureXP бусины Beckman Coulter A63881
Верхний обратной транскриптазы II Life Technologies 18064-014
Experion ДНК-1K Bio-Rad 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen 204163
ЧП Кластер поколения Kit Illumina PE-401-3001
PhiX управления Kit Illumina FC110-301
200 Цикл SBS Kit Illumina FC-401-3001
HiScanSQ * Illumina SY-103-2001
CBOT Illumina SY-301-2002
КПЦР машины - Viia7 Life Technologies Модель № VIIA7 / Оборудование # 10631261 Или эквивалент
Система Experion Bio Rad 7007001 Bioanalyzer является альтернативой системе
Спектрофотометр Bio-Tek Эпоха микропланшет Спектрофотометр Или эквивалент
Центрифуга - Sorvall Legend XTR Thermo Scientific 75004521 Или эквивалент
Магнитный стенд Life Technologies AM10027
96-а амплификаторе Общие лабораторные поставщиков
Таблица 3. Список основных реагентов и майор Equipment. * В видео, HiSeq1000 вместо HiScanSQ была продемонстрирована.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA seq AnalysisTranscriptome ProfilingThrombin TreatmentHuman Pulmonary Microvascular Endothelial CellsRNA IsolationLibrary ConstructionData AnalysisRT PCR ValidationHighSeq 1000Cuffdiff Analysis

Related Articles