Методическая статья

РНК-след Анализ Transcriptomes в тромбин обращению и контролю человека легочной микрососудистой эндотелиальных клеток

DOI:

10.3791/4393

⸱

13 февраля 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой полный и подробный порядок применения РНК-след, мощный следующего поколения секвенирования ДНК технологии, профиль transcriptomes в человеческой легочной микрососудистых эндотелиальных клеток с лечением или без тромбина. Этот протокол является обобщением различных клеток или тканей под влиянием различных реагентов или болезненных состояний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика экспрессии генов в клетках путем измерения уровней мРНК является полезным инструментом для определения того, как внешние сигналы (например, медикаментозное лечение) влияют на транскрипционный механизм клетки, или как клетки различаются между здоровым и больным состоянием. С появлением и постоянным совершенствованием технологии секвенирования ДНК нового поколения, секвенирование РНК (РНК-секвенирование) становится все более популярным методом анализа транскриптома для каталогизации всех видов транскриптов, определения транскрипционной структуры всех экспрессируемых генов и количественной оценки изменяющихся уровней экспрессии общего набора транскриптов в данной клетке, ткани или организме1,2 . РНК-секвенирование постепенно вытесняет ДНК-микрочипы в качестве предпочтительного метода анализа транскриптома, поскольку он имеет преимущества профилирования полного транскриптома, предоставления цифрового типа датума (номера копии любого транскрипта) и не полагается на какую-либо известную геномнуюпоследовательность3.

Здесь мы представляем полный и подробный протокол применения РНК-секвенирования для профилирования транскриптомов в микрососудистых эндотелиальных клетках легких человека с лечением тромбином или без него. Этот протокол основан на нашем недавнем опубликованном исследовании под названием «РНК-секвенирование выявляет новый транскриптом генов и их изоформ в микрососудистых эндотелиальных клетках легких человека, обработанных тромбином»4, в котором мы успешно выполнили первый полный транскриптомный анализ микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека, обработанных тромбином, с использованием РНК-секвенирования. Это дало беспрецедентные ресурсы для дальнейших экспериментов, чтобы получить представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе тромбин-опосредованной эндотелиальной дисфункции в патогенезе воспалительных состояний, рака, диабета и ишемической болезни сердца, и обеспечивает потенциальные новые зацепки для терапевтических мишеней для этих заболеваний.

Описательный текст этого протокола разделен на четыре части. В первой части описывается лечение микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека выделением тромбина и РНК, анализ качества и количественная оценка. Во второй части описывается построение библиотеки и секвенирование. В третьей части описывается анализ данных. В четвертой части описывается валидационный анализ ОТ-ПЦР. Отображаются репрезентативные результаты нескольких ключевых шагов. Полезные советы или меры предосторожности для повышения успеха в ключевых шагах представлены в разделе «Обсуждение». Хотя в этом протоколе используются легочные микрососудистые эндотелиальные клетки человека, обработанные тромбином, он может быть обобщен для профилирования транскриптомов в клетках как млекопитающих, так и других млекопитающих, а также в тканях, обработанных различными стимулами или ингибиторами, или для сравнения транскриптомов в клетках или тканях между здоровым состоянием и состоянием болезни.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Блок-схема изложением этот протокол отображается на рисунке 1.

1. Обработка клеток тромбина, РНК изоляции, оценке качества и количественной оценки РНК

  1. Культура легких микрососудистой эндотелиальных клеток (HMVEC-LBL) до 90-100% слияния в 6-луночные планшеты в EGM-2 среды с 5% FBS, факторы роста и антибиотиков (Lonza, кошки # CC-3202).
  2. Изменение средств массовой информации к голоду СМИ (0% FBS) 30 мин до начала лечения с тромбином.
  3. Относитесь к клеткам с 0,05 ЕД / мл тромбина или оставить необработанными в качестве контроля в течение 6 часов при температуре 37 ° C и 5% CO 2.
  4. Изолировать общей РНК из обработанных и контрольных клеток с использованием Ambion мир Vana комплекта в соответствии с инструкциями производителя.
  5. Оценить качество РНК эукариот Experion чип StdSense РНК в соответствии со стандартным протоколом на Experion Автоматизированная станция электрофореза (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
  6. Количественная РНК с использованием стандартного спектрофотометрического метода.

2. Строительство библиотеки и последовательности

  1. Используйте 1 мкг высокого качества общей РНК в образце исходного материала.
  2. Чтобы построить библиотеку, выполните стандартную процедуру от Illumina (протокол № 15008136 Rev. A). В этом протоколе двух раундов поли (А), содержащий выборы мРНК выполняется для удаления рРНК, чтобы свести к минимуму последовательности рРНК.
  3. Оценить качество библиотек с использованием ДНК-чипов Experion 1K в соответствии со стандартом протокола о электрофореза Experion Автоматизированная станция ( www.bio-rad.com ).
  4. Количественная библиотеки с помощью КПЦР: Используйте библиотеку, которая ранее была последовательной в качестве стандартной кривой и праймеров, специфичных для лигированную адаптеров. Использование диапазона разведений неизвестные библиотеки (1:100, т.е., 1:500 и 1:1000). Запустите КПЦР АККОrding к протоколу SyberGreen ММ и расчета исходной концентрации запасов каждой библиотеке.
  5. Развести библиотечных фондов до 10 нм и хранят при температуре -20 ° C до готовности кластера потоке клеток.
  6. Когда все будет готово к кластеру проточной ячейки, растопить CBOT пластины реагента на водяной бане. CBOT является Illumina инструмент, используемый для упорядочения процесса генерации кластеров.
  7. Вымойте CBOT инструмента.
  8. Денатурации библиотеках: Объединить 13 мкл 1x TE и 6 мкл 10 мкМ библиотеки и, на стороне трубки, добавить 1 мкл 1 N NaOH (при условии, Illumina). Vortex, спин вниз, инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин и поместить денатурированный библиотеки на льду.
  9. Развести библиотеках: Развести денатурированный библиотек с предварительно охлажденным гибридизации буфер (HT1, предусмотренных Illumina), объединяя 996 мкл HT1 и 4 мкл денатурированный библиотека для конечной концентрации 12 вечера. Поместите денатурированный и разводненной библиотеки на льду.
  10. Обратить каждого ряда труб пластины CBOT,обеспечение того, чтобы все реагенты оттаивают. Спином вниз пластину, снять / прокол фольги уплотнения и загрузить на CBOT.
  11. Алиготе 120 мкл разбавленного, денатурированный библиотеки полосу трубки, с номерами 1-8. Добавить 1,2 мкл разведенного, денатурированный управления PhiX библиотеке (от Illumina) в каждую пробирку как шип-контроль. Vortex и спином вниз трубы и загружать их на CBOT в правильной ориентации (труба № 1 справа).
  12. Загрузите ячейку потока и многообразия на CBOT.
  13. Выполните проверку расхода и начать кластеризации перспективе.
  14. После запуска завершена, проверьте реагента Доставка по всей полосы. Обратите внимание на любые отклонения от нормы. Либо начать последовательность выполнения сразу или хранить проточной ячейки в предоставленной трубки при 4 ° C.
  15. Оттепель последовательности через синтез (SBS, Illumina) реагентов.
  16. Загрузка реагентов в соответствующие места на реагентов лотков, стараясь не прикасаться к другим реагентам после прикосновения к расщеплению смеси.
  17. Использование неп-последовательности потока ячейки (т.е. тот, который был секвенирован ранее), премьер-линии реагента в два раза.
  18. Тщательно очистите последовательности проточной ячейки с 70% этанола и Kimwipes, а затем 70% этанола и линзы бумаги. Осмотрите проточной ячейки для любой полосы. Повторно очистить его в случае необходимости.
  19. Загрузите проточной ячейки на секвенсор и выполнять потока убедитесь, что уплотнение между многообразия и проточной ячейки плотно.
  20. Начало последовательности запуска.
  21. Оценка показателей качества (например, кластер плотность кластеров проходящего фильтр, Q30, интенсивность) по мере их появления во время бега.
  22. Мониторинг интенсивности по всему перспективе.
  23. После 101 циклов завершен, выполнить поворот химии для завершения второй следующего содержания: Оттепель парных конце реагентов и второго буфера регистрации чтения (ICB, компоненты SBS реагентов, Illumina) и загружать реагенты.
  24. Продолжите последовательность выполнения, оценка 2-й читать интенсивности, Q30й другие показатели качества выполнения прогрессирует.

3. Анализ данных

  1. Используйте последние версии CASAVA (Illumina, в настоящее время 1.8.2), чтобы преобразовать базу вызова файлов (. BCL) файлы. Fastq файлов, установка fastq-кластера счетом 0, чтобы создание единого файла fastq для каждого образца . Распакуйте fastq файлы для последующего анализа.
  2. Выполните парный конце трассы с использованием последних версий TopHat (1.4.1) 5, который присоединяется РНК-след читает млекопитающего размером генома использованием сверхвысокой пропускной короткие выравниватель для чтения (Bowtie, 0.12.7) 6 и SAMtools (0,1. 17) 7. SAMtools реализует различные утилиты для пост-обработки рядов в формате SAM. Ссылка человека транскриптом могут быть скачаны с iGenomes ( www.illumina.com ). В беге TopHat, мы использовали все стандартные параметры настройки, включая выбор типа библиотеки, как FR-unstranded (по умолчанию).
  3. НамING программы CuffDiff, часть запонки (1.3.0) 8 пакет программного обеспечения, сравнить тромбин-обработанных клеток с контролем клетки, чтобы отсеивать разному экспрессируются генов транскрипты в бывшем основана на человека транскриптом ссылки. Это сравнение определяет дифференциальное выражение известно стенограммы. Использование Microsoft Excel для визуализации результатов в виде таблицы. В беге запонки программы, мы использовали все настройки параметров по умолчанию. Те, ген стенограммы с FPKM <0,05 и р> 0,05 отфильтровываются.
  4. Для обнаружения новых изоформ, запустить запонки без ссылки транскриптом. Сравните примеры файлов стенограмму, чтобы референсного генома использованием Cuffcompare и проверить дифференциальные выражения с Cuffdiff с использованием комбинированного файла стенограмме тромбина в качестве опорного генома для одного анализа и комбинированный контроль расшифровка файлов в качестве опорного генома для второго анализа. Использование Microsoft Excel для визуализации результатов в табличной форме. Опять же, тыс.электронной гена стенограммы с FPKM <0,05 и р> 0,05 отфильтровываются. После этого шага, следователи могут выбрать, чтобы загрузить список вновь зарегистрированных стенограммы на сайте УСК браузера генома ( http://genome.ucsc.edu/ ) для проверки их достоверности по ручного досмотра.
  5. Представьте списки разному экспрессируются гены изобретательность анализа путей (IPA, www.ingenuity.com ) для характеристики гены и пути, пострадавших от лечения тромбина. На данном этапе следователи могут решить использовать пояс ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), пакет R, который разработан, чтобы помочь и упростить задачи анализа запонки РНК-след выходных, чтобы помочь управлять, визуализировать и интегрировать все данные, полученные с помощью анализа Cuffdiff.

4. Проверка РНК-последующие результаты по Количественные в режиме реального времени-Polymerase цепной реакции (QRT-PCR)

  1. Выполните полной изоляции РНК из управления и тромбин обработанных HMVEC-LBL клеток, РНК оценки качества и РНК количественного описано в шагах от 1,4 до 1,6.
  2. Создание комплементарной ДНК от 1 мкг суммарной РНК каждого образца с индексом III Первый Strand Синтез системы Комплекты РТ, в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, 18080-051).
  3. Выполните QRT-PCR анализа Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System использованием Taqman анализа по требованию предназначен олигонуклеотидов для выявления CUGBP, ELAV-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor связанных фактор 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) и β-актин (ACTB, Hs99999903_m1). Каждый образец был шаблон эквивалентно 5 нг общей РНК. Измерьте количественного использования DDCT метод и нормализовать β-актина. Каждый тест проводился по крайней мере, три биологических повторностях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для Шаг 1: 28s: 18 лет соотношение традиционно используется как показатель деградации РНК. В идеале, 28s пика должны быть примерно в два раза площадь 18 лет группе (соотношение 2), однако это идеальное соотношение часто не видел на практике. Кроме того, 28s: 18 лет соотношение получается из спектрофотометрический методы могут недооценивать количество деградации РНК. Для более точной количественной деградации, и, следовательно, качества образцов РНК, система Experion рассчитывает показатель качества РНК ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ключевые шаги

РНК-разгрузочные работы: РНКаз будет деградировать даже самого высокого качества РНК, поэтому необходимо соблюдать осторожность во время выделения, хранения и использования РНК-10. Перчатки всегда носили, чтобы предотвратить загрязнение РНКазы найдены на человеческих рук. Перчатки следует менять часто, особенно после контакта с кожей, дверные ручки или другие общие поверхности. Набор из пипетки должна быть посвящена исключительно РНК работы и все советы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить д-р Стивен Kingsmore и детской Центра медицины генома в Детской милосердия Больницы и клиники для использования их вычислительных кластеров для анализа данных, поле Illumina служба команды (Elizabeth Бойер, Скотт Кук и Марк Кук) и технические Консультант команды для их быстрого реагирования и полезные советы на функционирование нового поколения секвенирования ДНК инструмент, HiScanSQ, а также данные анализа качества. Эта работа была выполнена при частичной поддержке Национального института здоровья Грант HL080042 (для SQY) и пуско-наладочные фонд и фонд детского милосердия Больницы и клиники Университета Миссури в Канзас-Сити (в SQY).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагенты и оборудование Компания Номер в каталоге Комментарии
Легких человека микрососудистой эндотелиальных клеток Lonza CC-2815
Lonza, Bullet Kit Lonza CC-3202 Содержит EGM-2, FBS, факторы роста и антибиотики
Тромбин Сигма T4393
Ambion мир Vana Kit Life Technologies AM 1560
РНКазы-Zap Life Technologies AM9782
Experion StdSens РНК Bio-Rad 700-7103
TruSeq РНК подготовкаКит Illumina FC-122-1001
AMPureXP бусины Beckman Coulter A63881
Верхний обратной транскриптазы II Life Technologies 18064-014
Experion ДНК-1K Bio-Rad 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen 204163
ЧП Кластер поколения Kit Illumina PE-401-3001
PhiX управления Kit Illumina FC110-301
200 Цикл SBS Kit Illumina FC-401-3001
HiScanSQ * Illumina SY-103-2001
CBOT Illumina SY-301-2002
КПЦР машины - Viia7 Life Technologies Модель № VIIA7 / Оборудование # 10631261 Или эквивалент
Система Experion Bio Rad 7007001 Bioanalyzer является альтернативой системе
Спектрофотометр Bio-Tek Эпоха микропланшет Спектрофотометр Или эквивалент
Центрифуга - Sorvall Legend XTR Thermo Scientific 75004521 Или эквивалент
Магнитный стенд Life Technologies AM10027
96-а амплификаторе Общие лабораторные поставщиков
Таблица 3. Список основных реагентов и майор Equipment. * В видео, HiSeq1000 вместо HiScanSQ была продемонстрирована.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
  4. Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229(2012).
  5. Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
  6. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25(2009).
  7. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  8. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  9. Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375(2012).
  10. Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
  11. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
  12. Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
  13. Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
  14. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Transcriptome ProfilingThrombin TreatmentRNA IsolationLibrary ConstructionData AnalysisRT PCR ValidationHighSeq 1000Cuffdiff Analysis

Похожие статьи