Методическая статья

Хромосома Репликация времени в сочетании с Флуоресцентные

13.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4400

⸱

10 декабря 2012 г.

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University

В этой статье

Краткое содержание

Количественный метод для анализа хромосом времени репликации описано. Метод использует BrdU включение в сочетании с флуоресцентными На месте Гибридизации (FISH) для оценки времени репликации хромосом млекопитающих. Эта техника позволяет прямое сравнение переставить и ООН-переставить хромосом в пределах одной ячейки.

Аннотация

Репликация ДНК млекопитающих инициируется в нескольких участках вдоль хромосом в разное время во время S-фазы, следуя временной программе репликации. Считается, что определение времени репликации является динамическим процессом, регулируемым тканеспецифичными сигналами и сигналами развития, которые реагируют на эпигенетические модификации. Тем не менее, механизмы, регулирующие то, где и когда начинается репликация ДНК вдоль хромосом, остаются плохо изученными. Гомологичные хромосомы обычно реплицируются синхронно, однако есть заметные исключения из этого правила. Например, в клетках самок млекопитающих одна из двух Х-хромосом начинает поздно реплицироваться в процессе, известном как Х-инактивация1. Наряду с этой задержкой во времени репликации, которая, по оценкам, составляет 2-3 часа, большинство генов становятся транскрипционно молчащими на одной Х-хромосоме. Кроме того, дискретный цис-действующий локус, известный как центр инактивации X-хромосомы, регулирует этот процесс инактивации X-хромосомы, включая индукцию замедленного времени репликации на всей неактивной X-хромосоме. Кроме того, определенные хромосомные перестройки, обнаруженные в раковых клетках и в клетках, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения, демонстрируют значительную задержку во времени репликации на >3 часа, что затрагивает всю хромосому2,3. Недавняя работа нашей лаборатории показывает, что нарушение дискретных цис-действующих аутосомных локусов приводит к чрезвычайно позднему реплицирующемуся фенотипу, который влияет на всю хромосому4. Дополнительные исследования «хромосомной инженерии» показывают, что определенные хромосомные перестройки, влияющие на множество различных хромосом, приводят к этому аномальному фенотипу времени репликации, предполагая, что все хромосомы млекопитающих содержат дискретные цис-действующие локусы, которые контролируют правильное время репликации отдельных хромосом.

Здесь мы представляем метод количественного анализа времени репликации хромосом в сочетании с флуоресцентной гибридизацией in situ. Этот метод позволяет напрямую сравнивать время репликации между гомологичными хромосомами в пределах одной клетки, и был адаптирован из6. Кроме того, этот метод позволяет однозначно идентифицировать хромосомные перестройки, которые коррелируют с изменениями во времени репликации, влияющими на всю хромосому. Этот метод имеет преимущества по сравнению с недавно разработанными высокопроизводительными микрочипами или протоколами секвенирования, которые не могут различать гомологичные аллели, присутствующие на перестроенных и неперестроенных хромосомах. Кроме того, поскольку описанный здесь метод оценивает отдельные клетки, он может обнаруживать изменения во времени репликации хромосом на хромосомных перестройках, которые присутствуют только в части клеток в популяции.

Протокол

1. BrdU регистрации (Терминал маркировки)

  1. Пластина клеток до 70% слияния в 150 мм ткань культуры блюдо 24 часа до добавления BrdU.
  2. Заменить СМИ со свежей полной среды, содержащей 20 мкг / мл BrdU (Sigma) в соответствующие моменты времени до сбора урожая. Время, клетки культивируют в средах с BrdU будет меняться в зависимости от типа клеток и вида, как правило, G2 фаза длится от 2 до 5 ч (рис. 1).

2. Хромосома Harvest монослоя клетки культур

  1. Удалить культуру средств массовой информации с пластины и собрать 10 мл в 15 мл коническую трубку центрифуги. Удалите оставшиеся средства массовой информации.
  2. Промойте клетки один раз 10 мл Versine [или HBSS (Sigma)].
  3. Добавьте 5 мл 0,25% трипсина в Versine (или HBSS) к плите. Выдержите при комнатной температуре до клетки отделяются от пластинки.
  4. Добавить трипсинизированных клеточной суспензии в пробирку, содержащую 10 мл средства массовой информации, начиная с шага 2.1.
  5. Центрифуга при 400 мкг в течение 10 мин для осаждения клеток. Супернатант, оставляя 0,5 мл среды плюс осадок клеток.
  6. Ресуспендируют клетки тщательно с помощью пипетки с пипетки Пастера.
  7. Добавить 3 капли гипотонический раствор (0,075 M KCl (Sigma) нагревали до 37 ° C); смешивать клеточной суспензии с пипетки Пастера. Добавить 0,5 мл гипотонического раствора и снова перемешать с пипетки Пастера. Принесите объем гипотонический раствор по 5 мл и перемешать еще раз. Инкубировать при 37 ° С в течение 20-45 мин, в зависимости от типа клеток.
  8. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин. Супернатант, оставляя 0,5 мл среды плюс осадок клеток.
  9. Ресуспендируют клеточный осадок, аккуратно стряхивая трубку. Осмотически опухшие клеток будет хрупким на данный момент, так что следует проявлять осторожность, чтобы не нарушать цитоплазматической мембраны.
  10. Добавить 3 капли фиксатора Карнуа (1:3 Ледяная уксусная кислота: метанол); смесь, осторожно пипеткой с Пастером pipettе. Добавить 0,5 мл фиксатора и перемешать, осторожно пипеткой с пипетки Пастера. Принесите объем фиксатором по 5 мл и снова перемешать, осторожно пипеткой с пипетки Пастера. Фиксированные клетки можно хранить в темном месте при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев.
  11. Центрифуга и аспирации, как и в шаге 2.8.
  12. Ресуспендируют осадок клеток в свежей фиксатором; оценить объем гранул и дополнений ~ 10x объем фиксатором Карнуа.
  13. Добавить клеточной суспензии по каплям на мокрой, ледяной горки микроскопа; держать слайд в угол ~ 45 ° и позволяют клеточной суспензии течь по поверхности слайда. Положите слайд квартира на бумажных полотенцах и наводнений слайд с фиксатором и дайте высохнуть на воздухе. Проверьте слайды на наличие митотического спреды использованием инвертированного микроскопа.

3. РНКазы лечение и этанола обезвоживания

  1. Место 200 мкл 10 мкг / мл РНКазы А (Sigma) в 2х SSC для каждого слайда; инкубируют при 37 и де-г; C в течение 1 часа.
  2. Wash горки 3 раза с 2x SSC, рН 7,0 при комнатной температуре в течение 3 минут каждый.
  3. Высушить скользит через EtOH (Sigma), серия (70%, 90% и 100%) при комнатной температуре в течение 3 минут каждый.
  4. Воздух сухой слайды при комнатной температуре.

4. Подготовка зонда Коктейли для BAC Plus хромосомы конкретных Centromere перечисление Probe (CEP) или для всего Краски хромосомы в гибридизация

  1. Для BAC / CEP одновременной гибридизации, подготовить два отдельных коктейли зонд для предварительной гибридизации. Мы обнаружили, что предварительно гибридизации BAC и КЭП зондов отдельно по разным результатам строгости менее фоне и больше интенсивности сигнала. Мы также обнаружили, что отдельные Fosmids также может быть использован вместо ВАС-клонов. Коктейль разработке описанных ниже представлены объемы для одного слайда. Если обработка нескольких слайдов с использованием тех же зондов просто увеличить объемы appropr iately.

    * BAC ДНК-зонда коктейль:

    11,5 мкл буфера для гибридизации (50% формамид (Sigma) / 2x SSC / сульфат декстрана (Sigma)) 2 мкл дН 2 O

    2,5 мкл BAC/Cot1 ДНК в дН 2 O (см. ниже для маркировки протокола) 15 мкл общего объема

    * КЭП зонд коктейль:

    7 мкл буфера гибридизации CEP (65% Formamide/2x SSC / декстрансульфат) 2 мкл дН 2 O

    1 мкл ДНК CEP/Cot1 (приобретается prelabeled с Spectrum Orange/Cy3/Texas красный) 10 мкл общего объема

    * После денатурации и предварительной гибридизации (шаг 5,1) смеси BAC зонда с зондом КЭП на соотношение 3:2 25 коктейлей мкл / слайдов и перемешать зонда.

    ИЛИ

  2. Алиготе 20 мкл / слайд Всего зонд краски хромосомы (Cy3/Texas Red) в трубку. Приступить к денатурации и гибридизации предварительного шага.
"> 5. Слайдов и Probe денатурации и в гибридизация

  1. Денатурировать зонд коктейль (ы) при 75 ° С в течение 10 мин. Предварительно гибридизации при 37 ° С в течение 30 мин, чтобы позволить Cot1 ДНК для гибридизации с повторяющимися последовательностями и для предотвращения последующего гибридизации метафазы хромосомы.
  2. Денатурировать слайды в банках Коплин в 70% Formamide/2x SSC, рН 7,0 при 72 ° С в течение 3 мин.
  3. Сразу обезвоживает скользит через EtOH серии (70%, 90% и 100%) в банках Коплин при 4 ° С в течение 3 минут каждый.
  4. Разрешить слайды высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
  5. Предварительно теплой слайды до 45 ° C на слайде теплее за последние 10 минут зонда предварительно hybridzation (шаг 5,1). Смешать предварительно гибридизированных коктейли зонда при необходимости и добавить 25 мкл для каждого слайда, осторожно положите покровное на каждом слайде и уплотнение по всем краям с резиновой цемента. Выдержите в течение ночи при 37 ° C в увлажненной камере для предотвращения испарения.

6. Сообщение Гибридизация Моет

  1. Вымойте слайды в банках Коплин 3 раза в 50% formamide/2x SSC, рН 7,0 при 38-40 ° С в течение 3 минут каждый. Температура мытья может варьироваться между зондами. Если есть высокая гибридизации фона можно увеличить температуру стирок. И наоборот, если сигнал слабый, и нет фона, то вы можете уменьшить температуру этих стирок.
  2. Wash скользит 1 раз в буфер PN при комнатной температуре в течение 3 минут, и переходите к шагу обнаружения BrdU.

7. BrdU Detection

  1. Блок слайды с PNM буфере в течение 10 мин (200 мкл / слайд) при комнатной температуре в темноте.
  2. Слейте слайды, включив края на бумажном полотенце. Добавить 100 мкл анти-BrdU-FITC (50 мкг / мл Roche или Millipore) в PNM буфере в течение 30 мин при 37 ° C.
  3. Вымойте слайды 3 раза в буфер PN при комнатной температуре в течение 3 минут каждый.
  4. Истощатьизбыток буфера PN на слайды по одному включением края на бумажном полотенце. Добавить 20 мкл DAPI / antifade монтаж решение (Invitrogen). Накройте слайд с бумажным полотенцем и нажмите на покровное, чтобы вытеснить пузырьки воздуха и избыточного монтаж решение. Перейдем к анализу изображений.

8. Захват изображения и количественного BrdU регистрации

  1. Изображения захватываются с Olympus BX61 флуоресцентного микроскопа и Olympus ПЗС-камеры, 100x цель, автоматический фильтр-колеса и Cytovision программного обеспечения (Applied Imaging). BrdU захвачен использованием FITC фильтр; хромосомы краски (Texas Red, метасистем или Cytocell), ВАС (Cy3) и CEP (Vysis Spectrum Orange) зонды, получены с помощью Texas Red или Cy3 фильтр; DAPI захватывается с DAPI фильтра (см. На рисунках 2 и 3).
  2. Индивидуальные хромосомы интерес отождествляется с BAC / CEP или хромосомы конкретной краски зондов (рис. 2В и 3В). ИспользующийПрограммное обеспечение Cytovision, каждая хромосома интерес "вырез" в метафазе распространению в целом, линия, проведенная через по длине хромосомы от короткого плеча на длинном плече (рис. 2С и 3С). Программное обеспечение Cytovision используется для количественной оценки интенсивности пикселя профиля по всей длине каждой хромосомы. Программное обеспечение Cytovision вычисляет площадь, занимаемая пикселов и измеряет интенсивность пикселей представлены BrdU или DAPI сигналов на каждой изолированной хромосомы. Средняя интенсивность пикселя представлена ​​каждая хромосома затем умножается на площадь, занимаемая те пиксели, чтобы получить общее количество пикселей (Таблица 1 и Рисунок 4). Кроме того, этот протокол позволяет для визуализации последней репликации участки хромосом. Соответственно, полосчатые структуры включения BrdU позволяет для обнаружения активное тиражирование участки хромосом, и различия в сроках репликации между ChromosOme пар рассматриваются как различия в этом картина диапазонов (рис. 2 и 3). Наконец, эти различия в связывании моделей можно сравнить с известным репликации сроков карты для каждой хромосомы 6,7, что позволяет оценить разницу времени между репликации гомологичных хромосом или хромосомных плеч 4. Например, две хромосомы 6 находится в 3А отображение разницы в структуре полосы> 2 ч, по сравнению с нормальными времени репликации хромосомы 6 4.
    Кроме того, аналогичная процедуре описанной здесь успешно используется для исследования асинхронного времени репликации между неактивными и активными Х-хромосомы 8,9. Активной и неактивной Х-хромосомы были определены с использованием краски Х-хромосоме. Изображения были получены с помощью Quips mFISH программного обеспечения (Vysis) и количество пикселей занимает Х-хромосомы и количество пикселей занимает флуоресцентно-ла-Белед BrdU Затем были рассчитаны с использованием NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).

9. Ник Перевод BAC ДНК для люминесцентных маркировки (Vysis)

  1. Добавьте следующую смесь зонд охлажденной пробирке:
    70 мкл (4 мкг ДНК) в дН 2 O
    10 мкл 0,2 мМ дУТФ-оранжевый или зеленый
    20 мкл 0,1 мМ дТТФ
    20 мкл 10х буфера Перевод Nick
    40 мкл NT дНТФ (в минус дТТФ)
    40 мкл перевода ник фермента
    200 мкл общего объема
    Инкубировать при 16 ° CO / N. Остановить реакцию при нагревании при 70 ° С в течение 10 мин. Охладить на льду в течение 5 мин.
  2. Осаждения ДНК этанолом, добавив следующий на зонд смеси:
    200 мкл решение зонд
    48 мкл 3 М ацетата натрия
    160 мкл Cot1DNA (.25 мкг / мкл)
    1200 мкл 100% этанола
  3. Хранить при -80 ° С в течение 10 мин до O / N.
  4. СпиномN Cold при 12000 х г в течение 20 мин. Слейте с этанолом. Мыть 1 раз с 70% этанола. Побочные как и раньше. Слейте с этанолом. Сухой воздух только пока не испаряется EtOH. Ресуспендируют в 40 мкл дН 2 O для конечной концентрации 100 нг / мкл BAC ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Пример анализа репликации сроки человеческой хромосомы 6, показано на рисунке 2. Клетки, содержащие удаление гена ASAR6 4, расположенный на 6q16.1, подвергались BrdU в течение 5 часов, собирали для митотических клеток и обрабатываются для рыбы с хромосоме 6 краску зонда (Vysis) и для включения BrdU. Обратите внимание, что существует значительная разница в BrdU картина диапазонов между двумя 6, которая согласуется с задержкой репликации времени> 2 часа для одного из хромосоме 6 [см. 4<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Подготовка хромосомы спредов является важным шагом для успешной репликации сроков анализа, описанного здесь. Включение колцемид стадии предварительной обработки до гипотоническому лечение может помочь в частоте и распространения делящихся клеток. Мы обычно предоставляют клетки colcemdi в течение 1-3 ч до сбора урожая, и использовать колцемид в конечной концентрации 10 мкг / мл. Тем не менее, включение колцемид стадии предварительной обработки может изменить длину G2 и, следовательно, может изменить видимый времени репли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального института рака, CA131967.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии (по желанию)
Anti-BrdU-FITC Roche Millipore 11202593001 MAB326F 50 мкг / мкл
Ник Перевод Kit Abbott молекулярной (Vysis) 07J00-0001
Спектр оранжевой дУТФ Abbott молекулярной (Vysis) 02N33-050
КЭП Abbott молекулярной (Vysis) Варьируется
LSI / ВКП гибридизации буфер Abbott молекулярной (Vysis) 06J67-011
КЭП гибридизации буфер Abbott молекулярной (Vysis) 07J36-001
Хромосома пайНТС Метасистем группы D-14NN-050-TR
Olympus BX61 флуоресцентного микроскопа Олимп BX61TRF-1-5
Микроскоп изображений программное обеспечение системы Прикладная изображений Cytovision 3.93.1
Цифровые камеры Олимп UCMAD3

РЕЦЕПТЫ НА МЕСТЕ ГИБРИДИЗАЦИИ
Решения Формамид
70% Formamide/2x SSC

35 мл Формамид * (Sigma)
10 мл 10x SSC
5 мл D 2 H 2 0
рН до 7,0 с помощью HCl (Sigma)

* Важно использовать формамид, которые хранились при температуре -20 ° C. Длительное хранение комнатной температуре будет генерировать муравьиной кислоты и рН Wплохо быть слишком низкой.

50% Formamide/2x SSC

25 мл формамида (Sigma)
10 мл 10x SSC
15 мл дН 2 O
рН до 7,0 с помощью HCl (Sigma)

20x SSC, 4 л

702 г NaCl (Sigma)
358 г цитрата натрия (Sigma)
дН 2 O в объеме

PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)]

Сделайте 0,1 М раствора каждого из фосфата натрия (Filter стерилизовать и хранить в 500 мл аликвоты).

0,1 М NaH 2 P0 4, 1 л

13,8 г NaH 2 P0 4 (Sigma):
дН 2 O в объеме

0,1 М NaH 2 P0 4 1 L

14,2 г NaH 2 P0 4 (Sigma)
дН 2 O в объеме.

PN: Отрегулируйте рН 0,1 М Na 2 HP0 4 до рН 8,0 с 0,1 М NaH 2 P0 4. Фильтр стерилизуют и добавляют 1 мл NP-40.

PNM 50 мл

1,25 г сухого обезжиренного молока (Sigma)
PN 25 мл буфера (рецепт выше)

Смешайте в течение 15-20 мин при постоянном помешивании. Spin 2 раза при 400 х г в течение 10 мин. Используйте супернатант, и убедитесь, что не беспокоить осажденные белки молока.

Ссылки

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
  3. Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
  4. Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
  5. Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
  6. Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
  7. Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
  8. Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
  9. Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  11. Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
  12. Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from: http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman (2006).
  13. Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Chromosome Replication TimingBRDU IncorporationMetaphase Chromosome AnalysisDNA FISH ProtocolCyto Vision SoftwareHomologous Chromosome ComparisonChromosomal Rearrangement DetectionReplication Timing QuantificationSingle Cell Analysis

Похожие статьи