Количественный метод для анализа хромосом времени репликации описано. Метод использует BrdU включение в сочетании с флуоресцентными На месте Гибридизации (FISH) для оценки времени репликации хромосом млекопитающих. Эта техника позволяет прямое сравнение переставить и ООН-переставить хромосом в пределах одной ячейки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Хромосома Репликация времени в сочетании с Флуоресцентные
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Репликация ДНК млекопитающих инициируется в нескольких участках вдоль хромосом в разное время во время S-фазы, следуя временной программе репликации. Считается, что определение времени репликации является динамическим процессом, регулируемым тканеспецифичными сигналами и сигналами развития, которые реагируют на эпигенетические модификации. Тем не менее, механизмы, регулирующие то, где и когда начинается репликация ДНК вдоль хромосом, остаются плохо изученными. Гомологичные хромосомы обычно реплицируются синхронно, однако есть заметные исключения из этого правила. Например, в клетках самок млекопитающих одна из двух Х-хромосом начинает поздно реплицироваться в процессе, известном как Х-инактивация1. Наряду с этой задержкой во времени репликации, которая, по оценкам, составляет 2-3 часа, большинство генов становятся транскрипционно молчащими на одной Х-хромосоме. Кроме того, дискретный цис-действующий локус, известный как центр инактивации X-хромосомы, регулирует этот процесс инактивации X-хромосомы, включая индукцию замедленного времени репликации на всей неактивной X-хромосоме. Кроме того, определенные хромосомные перестройки, обнаруженные в раковых клетках и в клетках, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения, демонстрируют значительную задержку во времени репликации на >3 часа, что затрагивает всю хромосому2,3. Недавняя работа нашей лаборатории показывает, что нарушение дискретных цис-действующих аутосомных локусов приводит к чрезвычайно позднему реплицирующемуся фенотипу, который влияет на всю хромосому4. Дополнительные исследования «хромосомной инженерии» показывают, что определенные хромосомные перестройки, влияющие на множество различных хромосом, приводят к этому аномальному фенотипу времени репликации, предполагая, что все хромосомы млекопитающих содержат дискретные цис-действующие локусы, которые контролируют правильное время репликации отдельных хромосом.
Здесь мы представляем метод количественного анализа времени репликации хромосом в сочетании с флуоресцентной гибридизацией in situ. Этот метод позволяет напрямую сравнивать время репликации между гомологичными хромосомами в пределах одной клетки, и был адаптирован из6. Кроме того, этот метод позволяет однозначно идентифицировать хромосомные перестройки, которые коррелируют с изменениями во времени репликации, влияющими на всю хромосому. Этот метод имеет преимущества по сравнению с недавно разработанными высокопроизводительными микрочипами или протоколами секвенирования, которые не могут различать гомологичные аллели, присутствующие на перестроенных и неперестроенных хромосомах. Кроме того, поскольку описанный здесь метод оценивает отдельные клетки, он может обнаруживать изменения во времени репликации хромосом на хромосомных перестройках, которые присутствуют только в части клеток в популяции.
Протокол
1. BrdU регистрации (Терминал маркировки)
- Пластина клеток до 70% слияния в 150 мм ткань культуры блюдо 24 часа до добавления BrdU.
- Заменить СМИ со свежей полной среды, содержащей 20 мкг / мл BrdU (Sigma) в соответствующие моменты времени до сбора урожая. Время, клетки культивируют в средах с BrdU будет меняться в зависимости от типа клеток и вида, как правило, G2 фаза длится от 2 до 5 ч (рис. 1).
2. Хромосома Harvest монослоя клетки культур
- Удалить культуру средств массовой информации с пластины и собрать 10 мл в 15 мл коническую трубку центрифуги. Удалите оставшиеся средства массовой....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Пример анализа репликации сроки человеческой хромосомы 6, показано на рисунке 2. Клетки, содержащие удаление гена ASAR6 4, расположенный на 6q16.1, подвергались BrdU в течение 5 часов, собирали для митотических клеток и обрабатываются для рыбы с хромосоме 6 краску зонда (Vysis) и для включения BrdU. Обратите внимание, что существует значительная разница в BrdU картина диапазонов между двумя 6, которая согласуется с задержкой репликации времени> 2 часа для одного из хромосоме 6 [см. 4<.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Подготовка хромосомы спредов является важным шагом для успешной репликации сроков анализа, описанного здесь. Включение колцемид стадии предварительной обработки до гипотоническому лечение может помочь в частоте и распространения делящихся клеток. Мы обычно предоставляют клетки colcemdi в течение 1-3 ч до сбора урожая, и использовать колцемид в конечной концентрации 10 мкг / мл. Тем не менее, включение колцемид стадии предварительной обработки может изменить длину G2 и, следовательно, может изменить видимый времени репли.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Национального института рака, CA131967.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии (по желанию) |
| Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 мкг / мкл |
| Ник Перевод Kit | Abbott молекулярной (Vysis) | 07J00-0001 | |
| Спектр оранжевой дУТФ | Abbott молекулярной (Vysis) | 02N33-050 | |
| КЭП | Abbott молекулярной (Vysis) | Варьируется | |
| LSI / ВКП гибридизации буфер | Abbott молекулярной (Vysis) | 06J67-011 | |
| КЭП гибридизации буфер | Abbott молекулярной (Vysis) | 07J36-001 | |
| Хромосома пайНТС | Метасистем группы | D-14NN-050-TR | |
| Olympus BX61 флуоресцентного микроскопа | Олимп | BX61TRF-1-5 | |
| Микроскоп изображений программное обеспечение системы | Прикладная изображений | Cytovision 3.93.1 | |
| Цифровые камеры | Олимп | UCMAD3 | |
РЕЦЕПТЫ НА МЕСТЕ ГИБРИДИЗАЦИИ 35 мл Формамид * (Sigma) * Важно использовать формамид, которые хранились при температуре -20 ° C. Длительное хранение комнатной температуре будет генерировать муравьиной кислоты и рН Wплохо быть слишком низкой. 50% Formamide/2x SSC 25 мл формамида (Sigma) 20x SSC, 4 л 702 г NaCl (Sigma) PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Сделайте 0,1 М раствора каждого из фосфата натрия (Filter стерилизовать и хранить в 500 мл аликвоты). 0,1 М NaH 2 P0 4, 1 л 13,8 г NaH 2 P0 4 (Sigma): 0,1 М NaH 2 P0 4 1 L 14,2 г NaH 2 P0 4 (Sigma) PN: Отрегулируйте рН 0,1 М Na 2 HP0 4 до рН 8,0 с 0,1 М NaH 2 P0 4. Фильтр стерилизуют и добавляют 1 мл NP-40. PNM 50 мл 1,25 г сухого обезжиренного молока (Sigma) Смешайте в течение 15-20 мин при постоянном помешивании. Spin 2 раза при 400 х г в течение 10 мин. Используйте супернатант, и убедитесь, что не беспокоить осажденные белки молока. |
Ссылки
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
- Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
