Матрица-Assisted Аутологичный трансплантации хондроцитов для реконструкции и ремонта хрящевые дефекты в модели кролика

Краткое содержание

Экспериментальной методики для лечения дефектов хряща в коленном суставе кролика описано. Имплантация аутологичных хондроцитов высевали на матрице это общепринятый метод для реконструкции и ремонта повреждений суставного хряща обеспечивать удовлетворяя долгосрочные результаты. Матрица-Assisted аутологичных хондроцитов трансплантации (МАСТ) предлагает стандартизированные и клинически подтвержденной метод имплантации.

Аннотация

Дефекты суставного хряща считаются серьезной проблемой здравоохранения, так как суставной хрящ обладает ограниченной способностью к саморегенерации ¹. Нелеченые повреждения хряща приводят к постоянным болям, отрицательно сказываются на качестве жизни и предрасполагают к развитию остеоартрита. За последние десятилетия было разработано несколько хирургических методов лечения таких поражений. Однако до настоящего времени не удавалось добиться полного восстановления, которое выражалось бы в закрытии дефекта гиалиновым суставным хрящом или обеспечении удовлетворительного долгосрочного восстановления ^2-4. Таким образом, повреждения суставного хряща остаются основной целью для применения методов регенерации, таких как тканевая инженерия. В отличие от других хирургических методов, которые часто приводят к образованию фиброзной или фиброхрящевой ткани, тканевая инженерия направлена на полное восстановление сложной структуры и свойств исходного суставного хряща за счет использования хондрогенного потенциала трансплантированных клеток. Последние достижения открыли многообещающие возможности для регенеративной терапии хряща.

Первый клеточный подход к лечению полнослойных повреждений хряща или остеохондральных дефектов был реализован в 1994 году Ларсом Петерсоном и Матсом Бриттбергом, которые стали первопроходцами в клиническом применении аутологичной имплантации хондроцитов (ACI) ⁵. На сегодняшний день эта методика хорошо зарекомендовала себя в клинической практике при лечении обширных дефектов гиалинового хряща коленного сустава, обеспечивая стабильные клинические результаты даже спустя 10–20 лет после имплантации ⁶. В последние годы методы имплантации аутологичных хондроцитов стремительно развивались. Все более популярным стало использование искусственного трехмерного коллагенового матрикса, на который впоследствии пересаживаются клетки ^7-9.

MACT состоит из двух хирургических процедур: во-первых, для сбора хондроцитов необходимо выполнить биопсию хряща из ненагружаемой области коленного сустава. Затем хондроциты извлекают, очищают и экспансируют до достижения достаточного количества клеток in vitro. После этого хондроциты высевают на трехмерный матрикс, после чего их можно повторно имплантировать. При подготовке тканеинженерного имплантата скорость пролиферации и дифференцировочная способность имеют решающее значение для успешной регенерации ткани ¹⁰. Считается, что использование трехмерного матрикса в качестве носителя клеток поддерживает эти клеточные характеристики ¹¹.

В следующем протоколе будет изложена и продемонстрирована методика выделения хондроцитов из биоптатов хряща, их пролиферации in vitro и их посева на 3D-матрикс (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Switzerland). В завершение будет описана имплантация клеточно-матриксных конструктов в искусственно созданные хондральные дефекты коленного сустава кролика. Данная методика может быть использована в качестве экспериментальной модели для дальнейших исследований по восстановлению хряща.

Протокол

А. Хрящ биопсию (хирургия номер; действия пунктов 1-5 Нестерильные подготовка залов)

1. Выполнение окончательный контроль веса кроликов (Новозеландские белые кролик, самка, 3,5-4,0 кг массы тела, 6 месяцев) для того, чтобы иметь возможность правильно дозы препаратов и контроля веса после операции.
2. Вызвать анестезии кролика внутривенной инъекции 10 мг / кг пропофола.
3. После интубации поддержания анестезии с 1,5 мг / кг / мин пропофола и 0,05 мг / кг фентанила внутривенно. Монитор анестезии с помощью капнографических, пульсоксиметрии и частоту пульса.
4. Бритье колена, которыми оперирует с электрической машинки и вакуумные меха.
5. Лечить бритой колена тщательно и покрыть остальную часть кролика с стерильную повязку.
6. Пропальпируйте коленной чашечки и выполняют разрез кожи медиальной части коленной чашечки.
7. Открытый коленного сустава при медиальных парапателлярный артротомия в стерильных условиях. Старайтесь избегать резки любого малого Суperficial кровеносных сосудов.
8. Смещение коленной чашечки боков.
9. Осмотр коленного сустава для любой аномалии и макроскопические поражения хряща.
10. Тщательно очистите маленькие кусочки хряща (2-3 мм) из trochlea Ossis бедра стерильным скальпелем (рис. 1).
11. Сразу же месте этих хрящей биопсии в 50 мл трубки с полной среде (DMEM + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) + 1% пенициллина / стрептомицина (пенициллина / стрептомицина)), чтобы продолжить в правой культуре пробирке после операции.
12. Очистите дефектов и промыть их стерильным физиологическим раствором.
13. Измените положение коленной чашечки в канавке trochlea.
14. Закрытие ран в слоях с одной кнопкой швов (4-0 Vicryl) и продолжает кожного шва (4-0 Monocryl). Используйте рассасывающийся шовный материал.
15. Наконец, запечатать рану с распылителем туалетный пропускает водяной пар.

B. В пробирке культуры

1. Процесс биопсии Cartilage части, как можно скорее после операции в стерильном ламинарном боксе культуры ткани.
2. Промыть стерильной хряще 2x собрано в PBS с последующим центрифугированием при 500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
3. Cut хряща в части 1 мм ^3, перевода в 50 мл сокола и переваривают их на шейкере в течение 30 мин с 10 мл трипсин-EDTA (0,25%) и 10 мл PBS в течение 30 мин
4. Через 30 мин остановить трипсином добавлением полной среде. Затем встряхнуть хряща части на другую в течение 12 часов с коллагеназы (0,21 ед / мг) в бессывороточной среде (DMEM + 1% пенициллина / стрептомицина).
5. Центрифуга полученный раствор при 170 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
6. Ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл полной среды.
7. Семенной изолированных на хондроциты до 25 см ² культуре ткани колбы в 5 мл полной среды и держать во влажной тканевой культуре инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО _2.
8. Grow хондроцитов до плотности 80%.
9. Отпустите клетки FПЗУ колб путем промывки в PBS 2x перед экспонированием до 0,05% трипсин-EDTA, в течение 3 мин. После отсоединения хондроцитов, остановка трипсином добавлением 10 мкл полной среды.
10. Центрифуга подвески при 300 мкг (3 мин) и ресуспендируют осадок в полной среде.
11. Семенной клеток в культуре ткани колбы (75 ^см2) и разделяются в соотношении 1:3 (~ 5000 клеток / см ^2), каждый ^5-й день или на 80% слияния.
12. Определить число клеток и жизнеспособности путем окрашивания трипановым синим.

C. посева клеток Матрицы

1. До имплантации и мыть клетки выпускают, как описано выше. Выполните клеток и передачи 5 х 10 ⁴ клеток в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Затем центрифугируют при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Ресуспендируют осадок в 15 мкл полной среды для полного насыщения матрицы.
3. Разрежьте двухслойных коллагена эшафот, чтобы точные размеры блоковый дефекта стерильной биопсииудара.
4. Место матрицы в соответствующих размеров блюдо культуры ткани (например, 24-луночные планшеты).
5. Семенной клеток на пористой, клетки клейкой стороне матрицы. Это сдерживает миграцию клеток от матрицы.
6. Оставьте ячейки семенами матриц без дальнейшего среду для культивирования клеток в инкубаторе в течение 1 часа, чтобы позволить полное присоединение хондроциты.
7. Затем место клетка-матрикс-конструкции в культивировании контейнеры (например, 24-луночные планшеты) свежей полной среды. Заботьтесь, чтобы не смыть любые клетки пределы матрицы, хотя строгое соблюдение не ожидается.
8. Теперь, клетка-матрикс-конструкции могут быть приняты в комнату хирургии для повторной имплантации.

D. Матрица-Assisted аутологичной трансплантации хондроцитов

1. Выполнение парапателлярный артротомия на контралатеральной колено, как описано выше (А. 1-8).
2. Создайте два изолированных хрящевые дефекты в блоковый паз с стерильным воздухом Operatinг дрель (3,6 мм в диаметре).
3. Очистите и промойте дефект стерильным физиологическим раствором.
4. Следует обратить внимание не открывать полость кости в любое время. При необходимости уплотнения нижней части дефектов с электрическим прижиганием с кровотечением.
5. Имплантировать матрицы засевают культурными хондроцитов с пористым вниз лицевой стороны (рис. 2). Тогда пресс-вписываются в отверстия и промойте окружающей поверхности.
6. Печать имплантированных матриц с немного фибринового клея (Tissucol Duo S) для обеспечения надежной фиксации.
7. После свертывания, переместите коленной чашечки в блоковый канавку и применять полный диапазон движения в коленном суставе несколько раз.
8. Смещение коленной чашечки сбоку еще раз и проверить его на любое событие или знак нестабильной фиксации. Матриц следует держать неподвижно на месте.
9. Заменить коленная чашечка снова и завершить операцию с закрытием раны в слоях и спрей туалетный как описано выше.

Результаты

Описанная хирургическая техника позволяет успешно изоляции и имплантация аутологичных хондроцитов в искусственную хрящевого дефекта. Экспериментальная установка привела к успешной интеграции имплантата в окружающие хряща.

После 12 недель в живом организме, хрящевой дефект был заполнен восстановления тканей с однородной поверхностью и нетронутыми, что позволило снизить напряжение сдвига и повреждения имплантата (Рис. 4). Более того, ни гипертрофии или кальцификации и...

Обсуждение

Представленный протокол обеспечивает установленный ^9,12,13 и легко воспроизводимые техники, чтобы изолировать аутологичных хондроцитов для последующего распространения и повторной имплантации в искусственно созданные дефекты хряща кролика в коленях. Использование аутологичных хондроцитов для реконструкции и ремонта повреждений суставного хряща уже используется в клинической практике обеспечивать удовлетворяя долгосрочный результат ^6.

Основными проблемами, как, например ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента/оборудования	Компания	Номер по каталогу	Примечания
DMEM	Biochrom AG	F 0415
Коллагеназа A	Roche	10 103 586 001	0.21 U/mg
Фетальная телячья сыворотка (ФТС)	PAN Biotech GmbH	3702-P103009
Пропофол	Fresenius Kabi
Пенициллин/Стрептомицин	Biochrom AG	A 2213	10,000 U/ml/10,000 μg/ml
PBS Дульбекко (1X)	Biochrom AG	L1815
Этанол (70%)	Merck KgaA	410230
Трипсин-ЭДТА 0.25 %/0.02 %	Biochrom AG	L2163	в PBS без Ca2+, Mg2+
Фентанил	Delta Select GmBH	1819340
Раствор NaCl (0.9%)	Bbraun	8333A193
Чашки для культивирования тканей 100 мм/150 мм	TPP AG	93100/93150	Площадь роста 60.1 mm2/147.8 mm2
Флаконы для культивирования тканей 25/75 mm2	TPP AG	90025/90075	25 mm2, 75 mm2
Центрифужные пробирки (50 ml)	TPP AG	91050	Гамма-стерилизованные
Гемоцитометр	Brand GmbH+Co KG	717810	Нойбауэра
Раствор трипанового синего 0.4%	Sigma-Aldrich	L8154
Спрей-повязка (OpSite)	Smith&Nephew	66004978	Проницаема для водяного пара
Chondro-GideÒ	Geistlich Pharma AG	30915.5
Биопсийный панч	pfm medical ag	48351
Tissucol Duo S	Baxter	3419627	0.5 ml