Лечение костно-хрящевых дефектов в коленного сустава кролика путем имплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в сгустки фибрина

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лечение костно-хрящевых дефектов в коленного сустава кролика путем имплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в сгустки фибрина

17.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4423

⸱

21 мая 2013 г.

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Экспериментальной методики для лечения костно-хрящевых дефектов в коленный сустав кролика описано. Имплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в костно-хрящевых дефектов обеспечивает перспективное развитие в области тканевой инженерии. Подготовка фибрин-клеточного сгустков В пробирке Предлагает стандартизованный метод имплантации.

Аннотация

Лечение остеохондральных дефектов суставных поверхностей на протяжении многих лет остается сложной задачей для врачей. Более глубокое понимание взаимодействия суставного хряща и субхондральной кости в последние годы привело к повышенному вниманию к восстановлению всего остеохондрального комплекса. По сравнению с хрящевыми поражениями, регенерация остеохондральных дефектов гораздо более сложный процесс, представляющий собой значительно более серьезную хирургическую и терапевтическую проблему. Поврежденная ткань включает в себя не только поверхностный слой хряща, но и субхондральную кость. При глубоких остеохондральных повреждениях, которые возникают, например, при острохондрозе (osteochondrosis dissecans), для восстановления поверхности сустава необходимо замещение всей толщины дефекта ¹. Подходящие терапевтические процедуры должны учитывать особенности этих двух различных тканей с их разным внутренним регенеративным потенциалом ². За последние десятилетия появилось несколько вариантов хирургического лечения, которые уже получили клиническое признание ^3-6.

Автологичные или аллогенные остеохондральные трансплантаты состоят из суставного хряща и субхондральной кости и позволяют заменить весь остеохондральный блок. Дефекты заполняются цилиндрическими остеохондральными графтами, целью которых является создание конгруэнтной поверхности, покрытой гиалиновым хрящом ^3,7,8. К недостаткам относятся ограниченное количество доступных графтов, заболеваемость в области донорского сайта (для автологичных трансплантатов) и неконгруэнтность поверхности; в связи с этим применение данного метода особенно ограничено при обширных дефектах.

Новые подходы в области тканевой инженерии открыли многообещающие возможности для регенеративной остеохондральной терапии. Имплантация аутологичных хондроцитов стала первым клеточным биологическим методом лечения полнослойных повреждений хряща и в настоящее время широко применяется во всем мире, демонстрируя хорошие клинические результаты даже спустя 10–20 лет после имплантации ^9,10. Однако на сегодняшний день данный метод не подходит для лечения всех типов повреждений, например, глубоких дефектов с вовлечением субхондральной кости ¹¹.

Метод «сэндвича» сочетает в себе костную пластику с современными подходами в тканевой инженерии ^5,6. По всей видимости, данная комбинация позволяет преодолеть ограничения, характерные для использования только остеохондральных трансплантатов. После аутологичной костной пластики в области субхондрального дефекта сверху накладываются швы на мембрану, заселенную аутологичными хондроцитами, что способствует совмещению топографии трансплантата с поврежденным участком. Разумеется, предшествующая реконструкция кости требует дополнительного времени на операцию и зачастую даже проведения отдельного хирургического вмешательства. Кроме того, на сегодняшний день отсутствуют долгосрочные данные ¹².

Тканевая инженерия без дополнительной костной пластики направлена на восстановление сложной структуры и свойств нативного суставного хряща за счет хондрогенного и остеогенного потенциала трансплантированных клеток. Однако, как правило, более-менее регенерирует только хрящевая ткань. Дополнительные остеохондральные повреждения требуют специального дальнейшего лечения. Для достижения регенерации многослойной структуры остеохондральных дефектов трехмерные тканеинженерные конструкции, заселенные аутологичными или аллогенными клетками, могут обеспечить высокую регенеративную способность ¹¹.

Наряду с аутологичными хондроцитами, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляются привлекательной альтернативой для восстановления полнослойной хрящевой ткани. В многочисленных доклинических исследованиях in vitro и in vivo мезенхимальные стволовые клетки продемонстрировали отличный регенеративный потенциал тканей ^13,14. Важным преимуществом мезенхимальных стволовых клеток, особенно при лечении остеохондральных дефектов, является их способность дифференцироваться как в остеоциты, так и в хондроциты. Таким образом, они потенциально позволяют осуществить многослойную регенерацию дефекта.

В последние годы было разработано и оценено несколько скаффолдов с потенциалом для остеохондральной регенерации, которые показали многообещающие предварительные результаты ^1,15-18. Кроме того, использование фибринового клея в качестве носителя клеток стало одним из предпочтительных методов в экспериментальном восстановлении хряща и уже было успешно применено в ряде исследований на животных ^19-21 и даже в первых клинических испытаниях на людях ²².

В следующем протоколе будет продемонстрирована экспериментальная методика выделения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга кролика для их последующей пролиферации в клеточной культуре и создания стандартизированной модели фибрино-клеточных сгустков in vitro. Наконец, будет описана методика имплантации заранее подготовленных фибрино-клеточных сгустков в искусственные остеохондральные дефекты коленного сустава кролика.

Протокол

А. Получение Донор Кролика для выделения мезенхимальных стволовых клеток (хирургия номер)

Клетки выделяют из самцов новозеландских белых (NZW) кроликов в возрасте 4 месяцев и около 3 кг веса тела.
Вызвать анестезии пропофолом (10 мг / кг массы тела IV) и жертвовать пентобарбиталом натрия (100 мг / кг массы тела внутривенно).
Бритье меха от задних конечностей, спины и живота с электрической машинки и пропылесосить меха.
Лечить бритой место водой с 70% этанола.
Используйте тупой пинцет, острые ножницы (или скальпель) и костной фрезы для тканей и связок.
Сделайте надрез вдоль черепной поверхности ног и голеней.
Отражение кожи и подкожной клетчатки либо острые или тупые.
Отдельные мышцы и связки от бедренной костью. Держите сокращение как можно ближе к кости, как можно сделать чистую рассечение. Не отрывайте бедра от голени в это время.
Вырезать THRтельное тазобедренного сустава отделить головки бедренной кости из вертлужной впадины.
Поднимите большеберцовой-бедренного комплекса.
Используйте скальпель, лезвие, чтобы соскоблить остатки мягких тканей от костей или протереть кости стерильной ткани ткань. На данный момент, бедра и голени по-прежнему связаны.
Удалить надколенника резанием, а затем вырезать связок коленного сустава, чтобы, наконец, отдельные кости.
Спрей отделить кости с 70% этанола, пусть воздух сухой и поместить каждую кость в 50 мл центрифужные пробирки с сотовыми культуральной среде (DMEM + 1% пенициллина / стрептомицина (пенициллина / стрептомицина)), чтобы держать их влажными.
Теперь переключитесь в стерильной капот культуре клеток ламинарного потока.

B. Промывка Кролик MSC от костей и расширение (капот культуре клеток)

Собирать кости из пробирки и поместите их в 150 мм блюда с использованием стерильного пинцета.
Снимите обе кости заканчивается стерильным пилы и перемещать фигуры новым 150-мм чашек.
Заполните шприц 10 мл с MediUM (DMEM), прикрепите иглу 18 калибра и вставьте в отверстие в костном мозге.
Затем промыть полость кости со средним и промойте костного мозга в блюдо. После промывки с другого конца, если это возможно. При необходимости провожали более от концов. Если кость должна нарушать, просто промыть внутри кости.
Аспирируйте суспензии клеток среды в шприц и промыть костного мозга, пока суспензия не является свободно плавающим через полость костного мозга, и никаких дальнейших костного мозга появляются сгустки.
После костного мозга была собрана из всех костей, костного мозга нарушить сгустки, проходя через иглу 18 калибра: заполнить шприц с иглой и вытеснить в среде.
После этого суспензию фильтруют через ячейку фильтра в 50 мл трубки. Для того чтобы предотвратить потерю клеток, мыть 2x культуральной чашке с 10 мл среды и фильтруют, а также.
Центрифуга суспензии при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
Удалить супернатант и ресуспендируют клетки ПеллET в 10 мл среды (DMEM + 1% пенициллина / стрептомицина).
Отдельные клетки крови из мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) и мезенхимальных стволовых клеток (МСК), используя Biocoll Разделение решения.
Заполнить 5 мл Biocoll разделения раствора в 15 мл пробирку и осторожно добавляют 5 мл клеточной подвески на верхней и центрифугируют при 800 х г в течение 20 мин при комнатной температуре (без тормоза).
Возможные результаты см. Рисунок 1: быть более плотной, чем Biocoll, красные клетки крови осадком на дно, а МПК и мезенхимальные стволовые клетки остаются на поверхности раздела.
Осторожно снимите интерфейс в 15 мл трубки и промыть 5 мл PBS.
Центрифуга как описано в пункте 22, ресуспендируют в 5 мл PBS и повторить 2-3х.
Затем снова центрифугируют при 350 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (с тормозом).
Ресуспендируют в 10 мл среды и подсчет клеток в гемоцитометра.
Пластина клеток при исходной плотности посева примерно 5 × 10 ⁶ в 150-мм чашек.
Через 2-3 дня, повторнодвигаться неприлипшие клетки. Возможно, вам придется промыть PBS первых, с тем, чтобы удалить остатки клеток. Добавить свежий полной среде (DMEM + 10% фетальной сыворотки теленка (FCS) + 1% пенициллина / стрептомицина) впоследствии.
Кормить клетки каждые 3-4 дня (рис. 2).
Через 5-10 дней, проход клетки в первый раз.

С. Подготовка сгустков фибрина в пробирке

В день имплантации освободить адгезивных клеток из колбы / посуда по 3 мин экспозиции до 0,25% трипсин-ЭДТА. Остановить трипсинизация, добавив полную среду.
Распределить клеток в 50 мл трубки сокола и мыть их в два раза с PBS.
Определение жизнеспособности клеток и номера окрашиванием трипановым синим.
Добавить 50000 клеток / микроцентрифужных трубки и собирать гранулы центрифугированием при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Подготовить Mastermix, по крайней мере, еще один сгусток по мере необходимости.
Ресуспендируют осадок клеток в 17 мкл PBS и смешивают 25 мкл раствора фибриногена компонент ТканьCOL-Kit с этим 17 мкл суспензии MSC.
Возьмите стерильную чашку с предварительно просверленными отверстиями (3x3.6 мм) в соответствии с отверстиями в естественных условиях (рис. 3).
Во-первых, прививку 4 мкл раствора тромбина (500 МЕ / мл) в одно отверстие, с последующим немедленным добавлением 42 мкл фибриноген-клеточного подвески и снова 4 мкл раствора тромбина на вершине. Не смешивайте подвески, чтобы избежать свертывания на кончике пипетки. Во-первых, в объеме 50 мкл из пипетки фибриноген-клеточно-суспензионных будет выступать ободу предварительно просверленные отверстия без плавления благодаря поверхностному натяжению. Тем не менее, после полного свертывания (через 60 мин) сгусток сжимается и вписывается в предварительно просверленные отверстия.
Удалить тромб тщательно при помощи тупого пинцета и место в микроцентрифужную трубу с PBS. Подготовьте 2 сгустков / животного.
Возьмите сгустков в комнату хирургии.

D. имплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в сгустки фибрина

Вызвать анестезии кролика (NZW, мужчина, 3,5-4,0 кг массы тела, 5-6 месяцев) внутривенной инъекции пропофола (10 мг / кг массы тела).
Бритье колена, которыми оперирует с электрической машинки и вакуумные меха. Все процедуры перед именем выполняются в комнате подготовки операции, чтобы избежать загрязнения стерильных условиях операционной комнаты.
После интубации поддержания анестезии с 1,5 мг / кг / мин пропофола и 0,05 мг / кг / мин фентанила внутривенно. Монитор анестезии с помощью капнографических, пульсоксиметрии и частоту пульса.
Лечить бритой колена тщательно и покрыть остальную часть кролика с стерильную повязку.
Пропальпируйте коленной чашечки и выполняют разрез кожи медиальной коленной чашечки.
Открытый коленного сустава при медиальных парапателлярный артротомия в стерильных условиях. Старайтесь избегать любых резки небольших поверхностных кровеносных сосудов.
Смещение коленной чашечки сбоку (рис. 4).
После Inspeие коленного сустава для любых сопутствующих повреждений хряща или совместных аномалий, создать два костно-хрящевых дефектов (глубиной 3 мм, восьмерка-образная) в блоковый паз с стерильной операционной дрель-воздушных сил (3,6 мм в диаметре) со стоп-устройством (рис. 5).
Очистите дефектов и промыть их стерильным физиологическим раствором.
До имплантации заполнить 20 мкл фибринового клея в дефектах и распределить их равномерно на дне дефекта.
Затем имплантат сгустков запрессован в восьмерку формы дефекта.
После свертывания, переместите коленной чашечки в блоковый канавкой и сгибать и растягивать колена несколько раз.
Смещение коленной чашечки сбоку еще раз и убедитесь, что фибриноген-клеточных сгустков-прежнему на месте.
Заменить коленная чашечка снова и завершить операцию с закрытием раны в слоях с одной кнопкой швов (4-0 Vicryl) и непрерывным швом кожные (4-0 Monocryl) (оба с рассасывающиеся нитиматериала).
Наконец, запечатать рану с распылителем туалетный пропускает водяной пар.
Для послеоперационного ухода, рана проверяется ежедневно в течение 7 дней. Кролики получают для послеоперационного обезболивания Carprofen 4 мг / кг подкожно каждые 24 часов (за 4 дня) и Buprenorphin 0,03 мг / кг подкожно каждые 12 ч (в течение 2,5 дней). Стабилизации колена (например, соус) не является необходимым.