Xenopus яйцо экстракт является полезной модели системы для расследования контрольно-пропускного пункта повреждения ДНК. Этот протокол предназначен для подготовки Xenopus яйцо экстракты и повреждение ДНК реагенты контрольно-пропускном пункте вызывающим. Эти методы могут быть адаптированы к различным повреждающим ДНК подходы в изучении контрольно-пропускного пункта сигнализации повреждения ДНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Исследование Checkpoint повреждения ДНК использовании
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ежедневно клетки подвергаются воздействию различных эндогенных и внешних повреждающих факторов. Для борьбы с этими воздействиями в клетках в процессе эволюции развилась сигнальная система контрольных точек повреждения ДНК, которая служит механизмом надзора для обнаружения повреждений ДНК и управления клеточными ответами на них. В сигнальную систему контрольных точек повреждения ДНК вовлечены несколько групп белков, называемых сенсорами, трансдукторами и эффекторами (Figure 1). В этом сложном сигнальном пути ATR (ATM and Rad3-related) является одной из основных киназ, которые могут реагировать на повреждение ДНК и репликативный стресс. Активированный ATR способен фосфорилировать свои нижестоящие субстраты, такие как Chk1 (Checkpoint kinase 1). В свою очередь, фосфорилированная и активированная Chk1 запускает множество последующих эффектов в системе контрольных точек повреждения ДНК, включая остановку клеточного цикла, активацию транскрипции, репарацию повреждений ДНК, а также апоптоз или старение (Figure 1). При повреждении ДНК отсутствие активации контрольных точек приводит к сохранению неисправленных повреждений и, как следствие, к геномной нестабильности. Изучение контрольных точек повреждения ДНК позволит выяснить, как клетки поддерживают целостность генома, и обеспечит лучшее понимание механизмов развития таких заболеваний человека, как рак.
Xenopus laevis экстракты из икринок становятся мощной бесклеточной модельной системой для исследования контрольных точек повреждения ДНК. Экстракт низкого скоростного центрифугирования (LSE) был впервые описан группой Масуи1. Добавление демембранированного хроматина сперматозоидов в LSE приводит к формированию ядер, в которых репликация ДНК происходит полуконсервативным способом один раз за клеточный цикл.
Сигнальный путь контрольной точки, опосредованный ATR/Chk1, активируется при повреждении ДНК или репликативном стрессе 2. В настоящее время для индукции контрольной точки повреждения ДНК используются два метода: подходы, вызывающие повреждение ДНК, и структуры, имитирующие повреждение ДНК 3. Повреждение ДНК может быть вызвано ультрафиолетовым (УФ) облучением, γ-облучением, метилметансульфонатом (MMS), митомицином C (MMC), 4-нитрохинолин-1-оксидом (4-NQO) или афидиколином3, 4. MMS представляет собой алкилирующий агент, который ингибирует репликацию ДНК и активирует опосредованную ATR/Chk1 контрольную точку повреждения ДНК 4-7. УФ-облучение также запускает ATR/Chk1-зависимую контрольную точку повреждения ДНК 8. Структура AT70, имитирующая повреждение ДНК, представляет собой отжженный комплекс двух олигонуклеотидов poly-(dA)70 и poly-(dT)70. Система AT70 была разработана в лаборатории Билла Данфи и широко используется для индукции сигнального пути контрольной точки ATR/Chk1 9-12.
Здесь мы описываем протоколы (1) по подготовке бесклеточных экстрактов яиц (LSE), (2) по воздействию на хроматин сперматозоидов Xenopus двумя различными способами повреждения ДНК (ММС и УФ), (3) по подготовке структуры AT70, имитирующей повреждение ДНК, и (4) по запуску опосредованного ATR/Chk1 контрольного пункта повреждения ДНК в LSE с использованием поврежденного хроматина сперматозоидов или структуры, имитирующей повреждение ДНК.
Протокол
1. Подготовка LSE
- Женский лягушек (Xenopus Хепориз) вводится два раза для сбора яиц. Первая инъекция (грунтовка) составляет 100 U PMSG (Беременные Mare сыворотке гонадотропина) в лягушку. Лягушки должны быть загрунтованы по крайней мере, за два дня до вызывающие откладки яиц и загрунтовать лягушки могут использоваться на срок до двух недель. Премьер-лягушки, вводят подкожно ГСЖК в спинной лимфатический мешочки с использованием 3 мл шприц и иглу 27 G.
- Для стимулирования откладки яиц, вводить 500 U ХГЧ (хорионического гонадотропина человека) на загрунтованную лягушки подкожно в спинных мешочков лимфатических использованием 27 G игла. Инкуб....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть несколько преимуществ в изучении контрольно-пропускного пункта повреждения ДНК использовании Xenopus яйцо экстрактов. Использование яйцо экстракт содержит большое количество бесклеточных экстрактов синхронизированы в интерфазе клеточного цикла. Яйцо экстракты могут быть легко и недорого сделал. Это сравнительно легко повредить ДНК и хроматина и выявить дефект в контрольно-пропускном пункте повреждения ДНК после immunodepleting целевой белок из яйца экстракта. Впоследствии, потенциальный дефект функция може.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа частично поддержана средств, предоставленных Университетом Северной Каролины в Шарлотте, Wachovia основу фонда для профессорско-преподавательского мастерства, и грант от NIGMS (R15GM101571).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагенты | |||
| Anti-Chk1 P-S344 антитела | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 антител | Санта-Крус | SC7898 | |
| Апротинин | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Циклогексимид | Сигма | C7698-5G | |
| Цитохалазин | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| ХГЧ | Сигма | CG10-10VL | |
| L-цистеин | Сигма | C7352-1кг | |
| Лейпептин | VWR | 97063-922 | |
| Метиловый метансульфонат (MMS) | Сигма | 129925-5G | |
| Нокодазолом | Сигма | M1404-2MG | |
| ГСЖК | Calbiochem | 367222 | |
| Пример буфер | Сигма | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals США | 209-12041 | |
| Оборудование | |||
| Ковш для откладки яиц | Rubbermaid Commercial Products | 6308 | |
| CL2 IEC центрифуге с бакет ротора | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 качающийся ротор ведро | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 плюс сверхскоростные центрифуги | Thermo Scientific | 46910 | |
| УФ сшивателя | UVP | 95-0174-01 | |
| Решения | |||
| 1x MMR | 100 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 0,5 мМ MgSO 4, 2,5 мМ CaCl 2, 5 мМ HEPES, рН до 7,8 с помощью 10 М NaOH | ||
| Апротинин / лейпептин складе | 10 мг / мл в воде. Храните 20 мкл аликвоты при -80 ° C. | ||
| Буфер X | 0,2 М сахарозы, 80 мМ KCl, 15 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES, отрегулировать рН до 7,5 соляной кислотой | ||
| Циклогексимид складе | 10 мг / мл в воде. Магазин 1 мл аликвоты при -20 ° C. | ||
| Цитохалазин складе | 5 мг / мл в ДМСО. Храните 20 мкл аликвоты при -20 ° C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) акции | 1 M в воде. Магазин 1 мл аликвоты при -20 ° C. | ||
| ELB | 0,25 М сахарозы, 1 мМ DTT, 50 мкг / мл циклогексимид, 2,5 мМ MgCl 2, 50 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH7.7 | ||
| Нокодазолом складе | 10 мг / мл в ДМСО. Храните 5 мкл аликвоты при -80 ° C. | ||
| Энергия смеси | 375 мм креатин фосфат, 50 мМ ATP и 25 мМ MgCl 2. Аликвоты сохраняются при температуре -80 ° C. | ||
| Ядерная раствор красителя | 0,4 мкг / мл Hoechst 33258, 25% глицерина(V / V), в 1x PBS | ||
| Tautomycin складе | 100 мкм в ДМСО. Храните 10 мкл аликвоты при -80 ° C. |
Ссылки
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Re....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
