Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4450

⸱

20 ноября 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Jackson Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

По теги внеклеточных доменов мембранных рецепторов с superecliptic pHluorin, и эти изображения слияния рецепторов в культуре нейронов мыши, мы можем напрямую визуализировать отдельные везикулярного события вставки рецепторы клеточной мембраны. Эта техника будет играть важную роль в выяснении молекулярных механизмов, регулирующих рецепторов вставки в плазматическую мембрану.

Аннотация

Для более глубокого понимания механизмов, регулирующих трафик рецепторов между плазматической мембраной (ПМ) и внутриклеточными компартментами, требуется экспериментальный подход с отличным пространственным и временным разрешением. Более того, такой подход должен обладать способностью отличать рецепторы, локализованные на ПМ, от рецепторов во внутриклеточных компартментах. Что еще более важно, детектирование рецепторов в одной везикуле требует исключительной чувствительности, поскольку каждая везикула несет лишь небольшое количество рецепторов. Стандартные подходы к изучению трафика рецепторов включают поверхностное биотинилирование с последующим биохимическим детектированием, которому не хватает как необходимого пространственного, так и временного разрешения, а также исследование иммуномеченных поверхностных рецепторов с помощью флуоресцентной микроскопии, что требует химической фиксации клеток и, следовательно, не обладает достаточным временным разрешением1-6. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы и другие исследователи разработали и применили новую стратегию, позволяющую визуализировать динамическое встраивание рецепторов в ПМ с отличным пространственным и временным разрешением7-17. Этот подход включает в себя слияние pH-чувствительного GFP, superecliptic pHluorin 18, с N-концевым внеклеточным доменом рецепторов. Superecliptic pHluorin обладает уникальным свойством быть флуоресцентным при нейтральном pH и нефлуоресцентным при кислом pH (pH < 6.0). Таким образом, меченые рецепторы не флуоресцируют, находясь в кислом просвете внутриклеточных транспортных везикул или эндосомных компартментов, и становятся легко визуализируемыми только при воздействии нейтральной внеклеточной среды на внешней поверхности ПМ. Следовательно, наша стратегия позволяет нам отличать рецепторы на поверхности ПМ от рецепторов внутри внутриклеточных транспортных везикул. Для достижения достаточного пространственного и временного разрешения, а также чувствительности, необходимой для изучения динамического трафика рецепторов, мы использовали флуоресцентную микроскопию общего внутреннего отражения (TIRFM), которая позволила нам достичь оптимального пространственного разрешения оптического изображения (~170 nm), временного разрешения видеомикроскопии (30 frames/sec) и чувствительности, достаточной для детектирования флуоресценции одной молекулы GFP. Визуализируя рецепторы, меченные pHluorin, с помощью TIRFM, мы смогли напрямую наблюдать отдельные события встраивания рецепторов в ПМ в культивируемых нейронах. Этот метод визуализации потенциально может быть применен к любому мембранному белку с внеклеточным доменом, который может быть помечен superecliptic pHluorin, и позволит детально изучить ключевые механизмы встраивания различных мембранных белков (рецепторов, ионных каналов, транспортеров и т. д.) в ПМ.

Протокол

1. Подготовка культуры мышь Glia для нейронов принадлежности культуры

  1. T75 колбы покрыты раствора коллагена (1:3 разбавление Purecol в DDH 2 O). Колбы устанавливаются вертикально и оставили на ночь сушиться в капюшоне культуры ткани.
  2. Препарирование буфера (ACSF: 119 мм NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 30 мМ глюкозы, 25 мМ HEPES, рН 7,4, без кальция) и глии средств массовой информации (DMEM с добавлением 10% FBS, 10 ед / мл пенициллина, 10 мкг / мл стрептомицина и Glutamax) готовят и хранят при 4 ° С до готовности к употреблению.
  3. В день глии культуры, средств массовой информации глии нагревают в течение 30 мин при 37 ° С водяной бане до вскрытия мышей мозг. Эмбриональные или новорожденных мышей усыпляют быстрое обезглавливание. Церебральная кора расчленены под микроскопом рассечение.
  4. Расчлененный тканей мозга перевариваются в папаина раствор (100 мл папаина и 20 мкл 1% ДНКазы I в 2 буфера рассечение мл) при 37 ° C лR 20 мин.
  5. После папаин пищеварения, мозг ткани промывают 10 мл подогретого СМИ глии. Свежее медиа глии (2 мл) добавляют к переваривается ткани мозга, и ткани растирают с огнем полированное стекло пипетки Пастера.
  6. Свежее медиа глии (8 мл) добавляют к диссоциированных тканей. 70 мкм клетки-фильтр используется для фильтрации диссоциированных подвески ткани. Затем клетки высевают в колбы T75 (обычно 2-3 эмбрионов могут семян одна колба T75) и помещают в 37 ° C культуре клеток инкубатора.
  7. На следующий день, средств массовой информации из колбы T75 всасывается. Колбы промывают 10 мл PBS. Свежее медиа глии (10-15 мл), затем добавляли в каждую колбу.
  8. В течение 10-12 дней, глии в T75 колб должна быть вырожденной. Глиальные клетки промывали PBS и 5 мл 0,05% трипсина добавляется к каждому T75 колбу.
  9. После трипсина инкубации при 37 ° C в течение 5 мин, глиальные клетки разобщены и глиальных клеток из каждой колбы T75 делятся на дверазличных коллагена покрытием колбы T75.
  10. Культура вставками (Millipore PICM03050) получают путем размещения их в 6-луночные планшеты, покрытие их с коллагеном и воздушной сушки в течение ночи. Glia СМИ (2 мл каждая) помещают под каждую культуру вставки.
  11. Glia из сливной T75 Колбы трипсином и высевают на культуру вставки (одна колба T75 в 6-луночный планшет, 2 мл каждая вставка). Эти вставки глии культуры будут использованы для состояния нейронов культур.

2. Нейронов культуры

  1. Покровные стекла для нейронов культуры очищаются путем замачивания в 70% HNO 3 по крайней мере, в течение ночи. Покровные затем промывают DDH 2 O минимум в 3 раза и сушат в духовке Isotemp (> 200 ° C) в течение ночи.
  2. Очищенные покровные находятся в 6-луночный планшет, одним покровным на лунку. Покровные стекла покрыты поли-L-лизина раствор (2 мл, 0,1% в 100 мМ борной кислоты, рН = 8,5) в течение ночи при 37 ° C инкубатора.
  3. поли-L-лизина раствор удаляется из покровных и покровные промывают 3 раза автоклавного DDH 2 O. Покровные затем инкубируют при 37 ° C инкубаторе в течение ночи в покрытие средств массовой информации (Neurobasal с добавлением 5% инактивированной лошадиной сыворотки, 10 ед / мл пенициллина, 10 мкг / мл стрептомицина, Glutamax, 2% B27 добавки добавляют в покрытие среде В день она используется).
  4. На следующий день, покрытие СМИ удаляется и 2 мл свежей среды покрытий с B-27 добавляется в каждую лунку, которая имеет покровное стекло.
  5. Беременных мышей (E15-18) усыпляют с CO 2, и эмбриональных мышей эвтаназии путем обезглавливания. Гиппокамп или полосатое тело разрезали из мозговой ткани и помещают в 15 мл коническую трубку с ледяным буфером вскрытия, по культуре нейронов гиппокампа и полосатого средних нейронов колючих, соответственно.
  6. Расчлененный тканей мозга разобщены с папаином, как описано в шагах 1,4) и 1,5).
  7. Фаосле диссоциации, количество клеток в каждой нейронов подвеска считается с гемоцитометра. Нейроны, которые затем высевают на каждом покровном при плотности 0,4 х 10 6 клеток на лунку 6-луночный планшет и культивировали при 37 ° C инкубаторе в течение ночи (нейроны DIV 0).
  8. Для подготовки вставками глии культуры для кондиционирования нейронов культуры, средств массовой информации глии удаляется из вставляет глии культуры и свежей среде покрытия добавляют (2 мл на вставке и 2 мл под вставку).
  9. На следующий день (DIV 1), покровные с нейроны помещаются под глии культуры вставками, одним покровным в каждую лунку.
  10. Нейроны кормят половина объема свежего подогретого кормления средств массовой информации (с B-27) каждые 3-4 дня, пока они не готовы к трансфекции и визуализации экспериментов.

3. Трансфекция

  1. Нейронные трансфекции осуществляется с помощью Lipofectamine 2000 года. Для каждого нейрона культуры (одной культуры на покровное), 2 мклLipofectamine 2000 и 1 мкг ДНК используется. Свежий Neurobasal среде без добавки используются для разбавления Lipofectamine и ДНК.
  2. ДНК и Lipofectamine инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре после смешивания.
  3. Сохранить 1 мл средства массовой информации из-под каждой вставки культуры глии, и 1 мл внутри каждой вставки, и передать средства массовой информации коническую трубку. Добавить такой же объем кормления СМИ + B27, чтобы сохранить среду и инкубируют при 37 ° C. Эта среда используется для нейронов культуры после трансфекции.
  4. После 20-минутного Lipofectamine / ДНК инкубации, вставки глии культуры удаляются мгновенно с 6-луночных планшетах. 200 мкл Lipofectamine / ДНК смесь добавляют к каждой покровное с нейронами. Вставками глии культуры, затем вернулся в каждой лунке, над нейронами. Поколение пузырьков под мембраной культуры вставками следует избегать. Нейроны инкубировали с Lipofectamine / ДНК смесь при температуре 37 ° С в течение 2-4 часов.
  5. После тыс.В 2-4 часов инкубационного периода, глии вставки удаляются снова. Культуральной среде с Lipofectamine / ДНК смесь снять с каждой лунке. Средства массовой информации сохраняется в шаге 3,3) добавляют к нейронам (2 мл на лунку). Вставками Glia культуры вернулся в каждую лунку, и глии средств массовой информации из каждой пластины удаляется, и 2 мл средства массовой информации с шагом 3,3) добавляют в каждой вставки.
  6. Нейроны культивировали в течение дополнительных 24-72 часов, чтобы выражение трансфекции кДНК перед TIRF изображений производится на эти нейроны.

4. TIRF изображений

  1. Искусственные цереброспинальной жидкости (ACSF: 119 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 30 мМ глюкозы, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 25 мМ HEPES, рН = 7,4) будет использоваться для живого изображения экспериментов. Наши TIRF системы визуализации является обычай настройки с 100-мВт голубой лазер для возбуждения и электронно Умножив Прибор с зарядовой связью (EMCCD) камеры для детектора.
  2. До изображений экспериментов, ACSF предупрежден в 37 и Dнапример, C водяной бане в течение 30 мин. Отопление вставки для живого изображения помещается на столик микроскопа и отопления вставки, лазер, и камера нагревается, по крайней мере за 30 минут до начала изображений экспериментов.
  3. Покровное с трансфицированных нейронов собраны в живых изображений камеры. Подогретого ACSF помещают в камеру после того, как камера в собранном виде; этот шаг должен быть завершен как можно быстрее.
  4. Как только камера ставится на отопление вставки на столике микроскопа, трансфицированных нейронов определяются визуально под эпи-флуоресцентный режим съемки.
  5. После здоровые нейроны трансфицированных определены (см. рисунки 1 и 2), как правило, выполняют 1 мин фото-отбеливатель для устранения уже существующих pHluorin флуоресценции на мембране плазмы, как pHluorin-рецепторов на мембране имеют очень высокие уровни флуоресценции при TIRF изображений первого запуска, который мешает визуализации отдельных модулейertion событий.
  6. После photobleach, усиление установка ВЭУ на EMCCD камера установлена ​​на максимум, а запись выполняется в течение 1 мин при 10 Гц.
  7. Каждая запись будет содержать 600 изображений. Отдельные события вставки определены, играя записи обратно, используя ImageJ. Отдельные события вставки проанализированы вручную с помощью ImageJ.

5. Представитель Результаты

В соответствии нейронов культуры является ключом к успешному живого изображения экспериментов. Рисунке 1 показана нейронов гиппокампа мыши культивировали, используя нашу протокол от 11 до DIV DIV 18. Как видно из фотографий, что нейроны разработали обширные процессы и, что дендритные процессы покрыты плотной с дендритных шипиков, признаки того, что эти нейроны здоровых в культуре. Наша культура протокол также может быть использован для других типов нейронов в головном мозге. Например, мы недавно использовали этот протокол для культурыполосатого средних нейронов колючих в исследование с целью изучения дофаминовых D2-рецепторов (DRD2) вставки в культуре мыши полосатого средних нейронов колючих 9. рисунке 2 показаны средние мыши полосатой колючих нейроны культивировались с помощью нашего протокола на DIV 8. Мы также успешно выполняется TIRF изображений superecliptic pHluorin с метками DRD2s этого типа нейронов. Рисунке 3 показано выражение pHluorin с метками DRD2 (рН-DRD2) в среде нейронов колючих и визуализации рН-DRD2 включение в этот нейрон.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Гиппокампа мышей культуры с помощью метода интерфейса культуры. DIV: дней в пробирке, в день культура рассматривается как DIV 0. Из фотографий видно, что зрелые нейроны гиппокампа в этом типе культуры между DIV DIV 11 и 15. В DIV 11 и 13, дендриты нейронов покрыты filipodia и незрелых шипами. В DIV 15 и18, дендриты нейронов покрыты крупными шипами, что свидетельствует о более зрелые нейроны. Левая панель: низкого увеличения изображения мышью нейронов гиппокампа в различных возрастах. Правая панель: с высоким увеличением изображения (увеличение на нейронных дендритов левой панели) нейронов дендритные процессы с дендритных шипиков в разном возрасте.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Мыши полосатого средних колючих нейронов культуры с помощью метода интерфейса культуры. Нейроны в изображения на DIV 8.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Мышью полосатого средних колючих нейронов трансфицировали супер эклиптики pHluorin с метками дофаминовых D2-рецепторов (рН-DRD2). Изображение слева максимальной проекции интенсивности замедленной записи (600 изображений, 100 мс на изображение). Белые стрелки указывают на отдельные везикулярного введения рН-DRD2. Это изображение сохраняет вставки информации в измерении х, но теряет времени. Изображение справа показывает уг максимальной интенсивности проекции, в которой XYT стек поворачивается на 90 градусов вокруг оси у, а максимальная пикселей на каждой оси абсцисс линии проецируется на одной оси у пикселя. Это изображение сохраняет информацию вставки вдоль оси у, но теряет оси Х информации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

По неизвестным причинам, мыши нейроны всегда сложнее, чем крысы культуре нейронов. По нашему опыту, смешанной культуре нейронов и глии хорошо работает для первичной культуре нейронов мыши. Однако такая смешанная культура не подходят для экспериментов TIRF изображений, так как в этом типе культуры нейронов и их процессы имеют тенденцию к росту на вершине глиальных клеток, располагающий нейронов somata и дендритные процессы вне досягаемости микроскопии TIRF. Таким образом, нижняя плотность нейронов культуры с несколькими ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа поддерживается запуск средств из лаборатории Джексона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента О компании Номер по каталогу Комментарии
Очищенного бычьего коллагена решение (Purecol) Advanced Biomatrix 5005-B
Сбалансированный Хэнка солевой раствор (HBSS) GIBCO 14185-045
Пенициллина-стрептомицина (Pen Strep) GIBCO 15140-122
Пируват натрия GIBCO 11360-070
DMEM с высоким содержанием глюкозы GIBCO 10313-021
Фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS)
Glutamax GIBCO 35050-061
Папаином Уортингтон Биохимические корпорации LS003126
Дезоксирибонуклеазы я из бычьей поджелудочной железы (ДНКазы I) SIGMA DN25-10мг
Дульбекко буферном растворе (DPBS) GIBCO 14190-144
0,05% трипсина GIBCO 25300-054
Поли-L-лизин гидробромид SIGMA P2636-1G
Борной кислоты Fisher-научным BP 168-500
Neurobasal Средний GIBCO 21103-049
B-27 Сыворотка-Free дополнения GIBCO 17504-044
Тепла неактивных лошадиной сыворотки GIBCO 26050-070
Липофектамина 2000 Invitrogen 11668 019
HEPES Fisher-научным BP310-500
Культура Insert Millipore PICM03050

Ссылки

  1. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  2. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
  3. Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
  4. Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
  5. Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
  6. Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
  7. Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
  8. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
  9. Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
  10. Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
  11. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
  12. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
  13. Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
  14. Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
  15. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
  16. Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
  17. Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
  18. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Plasma Membrane InsertionTotal Internal Reflection Fluorescence MicroscopyReceptor TraffickingDopamine D2 ReceptorSuperecliptic pHluorinVesicle Fusion DetectionLive Cell ImagingNeuronal Culture
PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.