Визуализация отдельных клеток в плотно упакованных тканей, таких как терминал шванновских клеток (СК) в нервно-мышечных соединениях (NMJs), является сложной задачей. "Последовательное фото-отбеливание» позволяет разграничения одного КА терминала, например, в трицепс мышцы грудины эксплантов, удобный нервно-мышечного препарата, где последовательного отбеливания могут быть объединены с покадровой обработки изображений и Апостериорных Immunostainings.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Последовательное фото-отбеливание разграничить отдельные клетки шванновских в нервно-мышечном соединении
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Последовательное фотообесцвечивание обеспечивает неинвазивный способ маркировки отдельных Шванновских клеток (ШК) в нервно-мышечном соединении (НМС). НМС является крупнейшим синапсом в нервной системе млекопитающих и служит основной моделью для изучения структуры и функции синапсов. В НМС мыши терминали двигательных аксонов образуют контактные зоны с мышечными волокнами, напоминающие по форме крендель. Двигательный аксон и его терминаль окружены ШК. За последние десятилетия было создано несколько линий трансгенных мышей для визуализации двигательных нейронов и ШК, например, мыши Thy1-XFP1 и Plp-GFP2 соответственно.
Вдоль моторных аксонов миелинизирующие аксональные Шванновы клетки (ШК) расположены в виде неперекрывающихся интернод, разделенных узлами Ранвье, что обеспечивает сальтаторное проведение потенциала действия. В отличие от них, терминальные ШК в области синапса представляют собой специализированные глиальные клетки, которые контролируют и стимулируют нейротрансмиссию, утилизируют клеточный дебрис и направляют регенерирующие аксоны. НМС плотно покрыты несколькими (до полудюжины) немиелинизирующими терминальными ШК; однако их невозможно дифференцировать по отдельности с помощью световой микроскопии, так как они находятся в непосредственном мембранном контакте3.
Существует несколько подходов для индивидуальной визуализации терминальных SC. Однако ни один из них не является безупречным. Например, заполнение красителем, при котором одиночные клетки прокалывают микроэлектродом, заполненным красителем, требует разрушения маркированной клетки перед заполнением следующей. Это несовместимо с последующей записью таймлапс-видео3. Мультиспектральное маркирование SC по методу «Brainbow» было достигнуто с помощью комбинаторной экспрессии флуоресцентных белков4. Однако этот метод требует объединения нескольких трансгенов и ограничен паттерном экспрессии используемых промоторов. В будущем экспрессия «фотопереключаемых» белков в SC может стать еще одной альтернативой5. Здесь мы представляем метод последовательного фотовыжигания, при котором одиночные клетки подвергаются выжиганию, а их изображение получается путем вычитания. Мы полагаем, что этот подход — благодаря своей простоте и универсальности — станет ценным дополнением к технологическому арсеналу нейробиологов, особенно с учетом того, что он может быть использован in vivo и перенесен на другие типы клеток, анатомические области или виды6.
В следующем протоколе мы подробно описываем применение последовательного обесцвечивания и последующей конфокальной тайм-лапс микроскопии терминальных SC в эксплантах мышцы triangularis sterni. Этот тонкий, поверхностный и легко выделяемый нервно-мышечный препарат7,8 оказался полезным для изучения развития, физиологии и патологии NMJ9. В завершение мы объясняем, как подготавливается мышца triangularis sterni после фиксации для проведения коррелированной конфокальной визуализации высокого разрешения, иммуногистохимического анализа или ультраструктурных исследований.
Протокол
1. Triangularis Стэрни эксплантов (рис. 1)
Хронометраж: 15 мин.
- Подготовка хирургического инструмента: 2 пары щипцов, 1 ножницы, 1 пара ножниц весны, 1 ткань культуры блюдо (10-см). Предварительно пропускают (минимум 15 минут) охлажденного (4 ° C) раствор Рингера с 5% CO 2/95% O 2. Заполнить 15-см ткань культуры блюдо со льдом и покрыть ее металлической пластиной. Подготовка рассечение микроскопом и поместите 15-см блюдо со льдом при вскрытии рамки для того, чтобы охладить эксплантов во время вскрытия.
- Смертельно анестезию мыши, изофлурана передозировки (или любые другие проверенные методы жертвоприношения). Спрей мышь с 70% этанола для предотвращения загрязнения меха эксплантов. Для SC отбеливания, мы использовали Plp-GFP мышей, которые могут быть пересечены в Thy1-OFP3 или Thy1-Membow13 для одновременной визуализации аксонов.
- Используя пару больших ножниц, сделать срединный разрезкожу над грудиной и два разреза параллельно нижнему краю грудной клетки.
- Используя пару больших ножниц, снять кожу, откройте брюшной стенки, и делать разрезы параллельно грудной клетке все пути назад к позвоночнику. Затем рассекают от грудных мышц, сделав надрезы близкий к мышце вставки на грудину.
- Разрежьте диафрагму открытой чуть ниже мечевидного хряща и рассекают от диафрагмы вдоль реберной вставками.
- Проведение грудную клетку от мечевидного отростка с набором щипцов, начинают бросать ребра от позвоночника, как можно ближе к их вставки. Левая и правая сокращения должны сходиться над сердцем к рукояткой грудины. Старайтесь избегать резки крупных кровеносных сосудов (особенно подключичной вены). Лучшая видимость достигается за счет осторожно приподнимая подготовки, держась мечевидного отростка щипцами.
- Сделайте поперечный разрез чуть ниже рукоятки грудиныи передать эксплантов в 10-см блюдо с охлаждением 5% CO 2/95% O 2-пропускали раствор Рингера. Поместите 10-см антенну на металлическую пластину, закрывающую 15-см ткань культуры блюдо со льдом. Все дальнейшие шаги следует сделать при вскрытии микроскопом.
- Используя маленькие ножницы весной удалить остатки вилочковой железы, плевры, диафрагмы (внутренней) и грудных мышц (за пределами; рис. 1б-D).
- Для установки эксплантов к 3,5-см тарелку, рассекают с себя все ребра, которые не вставляют к грудине. Это лучше всего сделать с помощью небольших ножниц весной и резки тканей между ребрами (рис. 1E).
- Pin трицепс грудины нервно-мышечного эксплантов в Sylgard покрытием 3,5-см ткань культуры блюдо minutien использованием штифтов (сокращено до <4 мм; Рисунок 1G). Два вывода должны пройти через хрящевую (белые) части грудины. Вставьте по крайней мере, два вывода через ребра как на левой и правой стороне йэлектронной эксплантов стремится к более мягкой хрящевой части и избегать ребра под или рядом с трицепс мышцы. Чем больше контактов используется, тем лучше (мы обычно используем 8-10). Как вы придавить подготовки, убедитесь, что ребра несколько распространился, фиксируя мышцы в чуть вытянутом положении.
- Дополнительно: визуализировать синаптическую сайтов, содержащих рецепторы ацетилхолина, добавив bungarotoxin связан с Alexa красителей (концентрации 0,8 мкг / мл в 5% CO 2/95% O 2-пропускали раствор Рингера). Инкубируйте возлагали эксплантов в Sylgard покрытием блюдо в течение 15-20 мин при комнатной температуре, затем промыть несколько раз с 5% CO 2/95% O 2-пропускали раствор Рингера.
2. Отбеливание ПК и дополнительно замедленной микроскопии (рис. 2)
Сроки: 30 - 45 мин + дополнительно 1 - 5 ч в течение промежутка времени.
- Передача 3,5-см Sylgard покрытием блюдо конфокальной микроскопии оборудованы остроумиеч аргонового лазера (488 нм) и погружение в воду цели (4x, 0,13 NA; 20x, 0,5 НС и 100x, 1,0 НС или 60x, 0,9 NA).
- Дополнительно для покадровой микроскопии: Insert 3,5-см Sylgard покрытием блюдо в кольце отопления, установка системы superfusion и датчик температуры (рис. 2A). Убедитесь, что ни один из них касаются эксплантов, край тарелки или покрытия Sylgard. Нагрева образца до 33-35 ° C. Для SC отбеливания без покадровой, комнатной температуры лучше, как клетки показать меньше динамики между отбеливания шаги.
- С целью 4x воздуха наблюдается иннервации картина трицепс мышцы грудины и найти трицепс концевой пластинки грудины группы. Переключить на 20x погружения конуса цель и начать искать поверхностные регионов в концевой пластинки группы (ребра областей вышележащих являются хорошими кандидатами). Изменение целью 100x 60x или погружением конуса целью проверки на отдельных NMJs. Идеально является NMJ, которая покрыта несколькими ПК и расположен очень superficially (рис. 2В). Если вы выполняете покадровой визуализации после отбеливания, выбрать до 3 NMJs, которые относительно близко друг к другу для повышения урожайности.
- Приобретать конфокальной изображения NMJ перед фото-отбеливание отдельных СЭ (рис. 2В). (Для полного изображения разрешение, например, на Olympus FV1000 микроскопом, использовать 100x, 1,0 NA цель и 2,5 масштаба, в результате чего Найквиста ограниченной выборки ~ 0,1 мкм на пиксель).
- «Парк» 488 нм лазерный луч по центру ядра SC использованием максимальной мощности в течение 5 секунд (по выбору эффективной структуры сканирования в небольшой области интереса могут быть использованы, например, "Торнадо сканирования" функции на микроскопе Olympus; как мы используем в конфокальный микроскоп, лазер фокусируется в образ-сопряженных плоскостей и, следовательно, при 488 нм с целью 1,0 Н.А., <0,5 мкм в диаметре). Повторно сосредоточиться на клетку и судья отбеливания результат. При необходимости повторите шаг отбеливания снова, пока GFP уровни сниженияг почти до фонового уровня. Получить изображение после отбеливания (рис. 2С). Очень важно, чтобы убедиться, что беленой регион находится за пределами какого-либо дублирования между двумя ячейками - если есть перекрытие, отбеливание во второй ячейке будет очевидным.
- Повторите шаг выше, пока все, кроме одного SC отбеливаются (рис. 2D-E). Последний "небеленой" SC подходит для конфокальной покадровой микроскопии. Реконструкция одной клетки путем вычитания изображений, например, с помощью Photoshop программного обеспечения, чтобы очертить одним морфологии SC и территории (рис. 2F). Помните, что вычитания двух магов добавляет шум (например, путем их импорта в последовательных "слои" в Photoshop, а затем установив верхний канал "разница" в выпадающем меню в верхней части вкладки каналов). Это можно обойти, используя "Удаление пятен" функции на каналах перед вычитанием и обрезки от любой фон, который, очевидно, не происходят избеленой клетки. Для оптимизации Напротив, это может быть необходимо отрегулировать яркость двух каналов в "уровнях" окна. В результате изображение беленой ячейки накладывается на исходное изображение синапса, псевдо-окрашен в уникальный цвет и сделать более прозрачными, чтобы покрасить на территории беленой ячейки в исходное изображение (от делаю это для всех беленой и последний , небеленой клеток изображение, показанное на рис результаты 2F).
- Дополнительно: Начало конфокальной покадровой микроскопии после отбеливания все, кроме одного КА. Возьмите изображений через определенные промежутки времени (например, каждые 5 до 10 минут). Использование в качестве мало энергии лазерного насколько это возможно. До 3 NMJs может быть отображена на той же сессии.
- Сделать карту временем истек NMJs, взяв изображение в 100 раз без зума, то образы регионе с помощью 20x и 4x целей (рис. 2G-I). Эта «карта» необходимо найти NMJs после иммуногистохимии фиксированной мышцы.
- Для изображенияобработки, преобразования отдельных изображений в максимальной интенсивностью прогнозы и сохранить в формате TIFF. Смешайте все Z-прогнозируемых временных точках в стек и привести в ху, например, с помощью "stackreg" плагин 10 в Фиджи (пакет на основе открытого программного обеспечения ImageJ; Национальные Институты Здоровья).
3. Фиксация и иммуногистохимии (рис. 3)
Сроки: Ночь в отеле.
- Передача эксплантов в 50-мл реакционную трубку содержащий по меньшей мере 15 мл 4% PFA тщательно удаляя булавки. Сообщение, исправить передней грудной стенки содержащие трицепс мышцы грудины в течение 1 часа на льду. Промыть фиксированной ткани с 0,1 М глицина в PBS (чтобы утолить остаточной фиксатор и, следовательно, уменьшить фоновый), по крайней мере, 10 мин. Образцы могут храниться в этой точке и последующей обработки.
- Передача фиксированной эксплантов на 10-см Sylgard покрытием блюдо культуры ткани заполнены 0,01 М PBS. Вырежьте форму трапеции с одной сиде параллельно грудины и другой через кости с хрящом переходов - содержит трицепс мышцы на его поверхности. Удалите нижние ребра с горизонтальной (т.е. транс-грудины), разрезанный так, что хвостовой конец трицепс мышцы могут быть свободно доступны (рис. 3А-D).
- Вставьте иглу для подкожных инъекций, как штифт в верхнюю часть трапеции (Рис. 3E). С помощью иглы для подкожных инъекций прикреплены к 1 мл шприц и щипцы для удаления трицепс мышцы на поверхность, аккуратно держа на хвостовом углу мышц и с помощью иглы микро-скальпель. Убедитесь в том, что сокращения производятся параллельно плоскости грудной стенки. После хвостовой части мышцы освобожден, вставить другую иглу для подкожных инъекций, как контактный под мышцу через грудной стенки - это удерживает подготовки и позволяет оказывать нежно тянуть на мышцы с помощью пинцета (рис. 3F). Как вы резки соединительной Tissие вставки, "корка" от мышцы грудной клетки. Вырезать последних хвостовых вложения с весны ножницы. Удалите жир и остатки кровеносных сосудов с помощью пинцета. Будьте осторожны, чтобы не сорвать от нервов. Примечание: Используйте отдельные наборы инструментов и посуды для работы с живыми и фиксированной ткани.
- Начало иммуногистохимии (с использованием стандартного протокола) путем перечисления образцов тканей в блокирующем растворе в течение 1 ч на качалке при комнатной температуре. Наименьший возможный объем для окрашивания 200 мкл использованием 96-луночный планшет.
- Применить первичных антител разводят в блокирующем растворе, 200 мкл на лунку, в течение ночи при 4 ° С на качалке.
- Стирать в 0,01 М PBS три раза в течение 10 мин.
- Нанесите подходящий вторичными антителами в течение 1-2 часов при комнатной температуре разводят в блокировании решения.
- Стирать в 0,01 М PBS три раза в течение 10 мин.
- Установите в борьбе с замирание среды (например Vectashield) и покровное.
- Место слайдов на магнитной металлической пластины, место магнит на вершинеобразца для выравнивания в течение нескольких часов или в течение ночи при 4 ° C. Печать с лаком для ногтей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Пример трицепс эксплантов грудины готовы для работы с изображениями блюдо показано на рисунке 1G. Это эксплантов особенно подходит для визуализации естественных NMJs бывших, как трицепс мышцы состоит только из нескольких слоев мышечных волокон. Это позволяет получать изображения с высоким разрешением из эксплантов, полученные из трансгенных линий мышей, которые подчеркивают Ваш SCs (ПЛП-GFP 2) и / или аксонов (Thy1-XFP 1). Критические факторы выс...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
SC метод отбеливания, представленные здесь, простой, быстрый и универсальный: (I) Оно позволяет выявить одну SC морфологии и динамики с помощью конфокальной микроскопии на основе одного трансгенного - что является существенным преимуществом при объединении подход, например, с болезнью модели, которые требуют дополнительных аллелей . (II) метод является быстрым, как от рассечения к фиксации она может быть выполнена в половину дня. (III) количество приложений широк, как это можно сочетать с другими методами, таки...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Manuela Будак, Лилиана Marinkovi и Кристина Wullimann за отличную техническую помощь. Мы благодарим В. Маклин для обеспечения Plp-GFP мышей. TM при поддержке Института перспективных исследований (Technische Universität München), Немецкого Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), в Александро-фон-Humboldt-фондом и Национальным агентством по финансированию («Bundesministerium für Bildung унд Forschung" ) в рамках ERA-Net Нейрон "iPSoALS" и "2-фотонных изображений". TM MB и поддерживается Центром Integrated Science белка (Мюнхен). PM при поддержке Высшей школы Technische Universität München (TUM-GS).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания (пример) | Номер в каталоге | Комментарии (по желанию) |
| 70% (объем / объем) раствор этанола | Рот | T913.1 | В распылитель |
| изофлуран | Forene, Abbott | любых других утвержденных анестетика может быть использован для смертельного анестезии | |
| трансгенных мышей (PLP-GFP) | которые будут получены от источников цитируется | ||
| рассечение микроскопом с холодным светом освещения | Olympus SZ51 | оснащен Schott KL 1500 LCD | |
| Щипцы #2 | Средства изобразительных наук | 11233-20 | |
| Щипцы № 5 | Средства изобразительных наук | 11295-00 | |
| ножницы, крупные медицинские | Средства изобразительных наук | 14108-09 | |
| ножницы, небольшие угловые весны | Средства изобразительных наук | 15033-09 | |
| в линию нагреватель | Warner Instruments | SF-28 | |
| нагревания кольца для 3,5-см блюд | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| двухканальная система контроля температуры | Warner Instruments | TC-344B | |
| Система superfusion насоса | изготовленный на заказ | ||
| 15-см ткань культуры блюдо | Sarstedt | 83.1803.003 | со льдом и покрыта металлической пластиной |
| 10-см ткань культуры блюдо | Sarstedt | 83.1802.003 | Решение с кислородом Рингер |
| 3,5-см ткань культуры блюдо | Sarstedt | 83.1800.003 | заполнена Sylgard полимеров |
| Sylgard полимеров | Dow Corning | Sylgard 184 Силиконовый эластомер Kit | |
| конфокальной микроскопии | Олимп | FV1000 | с аргоновым лазером |
| 50-мл реакционную трубку | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA в PBS | Сигма | P6148 | |
| канюли 0,5 мм х 25 мм | НЕОЛАБ | E-1510 | |
| Шприц 1 мл | НЕОЛАБ | E-1496 | |
| синаптофизин антител | Invitrogen | 18-0130 | кролик |
| вторичными антителами | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-луночный планшет | Sarstedt | 83,1836 | |
| 0,01 М PBS | Сигма | P4417 | |
| 0,1 М глицина в PBS | Рот | 3790,1 | |
| покровные | НЕОЛАБ | E-4132 | |
| слайдах | НЕОЛАБ | E-4121 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| minutien контактов × 10 | Средства изобразительных наук | 26002-20 | сокращено до <4 мм |
| α-Bungarotoxin связан с Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Блокирование решений | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0,2% Triton-X100 | Рот | 3051,3 | |
| 10% нормальной козьей сывороткой | Abcam | ab7481 | |
| 1% бычьего сывороточного альбумина | Сигма | A7030 | |
| Звонарь барботируют с 95% O 2/5% CO 2 | |||
| 125 мМ NaCl | Сигма | S7653 | |
| 2,5 мМ KCl | Сигма | P9333 | |
| 1,25 мМ NaH 2 PO 4 | Сигма | S8282 | |
| 26 мм NaHCO 3 | Сигма | S6297 | |
| 2 мМ CaCl 2 | Сигма | 21114 | |
| 1 мМ MgCl 2 | Сигма | 63020 | |
| 20 мМ глюкозы | Сигма | G7528 | |
Таблица 1. Специфических реагентов и оборудования. |
Ссылки
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
