Замораживание клеток человека ES

Краткое содержание

Здесь показано, как в нашей лаборатории замерзает оттенки человеческих линий стволовых эмбриональных клеток.

Аннотация

Здесь показано, как в нашей лаборатории замерзает оттенки человеческих линий стволовых эмбриональных клеток. Здоровый, экспоненциально расширяется культуры промывают PBS для удаления остатков средств массовой информации, которые могли бы утолить Трипсин реакции. Утепленные 0,05% трипсина-EDTA затем добавляется для покрытия клетки, и пластины инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. За это время клетки можно наблюдать округления, и колонии отрывая поверхности пластины. Нежный повторяется пипетирования удалит клеток и колоний от поверхности пластины. Трипсином клетки помещаются в стандартные коническую трубку с подогретого СМИ ЭСК ячейки погасить оставшиеся трипсина, а затем нити. Клетки ресуспендировали питательной среды в концентрации примерно один миллион клеток в одном мл среды, концентрации, что один замороженный аликвоту достаточно возродить культуру на 10 см тарелку. После клетки адекватно ресуспендировали, ледяной СМИ замораживания добавляют в равном объеме. Сотовые суспензии тщательно перемешать, аликвоты в замораживании флаконы, и позволили, чтобы медленно заморозить до-80С в течение 24 часов. Замороженные клетки могут затем переехал в паровой фазе жидкого азота для длительного хранения, или остаться при -80 в течение примерно шести месяцев.

Протокол

1. Здоровый, экспоненциально расширяется культуры промывают PBS для удаления остатков средств массовой информации, которые могли бы утолить Трипсин реакции.
2. Утепленные 0,05% трипсина-EDTA затем добавляется для покрытия клетки, и пластины инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. За это время клетки можно наблюдать округления, и колонии отрывая поверхности пластины.
3. Нежный повторяется пипетирования удалит клеток и колоний от поверхности пластины.
4. Трипсином клетки помещаются в стандартные коническую трубку с подогретого СМИ ЭСК ячейки погасить оставшиеся трипсина, а затем нити.
5. Клетки ресуспендировали питательной среды в концентрации примерно один миллион клеток в одном мл среды.
6. После клетки адекватно ресуспендировали, ледяной СМИ Замораживание добавляют в равном объеме.
7. Сотовые суспензии тщательно перемешать, аликвоты в замораживании флаконы, и позволили, чтобы медленно заморозить до-80С в течение 24 часов.
8. Замороженные клетки могут затем переехал в паровой фазе жидкого азота для длительного хранения, или остаться при -80 в течение примерно шести месяцев.

Примечание: такие замороженные аликвоты в концентрации 106 клеток / мл достаточно, чтобы возродить культуру на 10 см тарелку.

Обсуждение

Техника мы описываем для замораживания ячейки оттенков линий хорошо работает для эффективного хранения и воскрешения оттенков клеточных линий, а также любые клетка млекопитающего интересов. Замораживание небольшая часть клеток при каждом прохождении является важным фактором при работе с линии ЭСК клетки, как нарушения кариотипа могут возникнуть и аномальных клеток может быстро взять на линии. Таким образом, заморозив расщепляется в каждый отрывок, в дополнение к крупным банкам на некоторые места в высшей степени желательно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Среда HuES	среда			Для получения общего объема 651.5 mL добавить: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA + 0.6 µL бета-меркапто–этанола (стоковый раствор 14.3 M) + 65 mL заменителя сыворотки (Serum Replacement) + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (конечная концентрация ~10 ng/mL)
Среда для замораживания	среда			80% FCS (фетальная телячья сыворотка) + 20% DMSO (диметилсульфоксид). Хранить при 4 °C.