Замораживание клеток человека ES

Summary

Здесь показано, как в нашей лаборатории замерзает оттенки человеческих линий стволовых эмбриональных клеток.

Abstract

Здесь показано, как в нашей лаборатории замерзает оттенки человеческих линий стволовых эмбриональных клеток. Здоровый, экспоненциально расширяется культуры промывают PBS для удаления остатков средств массовой информации, которые могли бы утолить Трипсин реакции. Утепленные 0,05% трипсина-EDTA затем добавляется для покрытия клетки, и пластины инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. За это время клетки можно наблюдать округления, и колонии отрывая поверхности пластины. Нежный повторяется пипетирования удалит клеток и колоний от поверхности пластины. Трипсином клетки помещаются в стандартные коническую трубку с подогретого СМИ ЭСК ячейки погасить оставшиеся трипсина, а затем нити. Клетки ресуспендировали питательной среды в концентрации примерно один миллион клеток в одном мл среды, концентрации, что один замороженный аликвоту достаточно возродить культуру на 10 см тарелку. После клетки адекватно ресуспендировали, ледяной СМИ замораживания добавляют в равном объеме. Сотовые суспензии тщательно перемешать, аликвоты в замораживании флаконы, и позволили, чтобы медленно заморозить до-80С в течение 24 часов. Замороженные клетки могут затем переехал в паровой фазе жидкого азота для длительного хранения, или остаться при -80 в течение примерно шести месяцев.

Protocol

1. Здоровый, экспоненциально расширяется культуры промывают PBS для удаления остатков средств массовой информации, которые могли бы утолить Трипсин реакции.
2. Утепленные 0,05% трипсина-EDTA затем добавляется для покрытия клетки, и пластины инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. За это время клетки можно наблюдать округления, и колонии отрывая поверхности пластины.
3. Нежный повторяется пипетирования удалит клеток и колоний от поверхности пластины.
4. Трипсином клетки помещаются в стандартные коническую трубку с подогретого СМИ ЭСК ячейки погасить оставшиеся трипсина, а затем нити.
5. Клетки ресуспендировали питательной среды в концентрации примерно один миллион клеток в одном мл среды.
6. После клетки адекватно ресуспендировали, ледяной СМИ Замораживание добавляют в равном объеме.
7. Сотовые суспензии тщательно перемешать, аликвоты в замораживании флаконы, и позволили, чтобы медленно заморозить до-80С в течение 24 часов.
8. Замороженные клетки могут затем переехал в паровой фазе жидкого азота для длительного хранения, или остаться при -80 в течение примерно шести месяцев.

Примечание: такие замороженные аликвоты в концентрации 106 клеток / мл достаточно, чтобы возродить культуру на 10 см тарелку.

Discussion

Техника мы описываем для замораживания ячейки оттенков линий хорошо работает для эффективного хранения и воскрешения оттенков клеточных линий, а также любые клетка млекопитающего интересов. Замораживание небольшая часть клеток при каждом прохождении является важным фактором при работе с линии ЭСК клетки, как нарушения кариотипа могут возникнуть и аномальных клеток может быстро взять на линии. Таким образом, заморозив расщепляется в каждый отрывок, в дополнение к крупным банкам на некоторые места в высшей степени желательно.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium Всего			651,5 мл добавьте: 500 мл Ko-DMEM + 6,5 мл PenStrep + 6,5 мл L-Glut + 6,5 мл NEAA 6,5 мл + бета-меркапт– танол 0,6 & микро; L (14,3 М бульон) + 65 мл заменителя сыворотки + 65 мл плазманата + 0,65 мл bFGF2 (~10 нг/мл в финале)
			для замораживания	80% FCS (сыворотка плода телят) + 20% ДМСО (диметилсульфоксид). Хранится при температуре 4°С.