Изометрические и эксцентричный оценке формирования сил скелетных мышц, изолированных от мышиной модели мышечной дистрофии

Краткое содержание

Измерения функции мышц вклад в оценку потенциальных терапевтических средств для лечения патологии мышц, а также для определения механизмов, лежащих в основе физиологии этой ткани. Мы продемонстрируем подготовки разгибателя пальцев и мышцы диафрагмы для функционального тестирования. Протоколы для изометрических и эксцентричных сокращений будет показан, а также различия в результатах между дистрофические мышцы, представляющие патологическое состояние, и дикого типа мышц.

Аннотация

Важнейшее значение для оценки потенциальных терапевтических средств для лечения мышечных болезней, чувствительных и воспроизводимых физиологической оценки мышечной функции. Потому что многие доклинические испытания полагаться на мышиных моделях для этих заболеваний, изолированных функции мышц стала одним из стандартов для Go / NOGO решения в продвижении лекарств-кандидатов вперед в пациентах. Мы продемонстрируем подготовки разгибателя пальцев (EDL) и диафрагмы мышцы для функционального тестирования, которые являются преобладающими мышцы используются для этих исследований. EDL геометрии мышц идеально подходит для изолированных препаратов мышц, с двумя легко доступны сухожилий и небольших размеров, которые могут быть поддержаны superfusion в ванне. Мембрана обладает глубоким прогрессивным патологии дистрофические животных, и может служить в качестве платформы для оценки многих потенциальных терапии фиброза противодействия и содействия мышечных волокон стабильности. Протоколы для рутинного тестирования, в том числе изометрические и eccenэлектрических сокращений, будет показано. Изометрическая сила обеспечивает оценку прочности, и эксцентричных сокращений помочь оценить сарколеммы стабильности, которая нарушается при многих типах мышечной дистрофии. Сравнение ожидаемых результатов между мышцами от дикого типа и дистрофических мышц также будет предоставлена. Эти меры могут дополнять морфологические и биохимические показатели тканевого гомеостаза, а также целый оценки животных мышечной функции.

Введение

Измерения функции мышц вклад в оценку потенциальных методов лечения мышечной патологии, а также определение механизмов, лежащих в основе физиологии этой ткани. Для мышечных заболеваний, использование мыши модели стали центральным элементом для понимания связей между генотипом и фенотипом, так и для расширения этих знаний в процессе разработки и тестирования потенциальных лекарственных препаратов. Мышечной дистрофии, в частности, опирались на мышах, чтобы оценить эти агентов и установления доклинические данные, необходимые для продвижения вперед в исследованиях у пациентов. Частые мера результата использует изолированные функции мышц, чтобы определить силу, которая применима к широкому кругу исследований. Еще одной мерой является использование эксцентричных или удлинение, сокращение для определения изменений в мышцах целостность мембраны, которая является дефицит мышечной дистрофии Дюшенна, и модель мыши для этого заболевания (MDX). Таким образом, важно, чтобы эти типы Измерительнродители, чтобы быть чувствительным и воспроизводимым.

Мышь пальцев мышцы (EDL) мышц широко используется для изолированной функции мышц благодаря своей идеальной геометрии и размеров, в том числе однородной ориентации волокон и сухожилий окончательные ^{2, 5, 6, 10, 12.} Методы EDL мышцы изометрическое функциональных измерений были описаны в предыдущей публикации Юпитера ^8, а также в Treat-NMD SOP ^1. Мы расширили описание этих методов включают в себя как изометрических и эксцентричных сокращений. Признаки болезни проявляются в EDL, в том числе heighted циклы дегенерации / регенерации и снижение выхода силы.

Мышь диафрагма обладает самым быстрым прогрессированием патологического мышечной дистрофии по сравнению с другими мышц у мышей ^11. По 6-месячного возраста, совокупный фиброза составляет около 50% мышц. Это приводит к значительной impaireD выходной силы ^11. Таким образом, терапевтические агенты, которые могут предотвратить проникновение фиброзных может быть оценена эффективность в диафрагме.

Потеря дистрофина в мышцах приводит к повышенной ломкости и повышенной сократительной ущерб во всех мышцах ^9. Поэтому много методов лечения мышечной дистрофии Дюшенна направлены на замену дистрофина. Таким образом, анализ, что стало необходимым для оценки этих стратегий является эксцентричный сокращения, которые могут различить нормальное и дистрофически мышц, а также определить, какие выгоды конкретной стратегии для защиты дистрофические мышцы от повреждения сократительной ^{2, 3, 4, 12.} Эта процедура требует либо двухрежимный сервопривода, которые могут модулировать / длина записи и силы, или способ регулирования длины быстрее отдельно от датчик силы.

Протокол

Все процедуры были рассмотрены и одобрены Университета Пенсильвании IACUC.

1. EDL Вскрытие и подготовка (около 30 мин)

1. Anesthetize мышей, чтобы убедиться, что они не испытывают боли или страдания во время процедуры, но мышцы остаются и кислородом в обращении. Мы регулярно использовать кетамин / ксилазина коктейль (100/10 мг / кг) вводили через IP. Хирургическое плоскости анестезии определяется полное отсутствие педали или palpedral рефлексы выходе или отсутствие уха ответ дергаться.
2. Зафиксировать задние конечности с помощью медицинских ленту, и снимайте кожу нижних передних задних конечностей подвергать мышцы этой области. Держите мышцы влажные с применением PBS на регулярной основе.
3. В рассекает сферу, сделать небольшой разрез сбоку от колена для того, чтобы подвергать проксимального сухожилия EDL мышцы. Есть два сухожилия в этой области, и оба должны быть сокращены чтобы повторноСнятие из EDL.
4. На медиальной лодыжки, вырезать сухожилия мышц TA, чтобы разоблачить дистального сухожилия EDL, которые проходят вдоль мета tarsals. Поднимите TA мышцы в сторону, соблюдая осторожность, чтобы не порезать и не прикасайтесь к EDL под ним. Вернуться в дистальных сухожилия EDL, СНиП каждого из них и сделать их через лодыжки, затем схватив сухожилий, осторожно потяните EDL от остальной части конечности. Следует освободить от проксимального конца свободно, но если нет, вернитесь к боковым разрезом для того, чтобы сократить сухожилия. Снимите мышц и место в рассекает блюдо заполнено охлажденной кислородом Ringers. Pin мышцы через сухожилия примерно в покое длину, что длина найдены в естественных условиях. Длина слишком коротка, когда мышцы вялые в блюдо, и слишком долго, если мышца тянет на рассекающих контакты.
5. Усыпить мыши сразу же после удаления мышц путем смещения шейных позвонков.
6. Свяжите нити на десятьдонов, как можно ближе к мышце, но не касаясь мышц. Pin мышцы примерно в покое длине с помощью швов.

2. Вскрытие и подготовка мембраны (около 30 мин)

1. Усыпить мышей до этой процедуры путем смещения шейных позвонков под наркозом, если же мышь подвергается как вскрытий, или CO _{2 с последующим} подтверждением со смещением шейки матки.
2. Сделайте надрез в коже, чтобы разоблачить брюшной и грудной полости. Открытие брюшной полости, а также сокращение стенки тела чуть ниже ребер. Использование костного ножницы, и, начиная выше диафрагмы вставки, обвести весь грудной клетки следуя по ребрам, прорезать и позвоночника. Вырезать кровеносных сосудов, проходящей через центр диафрагмы, так что мембрана может быть легко удалена.
3. Снимите мембрану от мыши, и место в рассекает блюдо заполнены кислородом Ringers. Аккуратно перемешивать ДиПДhragm в блюдо, чтобы смыть кровь. Обновить Ringers решения по мере необходимости.
4. Отрежьте небольшую полоску мембраны от центрального сухожилия к ребрам вдоль ориентации волокон в центральной части бокового hemidiaphragms. Полоса должна быть в пределах 2-4 мм шириной. Использование костного ножницы, разрезать ребра по обе стороны от полосы, оставляя примерно 1-2 мм свес ребра с обеих сторон диафрагмы полосы.
5. Свяжите нити в центральной сухожилия. Галстук шов для каждого из боков выступающие концы ребра, а затем связать их вместе, чтобы сделать большую петлю.
6. Две полоски могут быть получены из любого диафрагмы (по одному от каждой стороны).

3. Монтаж мышцы в Бат механика

1. Возьмитесь за швами и использовать их для крепления мышц к жесткой сообщение на одном конце, и датчик силы на другом конце.
2. Отрегулируйте длину чтобы убедиться, что мышцы не провисает, но не туго. Хорошее приближение отдыха MUSCле длины в 1,4 - 1,5.
3. Ванна должна быть наполнена кислородом раствор Рингера поддерживается на уровне 22 ° C, чтобы продлить мышцы стабильности для тестирования. Мышцы должны отдыхать в течение 5 минут в этой ванне до функционального тестирования, так что мышцы температура находится в равновесии до 22 ° C.

4. Изометрических сокращений

1. Создание сверхмаксимальных условия стимуляции. После того, как мышцы помещается в ванну, использовать разовая 0,5 мс импульсов стимуляции, чтобы создать дергаться и контролировать силу выхода. Постепенно увеличивайте ток, пока сила достигает максимума, но стабильном уровне. Увеличение тока на 10% больше, чем этот уровень для остальных экспериментах.
2. Создание оптимальной длины. Использование изометрического раздражения дергаться, отрегулируйте длину мышцы постепенно до максимальной силы получается. Отдых мышцы ~ 10 сек между каждым сокращением. Оптимальная длина мышцы (L _о) достигается, когда дергаться сила максимальна. Запись мышцы длиной (длиной бытьмежду myotendinous узлы для EDL, а также между центральными сухожилия myotendinous соединения и мышцы вставки на ребро) с помощью штангенциркуля.
3. Максимальная Изометрические тетаническое сил. Стимулировать мышцы установлен на уровне L _O в течение 500 мс, с серией импульсов 0,5 мс при сверхмаксимальных стимуляции и при плавке частота (от плато частоты силы отношениях (например, Ref:. ⁸⁾ плато EDL мышцы обычно достигается с 120 Гц, а также для мышц диафрагмы с 100 Гц. Стимулировать 3 раза в соответствующих частот с периодами отдыха 5 мин между стимуляцией бои за каждую мышцу.

5. Эксцентричный сокращений

1. Разрешить мышц, чтобы отдохнуть 5 минут между выполнении изометрических и эксцентричных сокращений.
2. Стимулировать мышц при 80 Гц изометрически за первые 500 мс, а затем 10% L _O участке в финале 200 стимуляция мс (с натяжкой размере 0,5 L _O/ Сек).
3. Повторите схему стимуляции с 5 мин отдых между нужного количества эксцентричных сокращений.
4. Измерьте силу для каждого сокращения в период времени до растяжки. Рассчитать падение силы между первым и последним сокращением.

6. Мышцы удаления из аппарата

1. Сократите мышцы длины, чтобы обеспечить щадящее удаление мышцы от датчика и отправлять и вернуть его в рассекает блюдо с пальцами.
2. Удалите швы от мышц.
3. Для EDL мышцы, промокните мышц дважды, а затем взвесить его, прежде чем последующей обработки (например, заморозка, крепления и т.д.). Это будет важно для расчета площади поперечного сечения, а также конкретные силы.
4. Для мышцы диафрагмы, замочить в 0,1% procion оранжевый, краситель мембраны impermeant в течение 15-20 мин. Это позволит индексу рассечение повреждения.
5. Рассекать мышцу от костные вставки, а также процентовRAL сухожилия. Это необходимо, чтобы обеспечить точную массу мышц. Пятно как выше, до взвешивания и последующей подготовки.
6. Вычислить площадь поперечного сечения (CSA):
   CSA (мм ²⁾ = масса (мг) / [(L _Ø мм) * (L / L _о) * (1,06 мг / мм ^3)],
   где L / L _O является волокна мышц Соотношение длины (0,45 для EDL, 1,0 для диафрагмы) ⁵ и 1,06-плотность мышц.

Результаты

Ожидаемые значения для изометрической силы мышц EDL из 12 недельных животных показано на рисунке 1. Потому что MDX мышцы обладают компенсаторной гипертрофии, всего тетаническое сила может быть выше в MDX мышц по сравнению с контрольной группой возраста дикого типа. Тем не менее, более подходящую меру функциональный выход удельная сила (рис. 2), где сила нормирован для площади поперечного сечения для вычисления этого значения. Удельная сила зависит от присущих функциональной способности мышц, где слабость в мышцах дистрофических более очевидным, когда обе абсолютные силы и площади поперечного сечения учитывается. В наших руках, EDL мышцы MDX мышей производят примерно 20 - 25% ниже, конкретные силы, чем у соответствующей возрастной мышей дикого типа от 10 - 26 недель.

Для диафрагмы, только определенные силы имеет важное значение для сравнения, потому что подготовка является частью мышц зависит от Диссеие. Сравнение удельной силы между дикого типа и мышц диафрагмы MDX отражает прогрессивные патологии в этой ткани. Изометрические выход силы уменьшается с возрастом (рис. 3), так что к 6-месячного возраста, диафрагмы мышцы мышей MDX производить не более половины функционального выходе диафрагмы полос в возрасте от группы контроля дикого типа.

Например эксцентричных сокращений диафрагмы от тестирования показано на рисунке 4. С каждым последующим эксцентричного сжатия, сила выхода уменьшается в диафрагме полосами с обеих дикого типа (C57) и MDX мышей. Тем не менее, потеря силы более драматичным в мышцах образцов от мыши MDX, предположительно, от отсутствия дистрофина и связанных с ней белков.

Рисунок 1. Изометрические тетаническое силы в дикого типа и MDX EDL мышцы F ПЗУ 12 недельных мышах. Абсолютная сила может быть выше соответствующего возраста MDX мышцы EDL в связи с компенсаторной гипертрофии.

Рисунок 2. Изометрические тетаническое силы нормированы мышцы площадь поперечного сечения является удельная сила, и показывает депрессию функциональной способности EDL мышцы MDX мышей по сравнению с мышами дикого типа из. Следы от того же мышей, как на рисунке 1.

Рисунок 3. Прогрессирующая потеря сил генерирующих мощностей оценивается удельная сила наиболее очевидно в диафрагме мышей MDX (красные столбики) по сравнению с дикого типа (C57 в синей линией).

36/50036fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Потеря силы в зависимости от эксцентричного количество сокращений диафрагмы для мышц с 12 недельных C57 и MDX мышей. Данные среднее ± SEM для N = 4 мышцы в генотипе.

Обсуждение

Цель этой статьи заключается в предоставлении рекомендаций для проведения изолированной функции мышц на две мышцы у мышей - EDL и диафрагмы. Оценка этих мышц может дать представление или нет терапевтический кандидатов в мышечных заболеваний являются полезными. Для обеих мышц, основным фактором в получении надежных данных является чистым рассечение. Таким образом, практика и совершенствование начальном этапе изоляция необходима, прежде чем перейти на функциональное тестирование. Кроме того, установление функциональных тестов для нормальных мышц имеет решающее значение до принятия сравнение с дистрофические мышцы, или между процедурами. Это будет гарантировать, что результаты исследования не подлежат высокая изменчивость передается по способности человека проведении экспериментов. Использование красителя impermeant мембрана может помочь в оптимизации вскрытия подготовки, для инкубации любых мышц в растворе, содержащем такой краситель будет отмечать наиболее поврежденных волокон, и может служить индекс гissection успех. Сведение к минимуму количество волокон повреждения в мышцах поможет оптимизировать измерения. Волокна повреждены рассечение светиться гораздо ярче, чем те, повреждены эксцентричного сжатия, и поэтому, если краситель используется также в процессе механики, можно использовать интенсивность красителя различать два типа повреждений.

Рассечение диафрагмы полос почти всегда имеют повреждения волокон, просто потому, что за счет сокращения по длине волокна, некоторые неизбежно разрушаются. Красителя силен в этих поврежденных волокон, и это, как правило, ограничивается внешними краями подготовки. В среднем, мы наблюдаем полосу поврежденных волокон, что составляет ~ 3 волокон в ширину (~ 120 мкм) по обе стороны от полосы мышц. Если поврежденный группа состоит из более, чем 15% мышц, то данные отбрасываются. Диафрагмы подготовки также имеет ограничения на оптимальный размер для функциональных мер. Мы обнаружили, что куски Diaphragm, которые шире, чем на 5 мм начинают складываться на себя, потому что центральный галстук сухожилия только в одной точке. Это приводит к снижению удельной силы в подготовке. Мы также обнаружили, что узкие полоски также имеют более низкую удельную силу, которую мы верим в том, что количество волокна повреждены во время рассечения составляют большую долю от общего количества клетчатки. Например, если 0,1 мм с каждой стороны поврежден, то, что составляет 5% (2x0.1 мм / 4 мм полосы) мышц препарат, который не способствует силе, а если полоса составляет всего 1 мм, затем 20 % от мышечного препарата повреждены. Таким образом, как ширина поврежденной области, а также ширину всей подготовки являются важными факторами для контроля.

Измерения максимального изометрического напряжения требует, чтобы все мышечных волокон в мышцах стимулируется. Потому что есть огромные различия в компонентах функцию аппарата, это должны быть определены для каждого наборавверх. Например, размер ванны или тип стимулятора может повлиять на интенсивность стимуляции. Twitch стимуляции является разумным способом определить сверхмаксимальных условиях стимуляции. Как только это установлено для конкретной установки и мышцы, он может быть использован для последующих исследований.

В отличие от этого, оптимальная длина любой мышцы должны быть измерены для каждого препарата помощью итерационного процесса, описанного выше. Это гарантирует, что толстые и тонкие перекрытия нитей является оптимальным и максимально возможного генерирующих мощностей сила измеряется. Альтернативные процедуры могут рассчитывать на дифракционные картины, связанные с мышцей страт, но это требует дополнительных устройств, не описанных здесь.

Мы регулярно использовать 500 мс стимуляции длительности, которая попадает в середину диапазона этого параметра используются другими исследователями в этой области. Хотя это может вызвать некоторую усталость мышц при сжатии, что видноот «провисания» в максимальном производстве силы, это само по себе может быть информативным. Например, разница в усталости может быть достигнуто путем различных видов терапии, включая те, что обработка кальция мишени, следовательно, прогиб в силе во время активного сокращения может служить показателем для улучшения. Кроме того, потеря силы может означать, что швов на сухожилия не достаточно плотно, и что они скольжения при сжатии. Мышцы должны быть удалены из ванны и швы должны быть вновь связали если это произойдет. Мы также используем серии из 3 тетаническое сокращений, которая помогает оценить стабильность препарата. Опять же, шовный скользит приведет к потере силы между схватками, требующих шов повторного связывания. Большие мускулы могут также создавать бескислородных ядер, которые приводят к потерям силу в протоколе. Размер мышц является ограничивающим фактором для выполнения изолированного тестирования функции мышц, где EDL мышцы с массой более 20 мг утрачивают силу с каждым подрядчикомния, и не может быть поддержан superfusion в ванне. Мембранные полоски не страдают от тех же осложнений, потому что они достаточно тонкие, чтобы иметь длительные жизнеспособность в ванной.

Другие мышцы могут быть использованы для изолированной функции мышц, в том числе камбаловидной мышцы, которые обычно используются, но не описан здесь. Многие из тех же процедур могут быть приняты для камбаловидной в плане подготовки и функционального тестирования. Тем не менее, основные различия заключаются в стимуляции частоты и параметры для эксцентричных сокращений. Использование камбаловидной для функции дополняет, что из двух других мышц, и поэтому он должен рассматриваться как часть «стандартный пакет» для оценки дистрофических мышей ^{4, 7.}

Эксцентричный сокращение предоставляет индекса сократительной хрупкость, и важно использовать протокол, который приводит к потере скромные силы в мышцах от дикого типа животных и значительная потеря силы внеобработанной мышцы дистрофического так что есть широкий динамический диапазон для сравнения. Отсутствие силы потери в нормальных мышцах предполагает, что эксцентричный сокращений является слишком мягким, и не будет адекватно различать методы лечения, которые не являются эффективными, и те, которые действительно полезны. Тем не менее, драматические потери силы в нормальном мышцы подвергаются эксцентричный сокращения могут быть слишком велики, чтобы дразнить различия, связанные с болезнью. Наш протокол для EDL и диафрагмы используются на 0,5 Lo / сек участке скорость для получения 10% длины изменения. Мы обычно выполняют 5 эксцентричных сокращений, которые приводят к небольшой потере силы в нормальных мышцах и значительная потеря силы в дистрофических мышц. Конечно, все эти параметры могут быть изменены для повышения общего изменения длины, скорости растяжения, или количество эксцентричных сокращений, чтобы отличить различий между больными и здоровыми мышцы, а также о влиянии определенного типа мутации или тreatment один изучения. Пока существует заметная разница между нормальной и пораженной мышцы, то есть золотой стандарт, чтобы достигнуть в плане лечения.

В целом, этот протокол устанавливает руководящие принципы для выполнения изометрических и эксцентричных сокращений, и, надеюсь, определяет потенциальные ловушки, чтобы избежать при установке этой техники в Вашей лаборатории.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
в пробирке System Test мышц	Aurora Научные	1200A
Препаровальная лупа	Leica	MZ6
ACE источник света	Schott-Fostec	A20500
Анатомические ножницы	Средства изобразительных наук	14060-11
Угловой рассечение ножницами	Средства изобразительных наук	15006-09
Скальпель ручкой	Средства изобразительных наук	10003-12	альтернативный инструмент рассекает
Изогнутые лезвия скальпелей № 12	Изобразительное наукиИнструментарий	10012-00	альтернативный инструмент рассекает
Кость ножницы	Средства изобразительных наук	16044-10
S & T шва связывая щипцы	Средства изобразительных наук	00272-13
Дюмон SS щипцы - угловой	Средства изобразительных наук	11203-25
Плетеный размер шва шелком 6-0	Teleflex Медицинский	07-30-10
Медицинская лента	Transpore	3M
Кетамин гидрохлорид 100 мг / мл	Hospira	NDC 0409-2051-05	Final Доза 80 мг / кг
TranquiVed инъекций (ксилазина 100 мг / мл)	Vedco	NDC 50989-234-11	Final доза составляет 10 мг / кг
Реактивная Оранжевый 14	Sigma-Aldrich	R-8254
Ringers Компоненты решения			Решение является газ уравновешенную 95% O 2 и 5% CO 2, окончательное рН 7,4
Хлористый натрий	Sigma-Aldrich	S7653	Конечная концентрация: 118 мм
Хлористый калий	Fisher Scientific	P217-3	Конечная концентрация: 4,7 мМ
Дигидрата хлорида кальция	Fisher Scientific	C79-500	Конечная концентрация: 2,5 мм
Фосфат калия однозамещенный	Fisher Scientific	P-285	Конечная концентрация: 1,2 мм
Магния сульфат	JT Baker	2500-01	Конечная концентрация: 0,57 мм
4 - (2-гидроксиэтил) трубыrazine-1-этансульфокислота (HEPES)	Fisher Scientific	BP310-500	Конечная концентрация: 5,95 г / л
Глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270	Конечная концентрация: 5,5 мм