Методическая статья

Клиническое применение

19.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50070

⸱

1 февраля 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatrics, U.T. MD Anderson Cancer Center, 2Department of Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy, U.T. MD Anderson Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

T клетки, экспрессирующие CD19 конкретных химерный рецептор антигена (CAR) переплетаются в качестве исследуемого лечения В-клеточных злокачественных новообразований в нашей первой в человеческих испытаний генной терапии. Мы описываем генетической модификации Т-клеток помощью Спящая красавица (SB) системы внедрения CD19-конкретный автомобиль и селективного распространения на дизайнерские CD19 + искусственное антиген представляющих клеток.

Аннотация

Эффективность Т-клеток клинической степени может быть улучшена путем сочетания генной терапии с иммунотерапией для создания биологического продукта с потенциалом превосходного (i) распознавания опухолеассоциированных антигенов (TAA), (ii) персистенции после инфузии, (iii) потенциала миграции в опухолевые участки и (iv) способности рециркулировать эффекторные функции в опухолевом микроокружении. В большинстве подходов к генетическим манипуляциям с Т-клетками, разработанных для применения у человека, используются ретровирусы и лентивирусы для стабильной экспрессии CAR1-3. Этот подход, хотя и соответствует текущей надлежащей производственной практике (GMP), может быть дорогостоящим, поскольку он основан на производстве и выпуске рекомбинантного вируса клинического класса с ограниченного числа производственных предприятий. Электроперенос невирусных плазмид является привлекательной альтернативой трансдукции, поскольку виды ДНК могут быть получены до клинической степени примерно в 1/10от стоимости рекомбинантного вируса GMP-класса. Для повышения эффективности интеграции мы адаптировали транспозон и транспозазу Sleeping Beauty (SB) для применения человеком4-8. В нашей системе SB используются две ДНК-плазмиды, которые состоят из транспозона, кодирующего интересующий ген (например, CD19-специфичный трансген CAR2-го поколения, обозначенный CD19RCD28) и транспозазы (например, SB11), которая встраивает трансген в TA динуклеотидные повторы9-11. Для получения клинически достаточного количества генетически модифицированных Т-клеток мы используем искусственные антигенпрезентирующие клетки (aAPC), полученные из K562 (клон #4), модифицированные для экспрессии TAA (например, CD19), а также костимулирующие молекулы Т-клеток CD86, CD137L, мембраносвязанную версию интерлейкина (IL)-15 (пептид, слитый с модифицированной областью IgG4 Fc) и CD64 (рецептор Fc-γ 1) для загрузки моноклональных антител (mAb)12. В этом отчете мы демонстрируем процедуры, которые могут быть предприняты в соответствии с cGMP для получения CD19-специфичных CAR+ Т-клеток, пригодных для применения человеком. Это было достигнуто путем синхронного электропереноса двух ДНК-плазмид, SB-транспозона (CD19RCD28) и SB-транспозазы (SB11), с последующим извлечением стабильных интегрантов путем ежедневных 7-дневных добавлений (цикл стимуляции) γ-облученного aAPC (клон #4) в присутствии растворимых рекомбинантных человеческих IL-2 и IL-2113. Как правило, проводится 4 цикла (28 дней непрерывного культивирования) для получения клинически привлекательного количества Т-клеток, которые стабильно экспрессируют CAR. Эта методология для производства CD19-специфичных Т-клеток клинического уровня может быть применена к Т-клеткам, полученным из периферической крови (ПБ) или пуповинной крови (UCB). Кроме того, этот подход может быть использован для генерации Т-клеток для различных типов опухолей путем сопряжения специфичности введенного CAR с экспрессией TAA, распознаваемой CAR, на aAPC.

Протокол

День 0 или до

1. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) с РВ и UCB

  1. Развести PB с равным объемом и UCB с четырьмя объемами PBS-EDTA.
  2. Медленно слой разбавленной крови (25 мл) на Ficoll (12 мл) в 50 мл центрифужные пробирки (ы) и центрифуги при 400 х г в течение 30 - 40 мин (без тормозов).
  3. Сбор и передача мононуклеарных фракции клеток (интерфейс) с помощью пипетки передачи на свежую трубку центрифуги 50 мл.
  4. Вызовите объемом до 50 мл PBS-ЭДТА и центрифугируют при 450 х г в течение 10 мин.
  5. Аспирируйте супернатанта, мягко повторно приостановить осадок клеток (ы) в 50 мл полной среды культуры (СКК), а центрифуге при 400 х г в течение 10 мин.
  6. Аккуратно повторно приостанавливать и бассейн ячейки гранул в СКК и выполнить подсчет клеток с использованием трипанового синего методом исключения (Cellometer, PBMC программы).
  7. MNC теперь может быть использован для электропорации (Nucleofection) или криоконсервации для использования в будущем.
Название "> 2. Подготовка Т-клеток для электропорации в день 0

  1. При использовании криоконсервированных MNC, быстро таять достаточной клеток для электропорации полной шкалы (2 х 10 8 добавления ~ 20% к ответственности за потерю клеток при центрифугировании и 2 ч инкубации) в 37 ° С водяной бане. Если используется свежевыделенных МНК перейдите к шагу 2.3.
  2. Аккуратно повторно приостановить и передать клеткам соответствующего размера центрифужные пробирки (ы), содержащиеся подогретого Полное фенол-Free RPMI культуре средств массовой информации (PF-RPMI) и центрифуги при 200 мкг в течение 10 мин (без тормозов), супернатант.
  3. Повторное приостановить MNC в PF-RPMI, выполнить клеток (Cellometer) и передать клеток соответствующих размеров судна культуры клеток (ы) в концентрации 10 6 клеток / мл.
  4. Инкубируйте в увлажненном 37 ° C / 5% CO 2 инкубаторе в течение 2 ч ± 30 мин.
  5. Передача MNC в стерильную пробирку центрифуги (ы), спина при 200 мкг в течение 5 мин (без тормозов), аспирации супернатант и аккуратно гE-приостанавливать и объединить осадок клеток (ы) в PF-RPMI.
  6. Выполните клеток (Cellometer) и рассчитать объем клеточной суспензии требуется (2 х 10 8 MNC).
  7. Передача расчетного объема в стерильный 50 мл центрифужные пробирки и спина при 200 мкг в течение 10 мин (без тормозов).
  8. Аспирируйте супернатанта, так что никаких остаточных средств массовой информации остается и осторожно повторно приостановить, нажав стороне трубки.

3. Электропорации (Nucleofection) из MNC (полный процесс шкале Используя 10 Кюветы) на день 0

  1. Предварительная инкубация стерильных 12-луночный планшет с 10 скважин, содержащий 4 мл теплой PF-RPMI в увлажненном 37 ° C / 5% СО 2 инкубатора.
  2. Подготовка и предварительно теплой Решение Lonza Nucleofector человека Т-клеток комплект (восстановленные в соответствии с инструкцией завода-изготовителя, www.lonza.com ) до температуры окружающей среды в кабинет биобезопасности (BSC).
  3. Подготовка Nucleofector решения / смеси ДНК мастер-надстройкаг 100 мкл дополнен решением Nucleofector, 15 мкг транспозонов (суперспиральной ДНК плазмиды, обозначенной как CD19RCD28/pSBSO) и 5 ​​мкг транспозазы (суперспиральной ДНК плазмиды, обозначенной как pCMV-SB11) в реакции / кювете.
  4. Дисперсные осадок клеток (с шагом 2,8), слегка нажав сторону центрифужные пробирки и вновь приостановить Nucleofection решения / DNA Master Mix (Final концентрации клеток: 2 х 10 7 клеток/100 мкл).
  5. Тщательно передачи 100 мкл клеточной суспензии (с шагом 3,4) для каждого из десяти (10) кювет Lonza Nucleofection, соблюдая осторожность, чтобы избежать пузырей.
  6. Нажмите кювет один раз, и electroporate с помощью программы U-014 (для нестимулированных Т-клеток).
  7. Передача кювет и 12-луночный планшет (шаг 3,1) в BSC.
  8. Урожай электропорации клеток из каждой кювете использованием Amaxa штрафа пипетки передачи чаевые, добавив ~ 500 мкл предварительно нагретого культуральной среды от соответствующих хорошо (12-луночный планшет, подготовленный в Steстр. 3,1) и вернуть пластину к увлажненным 37 ° C / 5% CO 2 инкубаторе в течение 2 ч ± 30 мин.
  9. После 2-часовой инкубации, сбор и передачу клеток из всех скважин в стерильную пробирку центрифуги.
  10. Вымойте клеток путем центрифугирования при 140 мкг в течение 8 мин, температура окружающей среды, нет тормозов и аспирации и отбросить супернатант, чтобы не остатки среды охватывает осадок клеток.
  11. Дисперсные осадок клеток, осторожно нажав сторону центрифужные пробирки и осторожно повторно приостанавливать в СКК для достижения одной клеточной суспензии.
  12. Выполните клеток и регулировать концентрацию клеток до 10 6 клеток / мл в СКК.
  13. Передача клеточной суспензии в культуре клеток колбу (ы) и место в инкубаторе в течение ночи.
  14. Процесс шагах от 2,1 до 3,8 были повторены для управления: EGFP-трансфицированные клетки (5 х 10 6 клеток / кювету с 5 мкг Amaxa управления EGFP суперспирализованной плазмиды, pmaxGFP).

1-й день 1-й и последующиеСтимуляция Циклы

4. Анализ CAR выражений с помощью проточной цитометрии на 1 день

  1. Урожай электропорации клетки и осуществляют подсчет клеток с использованием трипанового синего метод исключения (гемоцитометр).
  2. Пятно клетки (1, 2 х 10 6) с антителами, специфичными для CD3, CD4, CD8, и человеческий IgG Fcγ (как измерение CAR выражение).
  3. Приобретать клеток на FACS Calibur и анализировать данные с помощью FCS Экспресс программное обеспечение для расчета выражения CAR.
    1. Рассчитать клетки CAR + в культуре по формуле:
      (Кол-во Всего жизнеспособных клеток) х (% CAR + клеток) = Кол-во CAR + клеток

5. Подготовка AAPC (клон № 4) на 1 день. AAPC (клон № 4) были получены из клеток К562 (Родительский линии, полученной от американских Type Culture Collection) для Co-экспресс Желаемые Т-клеток костимулирующих Molecule

  1. Оттепель аликвоты замороженным 100 Гр облучения AAPC в 37 °, С водяной бане.
  2. Клетки дважды промывают с помощью центрифугирования при 400 мкг, 10 мин в СКК и рассчитывали с использованием Cellometer (трипанового синего исключения).
  3. Рассчитайте количество жизнеспособных AAPC необходимых для стимуляции:
    (Кол-CAR + клеток) х 2 = Количество облученных AAPC требуется

6. AAPC-опосредованная стимуляция CAR + Т-клеток на 1 день начала 1-го и последующих циклов стимуляции

  1. Смешать электропорации клеток (выражение CAR) и γ-облученных AAPC (клон № 4) в стерильный контейнер в соотношении 1:2 (CAR + клеток: жизнеспособные AAPC) в СКК.
    1. Обратите внимание на соотношение AAPC приспособлен для выражения автомобиль на базе проточной цитометрии на следующий день после электропорации.
  2. Добавить IL-21 (30 нг / мл) к клеточной суспензии.
  3. Алиготе в T-75 см 2 колбы (ы) и / или Vue Жизнь Культура сумки в концентрации 10 6 клеток / мл и вернуться к incubatили.

Дни 3, 5

7. Продолжение культуры CAR + Т-клеток

  1. Выполните половины средств массовой информации изменения, пополнить IL-21, и поддерживать Т-клеток в концентрации 10 6 клеток / мл.

День 7

8. Конец первого AAPC-опосредованной стимуляции цикла

  1. Урожай клетки, считать и пятна на CD3, CD4, CD8, и Fcγ (CAR) и перейдите к пункту 10.1.

9. Истощение CD56 + клеток (обычно между 7 и 14 дней после электропорации)

  1. Выполните CD56 истощения использованием парамагнитных бисера, если CD56 + CD3 нег лимфоцитов ≥ 10%.

Стимуляция Циклы № 2, № 3, № 4 и отвечающих дней 8 → 14, 15 → дней 21, и Дней 22 → 28

10. Рекурсивные Добавление AAPC распространяться Т-клеток клинически достаточном количестве

  1. Повторите stimulatioп процесс (4 раза), как описано в шагах 4.3-8.1.
  2. Добавить IL-2 (50U/ml) в культурах начинается на 7, 14 и 21, и то при каждой смене носителя (три раза в неделю, в понедельник-среда-пятница график).
  3. Криоконсервируют (архив) избыток Т-клеток по мере необходимости.
    1. Т-клетки заморожены с использованием контролируемого морозильной камеры скорости.

День 28

11. Конце прошлого AAPC-опосредованной стимуляции цикла: Клетки Harvest T

  1. Криоконсервируют Т-клетки для тестирования выпуска и инфузий.

Результаты

Мы сообщаем, что электро-передачи ДНК плазмиды и распространения Т-клеток на γ-облученных AAPC может быть использован для создания клинически привлекательным количество Т-клеток, полученных из PB и UCB для человека приложений. Эти генетически модифицированные Т-клетки выразить представила автомобиль, который признает ТАА CD19, независимый от главного комплекса гистосовместимости. SB-производных плазмиды ДНК, чтобы выразить (I) транспозонов, 2-го поколения CAR (CD19RCD28), что сигналы через CD28 и CD3-ε 14, и (II) транспозазы, SB11 15, были описаны ранее 13, 16,17 . Плазмиды, используемые в настоящем исследовании были произведены коммерчески Вайсман клинической фонда Biomanufacturing (Мэдисон, Висконсин). AAPC (клон № 4), полученные из клеток К562 (родительские линии, полученной от американских Type Culture Collection), со-экспресс желаемого Т-клеток стимулирующих молекул (каждая молекула представила на 3 90% на клеточной поверхности AAPC),как описано выше 12. Здесь мы показываем, что CD19-специфичных Т-клетки могут быть получены из мононуклеарных клеток (МНК), полученные из ДСП или UCB использовании SB транспозиции ввести CAR с последующим добавлением AAPC численно расширить Т-клеток в CAR-зависимым способом (рис. 1 , 4) 13,18. Десять кювет (2x10 7 MNC / кювета) являются электропорации для каждого получателя с использованием 15 мкг ДНК плазмиды (CD19RCD28/pSBSO), кодирующий транспозонов (CAR) и 5 мкг ДНК плазмиды (pCMV-SB11), кодирующий транспозазы (SB11). Количество кювет может быть уменьшен, если ТНК ограничивают или сокращены для лабораторных работ. В день электропорации определяется как "День 0" Стимулирование цикла № 1. В качестве контроля для проточной цитометрии и культура условиях, аутологичных Т-клетки макет электропорации (без ДНК плазмиды) и численно расширена на γ-облученных AAPC (клон № 4), которые были предварительно загружены OKT3 перекрестной ссылки CD3 для поддержания Т-клеток распространения. Мы гoutinely оценки эффективности электропереноса и жизнеспособность Т-клеток, на следующий день после электропорации (рис. 2В). Выражение EGFP из контрольной ДНК плазмиды (назначенный pmaxGFP) и CAR в это начальная точка времени отражает экспрессию белка из интегрированной и эписомные плазмиды. Как правило, на следующий день после электропорации мы измеряем EGFP выражении на ~ 60% и ЦАР выражении на ~ 40% (рис. 2A) с Т-клеточной жизнеспособности 40-50%. Рекурсивные добавления γ-облученных AAPC в присутствии растворимого рекомбинантного человеческого ИЛ-2 и ИЛ-21 получить Т-клеток, стабильно экспрессирующих CAR (CD19RCD28). CD3 нег CD56 + NK-клетки истощаются от культуры с использованием CD56 конкретных бисером парамагнитного если процент этих NK клеток ≥ 10% и, особенно, если процент CAR экспрессируется на Т-клетках низка. Это истощение предотвращает быстрое разрастание клеток NK, которая препятствует способности AAPC для поддержания proliferatioп CAR + Т-клеток. В некоторых случаях, истощение NK клеток из CAR + Т-клеток осуществляется в течение двух последних циклов стимуляции, но это вносит потери желаемых клеток за счет ко-экспрессии CD56 на некоторых CAR + Т-клеток. Т-клетки были выращены в функционально замкнутых системы с помощью Vue мешки Жизнь культуре прошлого День 14. Подмножество генетически модифицированных и распространяется Т-клеток, как правило, криоконсервированы на 14 день или День 21 (конец стимуляции цикла № 2 или № 3) совместного культивирования на AAPC в качестве источника архивного материала для будущего анализа и быть талых если непредвиденные проблемы впоследствии возникнуть в процессе производства. Т-клетки, как правило, собирают на или о 28-й день культуры (рис. 3), которые обычно выражают> 90% автомобиля и> 80% жизнеспособных (рис. 2, D). Ранее нами было показано, что после четырех недель совместного культивирования на AAPC средний раз-расширения CD3 + T клеток 19800 ± 11313 с CA R + выражении составляет 90% ± 7,5 13. Эти Т-клетки криоконсервации и проходят в процессе производства и выпуска тестирование, которое информирует о безопасности и терапевтический потенциал выпускаемой продукции. Выпуск тестирование проводится в соответствии с клинической лаборатории улучшение поправки (CLIA), чтобы создать сертификат анализа до вливания в получателям на клинические испытания.

figure-results-1
Рисунок 1. Шаги описанием процесса electroporate и распространять CAR + Т-клетки из PB и UCB. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

upload/50070/50070fig2highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Характеристика генетически модифицированные Т-клетки из PB. (A) Выражение EGFP в день 0 первого цикла стимуляции для оценки эффективности переноса генов. Экспрессия CD19-конкретного автомобиля (CD19RCD28), как оценивали с помощью проточной цитометрии на CD3 +, CD8 + и CD4 + Т-клеток в (B) примерно через 24 часа после электропорации и (C) 28 дней после совместного культивирования на AAPC. Похожие выражение CAR наблюдалось с UCB-производных Т-клеток. (D) Кинетика CAR выражение. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

figure-results-2
Рисунок 3. Распространение PB-производных CAR+ Т-клеток. Курс цифровой расширение CD3 + и ЦАР + T клетки, полученные из PB повторной совместного культивирования на γ-облученных AAPC в присутствии рекомбинантного человеческого растворимого IL-2 и Ил-21. Вверх стрелки указывают добавки γ-облученных AAPC отметить, что в начале каждого цикла стимуляции. UCB-производных CAR + Т-клетки имеют сходные темпы цифровой экспансии.

figure-results-3
Рисунок 4. Схема производственного процесса с использованием СО и AAPC системах генетически модифицировать и распространять CAR + T клетки, полученные из PB и UCB. CD19 конкретных CAR + Т-клетки были получены от электро-передачи SB-суперспиральной, полученных плазмид ДНК и последующего совместного культивирования на К562 полученных AAPC (клон № 4) в присутствии OF рекомбинантного человеческого растворимого IL-2 и Ил-21. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

T исходной ячейки Транспозонов * Транспозазы Т-клеток инфузий IRB # NIH-OBA # IND #
Аутологичных (пациент происхождения) ** CD19RCD28 SB11 После аутологичных гемопоэтических стволовых клеток 2007-0635 0804-922 14193
Аллогенных (донорских происхождения) CD19RCD28 SB11 После аллогенной трансплантации стволовых клеток 2009-0525 0910-1003 14577
Аллогенных (донорских происхождения) CD19RCD28 SB11 После аллогенной трансплантации пуповинной крови пуповины 2010-0835 1001-1022 14739

* Таблица 1. Клинические испытания под эгидой FDA на MDACC влить CD19-клеток конкретной CAR + T распространяется на AAPC. Т-клетки оказываются специфические для CD19 через насильственное выражение SB транспозона кодирование для 2-го поколения CAR, назначенный CD19RCD28, что сигналы через CD28 и CD3-ε. ** Судебная описано в ссылке 5.

Обсуждение

Транспозонов и транспозазы систем, например, от PiggyBac 12,19 и SB 18,20-22, не являются вирусные подходы к генной терапии, которые являются альтернативой вирусно-опосредованной трансдукции клинического класса CAR + Т-клеток. SB был выбран в качестве системы переноса генов на основе ее потенциал для генной терапии человека 1,6,23. Мы разработали технологии двойного СО транспозиции (ввести CAR) и рекурсивным добавлением γ-облученных AAPC (для получения генетически модифицированных Т-клеток, стабильно экспрессирующих CAR) в качестве платформы технологии в производстве ТАА Т-клеток в соответствии с цГМФ для фазы I / II испытаний (рис. 4). Через 28 дней (четыре 7-дневный цикл стимуляции) совместного культивирования на γ-облученных AAPC, мы, как правило, способны генерировать по крайней мере ~ 10 10 генетически модифицированные Т-клетки пригодны для человека приложений. В случае необходимости, дополнительных циклов стимуляции могут быть предприняты тО генерировать большее количество генетически модифицированных Т-клеток. Кроме того, если меньше CAR + Т-клетки необходимы, подход к электропорации и распространения могут быть сокращены используя меньшее количество кювет и дальнейшего только к югу от набора численно расширил Т-клеток для последующих раундах распространения на AAPC в начале каждого Стимуляция цикла. Большинство электропорации и распространяется Т-клеток, собранных для инфузий стабильно выразить ЦАР. Следствием CD4 + и CD8 + Т-клеток, экспрессирующих наш 2-го поколения автомобиля включает клетки с памятью / наивные фенотип и проявляет три клейма повторного направлены специфику. Во-первых, генетически модифицированные Т-клеток, в частности лизиса CD19 + цели, во-вторых, производят IFN-γ в ответ на CD19 + клеток стимулятором и, в-третьих, размножаются в ответ на CD19 + фидерных клеток, все в CAR-зависимым способом 13,18. Наш подход к Integrели CAR трансгенов электро-передачи не-вирусной ДНК плазмиды из SB системы могут быть предприняты в покоящихся первичных Т-клеток, полученных из PB и UCB. Мы и другие генетически модифицированные клетки К562 в качестве AAPC эффективно распространять клинически достаточное количество Т-клеток для инфузий 24,25. AAPC и культуры тканей среды (например, добавление IL-21) были были изменены для создания пациента и донора, полученные CD19-специфических Т-клеток для инфузий после гемопоэтических стволовых клеток (табл. 1) 13,18. Мы можем производить CAR + Т-клеток от PB просто получить из вены, которая позволяет избежать затрат, дискомфорт и неудобство получения MNC от PB по афереза. Возможность получить большое количество CAR + Т-клетки из небольшого числа МНК является особенно привлекательным для вливания Т-клеток после трансплантации аллогенных UCB. Небольшой размер и анонимности донора новорожденных исключает повторной-Доступа этого лица в более поздний момент времени, и только ограниченное количество заготовленной MNC доступны в качестве исходного материала для производства T клетки, чтобы избежать вмешательства кроветворения. Дальнейший прогресс в производственном процессе В настоящее время ведутся включить устройство высокой пропускной электропорации в сочетании с полностью закрытым WAVE биореактор, чтобы свести к минимуму обращения. В совокупности, СО и AAPC являются привлекательными платформами для создания CD19 конкретных CAR + Т-клеток, которые могут быть адаптированы для создания большого количества генетически модифицированных Т-клеток, которые могут признать альтернативные клеточной поверхности ТАА в соответствии с цГМФ.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить д-р Карл июня (Университет Пенсильвании) за помощью создания и обеспечения AAPC клон № 4 и д-р Перри Hackett (Университет Миннесоты) за помощь в системе СО.

Грантовая поддержка: Cancer Center Основные Грант (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127), P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward фонда; Burroughs Wellcome фонда; Gillson Longenbaugh фонда; профилактике рака и научно-исследовательский институт Техас; ХЛЛ Global Research Foundation, Министерства обороны, усадьба Л. Noelan Библер, Гарри Т. Mangurian-младший, фонд лейкемии иммунотерапии, Институт персонализированной терапии рака, лейкемии и лимфомы общества; фонд лимфома исследований; MDACC сестра учреждение сети фонда; Миллер фонда, г-н Симонс травы, г-н и г-жа Joe H. весы, г-н Томас Скотт, Национальный фонд исследований рака, детской Фонд исследований рака; производство Assistancе для клеточной терапии (ПАКТ), Уильям Лоуренс и Фонд Blanche Hughes детей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагенты Продавец Номер в каталоге
Реагенты
ДНК плазмиды GFP выражая (pmaxGFP) Lonza VPA-1002 (комплект)
PBS Сигма D8537
CliniMACS PBS-EDTA Miltenyi Biotec 70026
HyQ RPMI-1640 Thermo Scientific SH30096.01
Фенол бесплатно RPMI-1640 Thermo Scientific SH30605.01
Hyclone фетальную телячью сыворотку Thermo Scientific SH3007003HI
Glutamax(100x) Gibco 3505-061
Ficoll-Paque GE Healthcare Biosciences 17-1440-02
Рекомбинантного человеческого IL-21 PeproTech AF-200-21
Рекомбинантного человеческого IL-2 (Пролейкин) Novartis NDC 65483-116-07
Т-клеток человека Kit (Nucleofector Solution) Lonza VPA-1002
CliniMACS CD56 реагентов Miltenyi 70206
FITC-конъюгированные с мышью мАт, специфичных для человека CD3 BD Biosciences 349201
APC-конъюгированных с мышью мАт, специфичных для человека CD4 BD Biosciences 340443
PerCPCy5.5-сопряженныхдля мыши мАт, специфичных для человека CD8 BD Biosciences 341051
PE-конъюгированные с F (аb ') 2-фрагмент из козьего антитела, специфичные для человека Fcγ Invitrogen H10104
Азид натрия Сигма S2002
Одноразовые
12-луночный планшет Гранулирование 3513
T-75 см 2 колбы Гранулирование 430641
Культура сумки Vue жизни 290C, 750C
50 мл центрифужные пробирки BD Biosciences 352098
Оборудование
Amaxa Nuceleofector II Lonza AAB-1001
Cellometer Nexcelom Bioscience Cellometer Видение
Sorvall Legend RT центрифуги Sorvall 75004377
BD FACS Calibur BD Biosciences 342975
Контролируемая морозильной камеры скорости Строгальщик Kryo 750
Облучатель СНГ био Международного IBL-437 C # 09433
Экспрессию молекул (эндогенные и внедряемых)
Клеточная линия Common Name Тип клетки Молекулы Выразил
CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 Клон 4 K562 CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP совместно с мембранным выразил связаны IL-15

Полный медиа-культуры (CCM) (хранить при 4 ° С в течение до 30 дней)
HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640
10% FBS
1% Glutamax

Проточной цитометрии буфер (хранить при 4 ° С в течение до 30 дней)
PBS
2% FBS
0,1% азид натрия

Ссылки

  1. Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood. 116, 1035-1044 (2010).
  2. Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held. Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).
  3. Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. CARs on track in the clinic. Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).
  4. Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).
  5. Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).
  6. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32, 756-767 (2010).
  7. Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies. Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).
  8. Williams, D. A. Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States. Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).
  9. Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes. Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).
  10. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
  11. Izsvak, Z., Ivics, Z. Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy. Mol Ther. 9, 147-156 (2004).
  12. Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).
  13. Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies. Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).
  14. Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).
  15. Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, 849-856 (2011).
  16. Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).
  17. Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity. Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).
  18. Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).
  19. Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).
  20. Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases. Cancer Res. 72, 271-281 (2012).
  21. Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies. Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).
  22. Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes. Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).
  23. Hackett, P. B. Jr, Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies. Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).
  24. Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).
  25. Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells. Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Sleeping BeautyCARaAPC

Похожие статьи