4D изображений агрегации белков в живых клетках

Краткое содержание

Сотовый жизнеспособность зависит от своевременного и эффективного управления белка неправильного сворачивания. Здесь мы опишем метод визуализации различных потенциальных судьбы неправильно упакованных белков: рефолдинг, деградации или поглощения в включений. Мы демонстрируем использование складной датчик, Ubc9 ^TS, Для proteostasis мониторинга и контроля качества агрегации в живых клетках с использованием 4D микроскопа.

Аннотация

Одной из ключевых задач любой живой клетки является поддержание правильного сворачивания вновь синтезированных белков перед лицом постоянно меняющихся условий окружающей среды и внутриклеточной среды, которая плотно упакована, липка и опасна для стабильности белка¹. Способность динамически балансировать производство, сворачивание и деградацию белка требует высокоспециализированного оборудования для контроля качества, абсолютная необходимость которого лучше всего проявляется при его неисправности. Такие заболевания, как БАС, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и некоторые формы муковисцидоза, имеют прямую связь с компонентами контроля качества сворачивания белка², и поэтому будущие терапевтические разработки требуют базового понимания основных процессов. Наша экспериментальная задача состоит в том, чтобы понять, как клетки интегрируют сигналы повреждения и формируют реакции, адаптированные к различным обстоятельствам.

Основная причина, по которой неправильное сворачивание белков представляет собой экзистенциальную угрозу для клетки, заключается в склонности неправильно свернутых белков к агрегации, что вызывает глобальное возмущение переполненной и хрупкой внутриклеточной среды сворачивания¹. Сворачивающее здоровье, или «протеостаз», клеточного протеома поддерживается, даже под давлением старения, стресса и окислительного повреждения, благодаря скоординированному действию различных механистических единиц в^{сложной системе контроля} качества. Специализированный механизм молекулярных шаперонов может связывать ненативные полипептиды и способствовать их переходу в нативное состояние¹, нацеливать их на деградацию убиквитин-протеасомной системой⁵ или направлять их к защитным агрегационным включениям^6-9.

У эукариот контрольная нагрузка по контролю качества цитозольной агрегации разделена между двумя отсеками^8-10: юкстаядерным отделом контроля качества (JUNQ) и нерастворимым белковым депозитом (IPOD) (Рисунок 1 - модель). Белки, которые убиквитинируются с помощью механизма контроля качества сворачивания белков, доставляются в JUNQ, где они обрабатываются для деградации протеасомой. Неправильно свернутые белки, которые не убиквитинируются, направляются в IPOD, где они активно агрегируются в защитном компартменте.

До этого момента методологическая парадигма флуоресцентной микроскопии живых клеток в основном заключалась в мечении белков и отслеживании их расположения в клетке в определенные моменты времени и обычно в двух измерениях. По мере того, как новые технологии начали предоставлять экспериментаторам беспрецедентный доступ к субмикронному масштабу в живых клетках, динамическая архитектура цитозоля стала рассматриваться как новый сложный рубеж для экспериментальной характеристики. Мы представляем метод быстрого 3D-пространственного распределения множественных флуоресцентно меченых белков в цитозоле дрожжей с течением времени. 3D-таймлапс (4D-визуализация) — это не просто техническая задача; скорее, это также способствует резкому сдвигу в концептуальной структуре, используемой для анализа клеточной структуры.

Мы используем цитозольный сворачивающийся сенсорный белок в живых дрожжах для визуализации различных судеб неправильно свернутых белков при контроле качества клеточной агрегации, используя быструю 4D флуоресцентную визуализацию. Чувствительный к температуре мутант белка Ubc9^10-12 (Ubc9^ts) чрезвычайно эффективен как в качестве сенсора клеточного протеостаза, так и в качестве физиологической модели для отслеживания контроля качества агрегации. Как и большинство TS-белков, Ubc9^ts полностью свернут и функционирует при допустимых температурах благодаря активным клеточным шаперонам. При температуре выше 30 °C или когда клетка сталкивается с напряжением неправильного сворачивания, Ubc9^ts неправильно сворачивается и следует за судьбой нативного глобулярного белка, который был неправильно свернут из-за мутации, термической денатурации или окислительного повреждения. Объединив его с GFP или другими флуорофорами, он может быть отслежен в 3D, поскольку он образует очаги напряжения, или направлен на JUNQ или IPOD.

Протокол

1. Дрожжевые препараты

1. Преобразование штаммов дрожжей с плазмидой, несущей GAL1-GFP-Y68L (Ubc9 ^TS) кассеты.
2. Рост дрожжей на синтетических средах, содержащих 2% раффиноза в течение 24 ч и обратно разбавляют до 2% галактозы содержащий средства массовой информации в течение 16 часов или O / N. Инкубируйте клетки при 30 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
3. На следующее утро, разбавить запросе напрягаться, чтобы OD ₆₀₀ = 0,2. Встряхните в течение 4-6 часов при температуре 30 ° C (200 мин), пока культура достигает OD ₆₀₀ = 0,8-1,0.
4. Чтобы подавить выражение (так, чтобы следить только за уже переведены и сложить пул GFP-Ubc9 ^TS), изменение средств массовой информации к синтетической среде с добавлением 2% глюкозы (SD) 30 мин до визуализации.
5. Лечение - теплового шока клеток в течение 20 мин при 37 ° C, чтобы вызвать неправильного сворачивания или непрерывно в микроскоп инкубатор следовать агрегации белков в теплового шока условиях. Примечание - если вы используете микроскопом при любой температуре выше комнатной температуры предварительного нагрева лг около 2 часов, чтобы уравновесить температуры вдоль тела микроскопа и целей (см. ниже).

2. Плита \ Презентация подготовка

1. Выберите соответствующую пластину. Основным фактором является способность сохранять фокус во время съемки изображений. Следующие пункты являются критическими для 4D визуализации, а не для 2D упущения времени или 3D-изображений.
   1. Несколько скважин пластинчатые в нижней части разных скважин не могут быть однородными (т.е. скважин будет на разной высоте по отношению к цели). Это позволит сделать его трудно поддерживать внимание на пункты ху и моменты времени, независимо от автофокусировки техника используется.
   2. Презентация материал: стекло против пластика. Со стеклянным дном слайды более Z-однородной между скважинами, но стоят дороже.
   3. Толщина нижней плиты: мы обычно используем покровное-днища индексом 1,5, а индекс 1 также приемлемо в зависимости от цели.
2. Covэ нижней части пластины \ слайд с ConA (0,25 мг / мл) в течение 10 мин. ConA используется придерживаться клеток на слайд, который позволяет после однократной клетки с течением времени.
3. Удалить ConA и инкубировать слайд в химической капот так, что избыток ConA будет испаряться.
4. Плита 200 мкл образцов дрожжей (OD ₆₀₀ = 0,5) в ConAed хорошо.
5. Инкубировать в течение 15 мин, чтобы позволить клеткам прилипать к поверхности пластины.
6. Извлечение среды, и мыть три раза с новой средой, чтобы получить один слой клеток. Примечание: если долго промежуток времени Планируется, семена клетки редко, так что новые бутоны не будет заполнить и прервать области интереса.

3. Микроскоп подготовка

1. Мы используем Nikon A1Rsi конфокальной микроскопии с несколько нестандартной модификации. Для дрожжей изображения мы используем до 4 лазеры (405 нм, 50 мВт CUBE лазер, 457-514 нм, 65 мВт аргоновый ионный лазер, 561 нм, 50 мВт сапфировый лазер и 640 нм, 40 мВт CUBE лазером), и до 4 ФЭУ оснащеныфильтры. Большинство наших изображения осуществляется с зеленым набор фильтров для EGFP и красный набор фильтров для mCherry и tdTomato. С GFP и mCherry почти нет bleedthrough, поэтому мы часто используют одновременное сканирование. Тем не менее, линейного сканирования также может быть использован для предотвращения bleedthrough, когда это произойдет. Наши конфокальной также оснащен этап PInano Piezo (MCL), который может сделать 3 мс шагами по г, что позволит 2-3 г-стеков (30-50 секций) в секунду. Система также имеет спектральный детектор, Perfect Focus (лазерная смещение), и двух сканеров - сканер гальвано и резонансным сканером.
2. Выберите соответствующие цели. Основные рекомендации:
   1. Вода / масло / воздух цели: основная фактором является показатель преломления изображений средних против среднего образца.
      1. Преимущества масла цели:
         1. Нефть цели могут иметь более высокие числовые апертуры (нефть перерывов света больше, чем воды, и, следовательно, больше фотонов вернуться к цели). Нефть цели может иметь доН.А. 1,49, по сравнению с 1,27 для воды. (Впрочем, это не на самом деле огромная разница в разрешении).
         2. Показатель преломления масла соответствует показателю преломления стекла, поэтому нет фотонов теряется переходе от образца, через стекло, к цели. (Примечание - выбрал иммерсионного масла, которое имеет показатель преломления, который подходит для ваших целей и вашей покровное).
         3. Масло позволяет без проблем долгое время, упущения, поскольку он не испарится.
         Недостатки Нефть Цель:
         1. Чем выше разрешение включено более высокой NA нефти цели деградирует быстрее, если свет должен проходить через водную среду (например, клетки).
         2. Изображения обычно имеют больше сферические аберрации и "протянул" эффекта в 3D.
         3. Нефть является липким, грязным и опасным для целей.
      2. Преимущества Вода цели
         1. Сама клетка представляет собой водный раствор, поэтому есть меньше искажений в г,го разрешения остается высоким глубоко в водном образце.
         2. Очистите и дружественным к пользователю. Вода цели недостатки: быстро испаряется, поэтому не подходит для долгого фильмов без специальных соглашений к тому, чтобы откачивать воду непрерывно в цель.
      3. Air объективных преимуществ: 1. Нет материала потерянных / испаряется в течение нескольких приобретение точку или длинный фильм. 2. Очистите и дружественным к пользователю. Недостатки: низкое разрешение и низкую чувствительность сигнала.
   2. Номер и инкубатор температуры: изменение температуры влияет на свойства материи, а в тонких системах меняет фокус. Температура должна быть скорректирована перед выбором пунктов для приобретения. Изменение температуры во время сбора будут нарушать изображений и приведет к потере фокуса. Мы позволяем нашим микроскопом системы равновесия в течение 2 часов в нужной температуры перед изображениями.
   3. Коррекция воротники: Многие приходят с целями коррекции кольцо позволяетЦелью быть скорректированы для данного покровное стекло толщиной. Мы рекомендуем изменять коррекции воротник при использовании флуоресцентных бусин для визуализации функции точки распространения. Это будет гарантировать правильные настройки для каждого образца.
   4. Стабильный держатели для образцов: мы обнаружили, что большинство имеющихся в продаже держатели образца являются самым слабым звеном микроскопа. Они часто являются шаткими, а не прямо. Это катастрофа для высокого разрешения, многоточечная 4D визуализации. Мы разрабатываем наши собственные держатели для образцов, которые прямо и плотно на сцену. Они также могут быть болтами вниз, когда это необходимо.
   5. Multi-точка приобретения: наша система визуализации оснащена Nikon "Perfect фокус" система, которая представляет собой лазерный автофокус механизм. Тем не менее, автофокусировка не обязательно необходимым с 4D визуализации, особенно если система не плыть по течению много.

4. Изображениями

1. Включите систему: лазеры, этап, контроллер, камера и COMPUтер программного обеспечения.
2. Место пластины на этапе держатель, надежно закреплены и стабилизировалась.
3. Используйте глаз порт, чтобы определить местоположение и ориентацию дрожжей.
4. Использование светлого, оценки здоровья и жизнеспособности клетки в соответствии с формой и текстурой.
5. Включите epifluorescent света в соответствии с соответствующими флуорофора (например, FITC фильтр для GFP), и сосредоточиться на клетки отображения фенотипу, являющемуся предметом вашего исследования. Клетки, которые очень флуоресцентные более чем в одной длины волны может быть мертв и, следовательно, аутофлуоресцентной. Мы представляем ядра с флуорофором tdTomato слит с сигналом SV40 NLS (NLS-TFP). TFP в два раза превышает размер GFP, и, следовательно, выше диффузии предел ядра, поэтому он работает очень хорошо в качестве ядерного маркера. Мы также можем возбуждать TFP с зеленой (488 нм) лазера одновременно как GFP, но собирать зеленые и красные выбросы в два отдельных ФЭУ для спектрального разрешения.
6. Настройте следующие параметры для минимизации шумаи перенасыщенность:
   1. Мощность лазера - фотообесцвечивания и фототоксичности против яркость изображения должны быть рассмотрены.
   2. Усиление: влияет на чувствительность камеры, таким образом, соотношение сигнал-шум.
   3. Пинхол диаметр - должны быть скорректированы в соответствии с лазер с более короткой длиной волны. Отверстие диаметром определяет толщину (высоту) оптической части образа. Таким образом, открывая отверстие будет собирать больше света (пусть больше фотонов в), но будет снижаться разрешение в г (менее конфокальности).
7. Полезные советы:
   1. Если разные флуорофоров излучают волны конгруэнтны, используйте функцию спектрального детектора, который дает возможность выбора виртуальных фильтров. Имейте в виду, что спектральные детекторы менее чувствительны, чем обычные ФЭУ.
   2. Если разные флуорофоров в восторге от того же лазера, использовать функцию строчной развертки.
   3. Сканер позволяет Galvano большей чувствительностью, но имеет более высокий риск для фотообесцвечивания. Резонансный сканер позволяет быстрееcquisition, тем самым снижая риск фотообесцвечивания, но менее чувствительной.
   4. Усреднение от 2 до 16 фотографий, он усиливает сигнал-шум, но делает приобретение медленнее и, конечно же, включает в себя более воздействии на образец лазера.
   5. Срок приобретения, зависит от биологических вопрос (например JUNQ и IPOD образование занимает ~ 2 часа). Мы отображаемого дрожжи с резонансного сканера до 30 часов в 3D замедленной.
   6. Временной интервал интервалом-меньшие интервалы создаст более согласованную фильм, но может привести к фото отбеливания и, следовательно, потери сигнала.

Результаты

Рисунок 1. Модель:. Субклеточном изолированность неправильно упакованных белков механизмы контроля качества направляет неправильно свернутых белков на отдельные отсеки с различными функциями: растворимых белков, предназначенных для деградации, проходят поли-убиквитинирования и отправляются на Ju XTA-N uclear Q uality отсеке управления (JUNQ ). Нерастворимые белки, которые не могут быть убиквитинированных направляются на защитные поглощения в I nsoluble Pr otein D eposit (IPOD), прилегающие к вакуоль, где они подвергаются активной агрегации.

es.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Моделирование неправильного фолдинга белков с GFP-Ubc9 ^TS. При нормальных условиях, GFP-Ubc9 ^TS (зеленый) изначально сложены, и локализован диффузно в ядре и цитозоле. Ядро помечены NLS-TFP (красный). Выражение Ubc9 ^TS был отключен добавлением 2% глюкозы перед изображениями во всех экспериментах. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

1. После сдвига температуры до 37 ° C, GFP-Ubc9 ^TS (зеленый) неправильно свернутых и образует цитозольного Очаги стресса. Ядро помечены NLS-TFP (красный).
2. После восстановления от теплового шока при 23 ° C, термической денатурации GFP-Ubc9 ^TS ухудшается, о чем свидетельствует снизился уровень флуоресценции.
3. После сдвига температуры до 37 ° С и торможения протеасома с 80 мм MG132, GFP-U bc9 ^ТС неправильно свернутых и перерабатывается в JUNQ и IPOD включений. Ядро помечены NLS-TFP (красный).
4. После сдвига температуры до 37 ° С и убиквитинирования торможения, GFP-Ubc9 ^ТС неправильно свернутых и перерабатывается в IPOD включения. Ядро помечены NLS-TFP (красный). Убиквитин протеазы 4 (Ubp4) избыточно экспрессируется, чтобы заблокировать Ubc9 ^TS убиквитинирования.

Рисунок 3. Время истечения JUNQ и IPOD образования. После сдвига температуры до 37 ° C и протеасомной торможение с 80 мм MG132, GFP-Ubc9 Очаги ^TS Стресс перерабатывается в JUNQ и IPOD включений. Ядро помечены NLS-TFP (красный). 3D-изображения были приобретены на 4 интервалов мин. (См. также фильм 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.

Обсуждение

Наша интуиция о биохимических процессах происходят от настольных экспериментах, в которых хорошо смешанный раствор реагентов и продуктов позволило достичь равновесия в стакан. В таких условиях, концентрация данного вида химического вещества могут быть выражена в виде одного числа, которое представляет собой отношение молярной количество молекул в макроскопическом объеме. Многое из того, что мы знаем о структуре и функции белков происходит от использования методов, которые отражают классический, навалочных картина реакции: вестерн-блоттинга, центрифугирования, и спектрофотометрического измерения проводились на выдержки из гомогенатах целых популяций клеток.

Поскольку технологии мы используем, чтобы посмотреть на клетки под увеличением улучшается не по дням, а по часам, она становится все яснее, что условия, в которых большинство биохимических реакций происходят в естественных условиях несут только малейшее сходство с теми классический сценарий верхней скамейке. Не только интерьер челла плотно упакованных среды, в которой вытеснение эффекты существенно изменить деятельность различных реагентов, но и наоборот хорошо смешанные. Этим объясняется частое несоответствие в пробирке и в естественных эффективность широкого спектра сложных реакций макромолекул.

Нигде интуиции, вытекающие из классического в пробирке биохимических экспериментах более склонны вводить в заблуждение, как и в вопросах, касающихся в естественных условиях складывающиеся, неправильного сворачивания и агрегации белков. В то время как исследования белков химии в натуральном реакции могут рассматривать вопрос спинка для данного белка, просто да или нет вопрос, любая попытка проследить динамику всего населения макромолекул в живой клетке должен быть чувствительным к целому распределение возможных конформационные результаты доступны для полипептидной цепи и, в частности, риск неправильного сворачивания и агрегации. Например, мы могли бы рассмотреть объемную ют клеткинасытить агрегирующего белков методом вестерн-блоттинга, и определить, что белок в основном нерастворимы и не убиквитинированных. Тем не менее, в живой клетке дискретных групп населения белка, трудно обнаружить при усреднении по многим клеткам, могут быть растворимыми и убиквитинированных в конкретном отделении, где местная концентрация видов чрезвычайно высока. Последний сценарий может иметь более серьезные последствия для жизнеспособности клеток, чем больше масса групп населения. Кроме того, в то время как сопровождающие отображать различные плейотропным поведение и функции в пробирке, становится очевидным, что в клетках их дискретных функций во времени и пространстве ограничен.

В формирующейся новой парадигмы для понимания биохимии, концентрация становится переменной свойства каждого конкретного нано-среды в клетку, и молекулярных событий, которые лежат в основе биологических процессов должны быть проанализированы не только во времени, но и в SPACе. Подход 4D визуализации, представленные здесь позволяет чувствительной моделирования белков неправильного сворачивания в живых клетках, хотя она может быть использована для изучения любого количества других биологических процессов и как они регулируются в пространстве, времени, и после изменения условий окружающей среды. В данной работе мы используем Ubc9 ^TS складывающиеся датчик, который эффективно демонстрирует этапы и варианты борьбы с наступлением агрегации белков в цитозоле. В дополнение к иллюстрирующих клеточной биологии контроля качества агрегации, этот подход может служить мощным инструментом для расшифровки эффекта конкретного возмущения или генетических мутаций на proteostasis (например Ubc9 ^TS может быть использован для измерения сворачивания белков стресса в ответ на окисление, выражение токсичных совокупности, или мутации в пути управления качеством).

4D изображений также имеет важное значение для точного определения локализации белка или колокализации двух разных белковс, а для обнаружения явлений, которые, возможно, быть временными, но важный. Например, особенно в небольших сферических организма, таких как дрожжи, оно может оказаться так, что структура или агрегат имеет juxtanuclear локализации, в то время как 4D изображений может показать, что это просто артефакт от угла осмотра.

В примере эксперимента мы представляем здесь, мы демонстрируем использование модели неправильно свернутых белков, Ubc9 ^TS, следовать агрегации контроля качества во времени и пространстве в цитозоле. На допустимая температура, Ubc9 ^TS складывается и распространяется в ядре и цитозоле. По тепло-индуцированной неправильного сворачивания, он изначально формирует быстро диффундирующего небольшой совокупный стресс очаги, которые обрабатываются для протеасомной деградации. Когда протеасома частично подавляется, эти очаги напряжения преобразуются в JUNQ и IPOD включения в течение примерно 2 часов. Если убиквитин-опосредованного деградации не доступна в качестве опции контроля качества, Ubc9 ^TS сразу же перенаправляются на IPOD включение защитных агрегации. Эти инструменты предлагают невероятные возможности открыть для себя новые генетические факторы, связанные с контролем качества агрегации, а также изучить их пространственных и временных регулирования в клетке.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
MG132	Mercury	mbs474790
con A	Sigma	C2010
Стеклянные донные пластины	ibidi	ibd81158
4D Флуоресцентная визуализация агрегации белков Конфокальные 3D-фильмы были получены с помощью микроскопа Nikon A1R-si, оснащенного пьезостоликом PInano (MCL), с использованием 60-кратного водяного объектива NA 1,27, срезы 0,3 микрона, 0,5% мощности лазера (от 65 мВт лазера 488 и 50 мВт лазера 561). z-стеки приобретались каждые 5 минут в течение 90 минут. Каждая серия z была приобретена с шагом 0,5 микрона и общим количеством 30 шагов. Обработка изображений выполнялась с помощью программного обеспечения NIS-Elements.