Методическая статья

Выделение и анализ Brain-секвестрированных лейкоцитов из Plasmodium berghei ANKA-инфицированных мышей

DOI:

10.3791/50112

⸱

2 января 2013 г.

 ,  , 
1The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод выделения приверженцем воспалительных лейкоцитов из мозга кровеносных сосудов Plasmodium berghei ANKA-инфицированных мышей описано. Метод позволяет количественное, а также фенотипической характеристике изолированного лейкоцитов после окрашивания флуоресцирующих антител и последующий анализ с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод выделения и характеристика приверженцем воспалительных клеток из мозга кровеносных сосудов P. berghei ANKA-инфицированных мышей. Заражение восприимчивых мыши штаммов с этим паразитом результаты напряжение в индукционной экспериментальной церебральной малярии, неврологического синдрома, который повторяет некоторые важные аспекты Plasmodium тропической опосредованной тяжелой малярии в 1,2 человека. Зрелые формы крови стадии малярии выразить паразитарных белков на поверхности зараженных эритроцитов, что позволяет им связываться с сосудистых эндотелиальных клеток. Этот процесс вызывает препятствия в кровоток, что приводит к гипоксии и кровоизлияния 3, а также стимулирует набора воспалительных лейкоцитов к месту паразита углерода.

В отличие от других инфекций, т.е. neutrotopic вирусы 4-6, как малярия зараженных эритроцитов (PRBC), а также связанные InflammAtory лейкоцитов оставаться поглощенным в кровеносных сосудах, а не проникают в паренхиму мозга. Таким образом, чтобы избежать загрязнения поглощенных лейкоцитами с невоспалительные циркулирующих клеток, обширная внутрисердечной перфузии зараженных мышей до извлечения органов и тканей, обработка требуется в этой процедуре, чтобы удалить кровь отсека. После перфузии мозга собирают и расчлененные на мелкие кусочки. Структуры тканей в дальнейшем нарушается ферментативной обработки с коллагеназы D и ДНКазы I. В результате мозг гомогенат центрифугировали в градиенте Percoll, который позволяет разделение мозга секвестрированных лейкоцитов (BSL) из миелина и другим мусором ткани. Изолированные клетки затем промывают, рассчитывали с использованием гемоцитометр и окрашенных флуоресцирующих антител для последующего анализа методом проточной цитометрии.

Эта процедура позволяет комплексно фенотипическая характеристика воспалительных лейкоцитов мигрируют в мозг, в реответа на различные раздражители, в том числе инсульта, а также вирусных и паразитарных инфекций. Этот метод также является полезным инструментом для оценки романа противовоспалительное лечение в доклинических моделях животных.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Заражение мышей с P. berghei-ANKA

  1. Размораживание аликвоты криоконсервированных P. berghei ANKA PRBC.
  2. Сдерживать церебральной малярии, устойчивых BALB / с донорами мышь (8-12 недель от роду) с помощью двуручной сдержанность техники. Inject мыши с 100-200 мкл PRBC использованием 1 мл инсулиновый шприц (игла 28G). Регулярно, 1-2 мышей-доноров вводят.
  3. На 4-5 дней после заражения (PI) удалить доноров мыши из клетки и поместить его на рабочую станцию ​​или одноразовой рабочей площадки.
  4. Аккуратно сдерживать мыши к концу хвоста и с помощью небольших ножниц разрезать кончик хвоста (около 1 мм). Кроме того, небольшой прокол хвост использованием 25 G игла может быть выполнена.
  5. Поместите каплю крови из хвостовой вены мыши ближе к концу матового конца микроскопа.
  6. Поместите второй слайд (распределитель) на угол 45 ° и обратно его в каплю крови. Как только кровь распространяется по краю, нажмите на разбрасыватель-слайд наканунеолько через стекло микроскопа, чтобы сделать мазок крови. Разрешить мазка высохнуть на воздухе.
  7. Исправить мазках крови в 100% метаноле в течение 30 секунд, после чего пятно слайды в свежеприготовленный Гимза в течение 10 мин.
  8. Промыть мазок крови с проточной водой в течение 1 мин, позволяют воздушно-сухой и изучить слайд под микроскопом (100х, масло погружение). Перечислить PRBC в пределах 1000 эритроцитов и вычислить процент паразитемии. Донор мышей должна достичь уровня паразитемии между 2.5-5%, прежде чем они могут быть кровь для заражения экспериментальных животных.
  9. Сбор крови от донора мышь ретроорбитального кровотечение использованием гепаринизированной микрогематокритовых капиллярной трубке. Все эксперименты проводятся в соответствии с Уолтером и Элизы зале института животных этики требования комитета. В зависимости от местных требований этики животных Комитета другие процедуры кровотечения могут быть использованы. Растворите необходимое количество крови в среде RPMI в конечной концентрации 1x10 6 pRBC/0.2 мл. Считают, чтонормальный гематокрит мышь ~ 6x10 9 красных кровяных клеток / 1 мл.
  10. Infect экспериментальных мышей C57BL / 6 (8-12 недель) путем введения внутрибрюшинно (IP) 1x10 6 pRBC/0.2 мл.
  11. Для контроля уровня паразитемии зараженных мышей выполните шаги 1.3-1.8. Паразитемии должны определяться каждые 2-3 дней, начиная с дня 2 или 3 пи
  12. Возникновение тяжелых форм малярии в C57BL / 6, может проявляться в виде сгорбленной внешний вид, гривистый меха и низкой активности. Некоторые мыши могут восстановиться на этой стадии, но прогресс в потере чувства собственного рефлекса указывает необратимые заболевания и животные должны быть умерщвлены.

2. Внутрисердечной перфузии мозга мышей и добыча

  1. Соберите эксплуатации системы перфузии тяжести, обеспечивая 500 мл резервуар колонки держатель крепится к верхней части 60 см колонки стенде. Подключите пластиковые трубы в нижней части водохранилища и обеспечить трубки зажим для управления буфером потока. Прикрепите трубки к 23-игла G. Фильл до резервуара с PBS (хранится при температуре 22 ° C), откройте зажим и позволяют буфера проходят через трубку, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
  2. Усыпить P. berghei ANKA-инфицированные мыши, CO 2 ингаляции. Подтверждение смерти из-за отсутствия педали, орбитальных и дыхательных реакций.
  3. Pin эвтаназии мыши, задние и передние лапы сверху на доску из пенопласта рассечение, содержащиеся в пластиковый лоток. В зависимости от местной анестезии животных этика комитет требования могут быть введены до начала внутрисердечной pefusion.
  4. Протрите брюшной стороне с 70% этанола.
  5. Используйте большие ножницы и щипцы, чтобы открыть кожу вдоль средней линии, чтобы разоблачить грудной полости. Fold и контактный кожи в стороны.
  6. Держите грудины с тонким пинцетом и сократить диафрагму и по обе стороны от грудины, отделяя ребра. Будьте осторожны, чтобы не повредить крупные кровеносные сосуды.
  7. Pin грудной клетки от грудины свободно рядом с головой.
  8. Держите желудочков остроумиеч штраф пинцетом и аккуратно надрезать правого предсердия с мелкими ножницами.
  9. Вставьте 23G иглой тяжести системы перфузии в левом желудочке к восходящей аорты в то время как PBS работает. Вставьте всего 0,5 см от кончика иглы.
  10. Заливать мыши в течение 5 мин или пока стоков ясно.
  11. Изъять мыши и положить его на свой живот. Протрите головой с 70% этанола.
  12. Использование больших ножниц, сделать разрез чуть выше шейного отдела спинного области мозга.
  13. Использование тонких ножниц, чтобы средний хвостовой-ростральной разрез, начиная с основания черепа и очистить кожу от разоблачить черепа.
  14. Держа голову, поместить лопасти маленькие ножницы в каждой орбитальной полости и сделать разрез между орбитами.
  15. Сделайте продольный разрез вдоль сагиттального шва и тщательно очистить череп на каждого полушария мозга наружу.
  16. Используя лопаточку, осторожно поднимите мозга и поместить его в 10 мл центрифужную пробирку, содержащую RPMI среде.

3. Выделение Brain-секвестрированных Лейкоциты (BSL)

  1. Работая в безопасности кабинета, место свежесобранных мозг на верхней части фильтра из нержавеющей стали клетки (40-60 размер ячейки) в чашку Петри, содержащую 3-5 мл RPMI среде тканевой культуры.
  2. Отрежьте ткань мозга на мелкие кусочки.
  3. Нажмите небольшие кусочки ткани мозга через ячейку фильтра использованием плунжера кристалла.
  4. Передача гомогената мозга в 10 мл трубки и центрифуги при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
  5. Растворить осадок в 3 мл среды RPMI, содержащей 0,05% коллагеназы D и 2U/ml ДНКазы I.
  6. Поверните смесь в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалите остатки клеток, нажав на смесь через 70 мкм нейлоновый фильтр клеток и / или путем инкубации на льду в течение 5 мин.
  7. Положите гомогената мозга на 7 мл 30% подушке Percoll и центрифуге при 400 х г (без тормозов) в течение 20 мин при комнатной температуре.
  8. Ресуспендируют осадок в 1 мл красного буфера для лизиса клеток крови и инкубируют на льду в течение 5 минлизировать приверженцем PRBC, которые не могут быть удалены из мозга внутрисердечной перфузии.
  9. Добавить 9 мл среды RPMI, мыть клетки и центрифуги при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
  10. Ресуспендируют BSL-содержащих гранулы в 50-100 мкл RPMI среде и передачи клеткам трубки Эппендорф.
  11. Развести 5-10 мкл аликвоты образец клеток 1:2 в трипанового синего для идентификации жизнеспособных клеток.
  12. Граф жизнеспособных клеток под микроскопом, используя гемоцитометра. Из 6-й день пи года, когда П. berghei ANKA-инфицированные мыши обнаруживают неврологические симптомы, 20,000-100,000 BSLs могут быть восстановлены.

4. Иммунофенотипирование из BSL по многоцветной проточной цитометрии

  1. Центрифуга клетки при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° C, аспирации супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл окрашивания буфера (PBS, 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 мм EDTA).
  2. Добавить 1 мкл очищенного anti-CD16/32 антител (Fcblock).
  3. Инкубировать клетки в течение 10 мин на льду.
  4. Вымойте клеток в 1 мл буфера окрашивания. Центрифуга клетки при 250 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и аспирации супернатант.
  5. Ресуспендируют клеток в 50 мкл буфера, содержащего Окрашивание заранее определенного оптимального разведения необходимые флуоресцирующих антител, т. е. анти-CD4, анти-CD8, анти-TCR и анти-NK1.1.
  6. Выдержите в течение 1 часа на льду.
  7. Вымойте клеток в 1 мл буфера окрашивания. Центрифуга клетки при 250 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и аспирации супернатант.
  8. Ресуспендируют клеток в 100 мкл PBS.
  9. Передача клетки пластиковой трубки проточной цитометрии.
  10. С помощью проточной цитометрии, приобретают по крайней мере 5,000-10,000 событий. Соответствующие неокрашенных контроль клетку и флуорохромом образцов компенсации должны быть включены по мере необходимости.
  11. Анализ результатов с помощью соответствующего программного обеспечения проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты на рис. 2 показывают проценты и абсолютные числа различных BSL населения оправился от мозгов перфузии или unperfused-инфицированных малярией и наивно контрольных мышей. Изолированные BSL окрашивали PE-анти-NK1.1 и APC-анти-TCR-β антитела, как указано в тексте Протокола. В соответствии с предыдущими выводами 7-9, αβTCR + Т-клеток состоят высокая доля BSL бассейн в мозгах перфузируемой малярия-инфицированных мышей (6-й день PI). Это население оказалось значительно недостаточно представлены...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделения и анализа BSL это метод, который позволяет характеристика и количественная воспалительных клеток мигрируют в мозг в ответ на повреждение ткани или инфекции в экспериментальной модели мышей. Введение внутрисердечной шаг перфузии для удаления крови отсека до извлечения органов и последующего выделения ячейки полезно для предотвращения загрязнения воспалительных клеток с невоспалительные циркулирующих лейкоцитов. Это не может быть основным требованием в нейротропных инфекциях, таких как мышиный вирус энцефаломиел...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить мисс Лиана Мацкевич технической помощи. Эта работа стала возможной благодаря викторианской государственного управления оперативной поддержки инфраструктуры и австралийское правительство национального здравоохранения и медицинских исследований Совета IRIISS и гранта 1031212.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Решения и буферы
Берег Гимза в эозином метиленовым синим решения Merck Millipore 1.09204.0500 Разведении 1:10 в дистиллированной воде
RPMI среде Мышь тонуса
Мышь тонус PBS 20 мМ фосфат натрия, 0,149 NaCl, рН 7,3
0,4% трипанового синего Sigma Aldrich T-8154 1:02 разбавление
Коллагеназа D Уортингтон Биохимические
Deoxyribonuclease (ДНКазы) я Sigma Aldrich D4263-5VL Из бычьей поджелудочной железы
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 30% раствор в PBS
Ultrapure Tris Invitrogen 15505-020
Хлорида аммония (NH 4 Cl) AnalaR 10017
Красный буфера лизиса клеток 17 мМ Tris, 14nM NH 4 Cl, рН 7,2
FCS Gibco 1009
ЭДТА динатриевая соль Merck 10093.5V 0,1 М, рН 7,2
Антитела и конъюгаты
Anti-мышь CD16/CD32 (Fc Block), клон 2.4G2 BD Pharmingen 553142 1 мкл в 50 мкл буфера окрашивания (0.5mg/50 мл)
FITC анти-CD4 мыши, клон H129.19 BD Pharmingen 553651
PE-анти-мышиных NK1.1, клон PK136 BD Pharmingen 553165
PerCPCy5.5-анти-CD8 мыши, клон 53-6-7 BD Pharmingen 551162
APC-анти-мышь TCR-β, клон H57-597 BD Pharmingen 553174
PE-анти-мышиных CXCR3, клон 220803 R & D Systems FAB1685P
Биотинилированных анти-мышь CCR5, клон C34-3448 BD Pharmingen 559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 551419
Оборудование и материалы
SuperFrost стекло микроскопа Lomb Менцель-Gläser
Препарирование щипцы, ножницы REDA Instrumente
500 мл PBS водохранилище Nalgene
Резиновые трубки
23G иглу BD PrecisionGlide 302008
Клеточная диссоциация набор, содержащий металлическое сито Sigma Aldrich CD-1
70 мкм фильтр клетки нейлон BD Falcon 352350
Гемоцитометр GmbH Neubauer 717810
Трубы проточной цитометрии СиD Сокол 352008

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
  2. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
  3. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
  4. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).
  5. LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).
  6. Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
  7. Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
  8. Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
  9. Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
  10. Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
  11. Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).
  12. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
  13. Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
  14. Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Brain Sequestered LeukocytesFlow CytometryIntracardiac PerfusionCollagenase D TreatmentPercoll Gradient SeparationHemocytometer CountingFluorescent Antibody StainingPlasmodium Berghei ANKAExperimental Cerebral MalariaInflammatory Leukocyte Isolation

Похожие статьи