Экспериментальные человека перевозке пневмококковой

Summary

Экспериментальные человека перевозке пневмококковой предлагает естественную модель перевозки и потенциальной моделью для использования в разработке вакцины. Этот метод является ценным, но сложный и включает в себя клинические рисков путем введения возбудителя в организм человека. Мы разработали подробный протокол.

Abstract

Экспериментальное пневмококковое носительство человека (EHPC) имеет научное значение, поскольку носоглоточное носительство Streptococcus pneumoniae является как основным источником передачи, так и предпосылкой инвазивного заболевания. Модель носительства позволит точно определить иммунологические корреляты защиты, иммунизирующий эффект носительства и влияние давления хозяина на возбудителя в носоглоточной нише. Кроме того, можно сравнить методы выявления носительства, полезные в эпидемиологических исследованиях, включая исследования вакцин.

Aim

Мы стремимся разработать платформу EHPC, которая является безопасным и полезным воспроизводимым методом, который можно было бы использовать для отбора новых вакцин-кандидатов на пневмококковую линию с предотвращением носительства в качестве суррогата иммунитета, вызванного вакциной. Он будет работать над тестированием вакцин-кандидатов и описанием механизмов, лежащих в основе EHPC и защиты вакцины от носительства¹. Современные конъюгированные вакцины против пневмококка защищают детей от инвазивных заболеваний, хотя новые вакцины срочно необходимы, поскольку существующая вакцина не обеспечивает оптимальной защиты от небактериемической пневмонии, и имеются данные о замене серотипов на невакцинные серотипы^2-4.

Метод

Мы прививаем S. pneumoniae суспендированно в 100 μл физиологического раствора. Безопасность является одним из основных факторов при разработке модели EHPC и достигается за счет интенсивного скрининга и мониторинга добровольцев. Комитет по безопасности, состоящий из клиницистов и ученых, независимых от исследования, предоставляет объективную обратную связь на еженедельной основе.

Бактериальный инокулюм стандартизирован и требует, чтобы никакие продукты животного происхождения не были инокулированы добровольцам (растительные среды и физиологический раствор). Дозы, необходимые для колонизации (10,^4-10,⁵), намного ниже, чем те, которые использовались на животных моделях (10,⁷), ⁵. Выявление пневмококкового носительства усиливается за счет обильного (в идеале >10 мл) промывания носа, которое относительно не содержит слизи. Этот протокол будет касаться наиболее важных частей протокола по очереди. К ним относятся: (а) отбор добровольцев, (б) препарат пневмококкового инокулята, (в) инокуляция, (г) последующее наблюдение и (д) выявление носительства.

Результаты

Наш текущий протокол был безопасен для более чем 100 добровольцев в диапазоне доз с использованием двух различных бактериальных серотипов⁶. В настоящее время проводится исследование диапазона доз с использованием S. pneumoniae 6B и 23F для определения оптимальной дозы инокуляции для 50% носительства. Прогнозируемая 50%-ная скорость носительства позволит модели EHPC иметь высокую чувствительность к эффективности вакцины при небольшом числе исследований.

Protocol

1. Волонтер Выбор и скрининг

1. Здоровые добровольцы набираются через сайт рекламы и на веб-сайте университета в соответствии с NHS исследований и Комитет по этике руководства.
2. Критерии включения для участия являются:
   1. Взрослые в возрасте 18-60 лет.
   2. Свободно владеет английским языком и имеет возможность общаться легко, как мобильные телефоны и текстовые сообщения.
3. Критериями исключения для участия являются:
   1. Тесный контакт с лицами риска (дети, взрослые ослабленным иммунитетом, пожилые, хронические заболевания).
   2. Курение курильщик или значительное истории (> 10 шт лет).
   3. Астма и другие заболевания дыхательных путей.
   4. Беременность.
   5. Аллергия на пенициллин или амоксициллин.
   6. Данной участие в другом клиническом испытании, если наблюдений или в не-интервенционных фазу.
   7. Не в состоянии дать осознанное согласие.
4. Первого визита скрининга, примерно за неделю до прививки, включает в себя целенаправленное истории болезни и целенаправленное клиническое обследование.
5. Если ранее неизвестные аномалии найдено, добровольцев будут исключены из исследования, и соответствующие расследования будут согласованы по первичной медицинской помощи.
6. В ходе первоначального скрининга посетить полный анализ крови получают для того, чтобы количество лейкоцитов находится в пределах нормального диапазона перед прививкой визитом. Стирка носовых проводится, чтобы исключить естественными носителями пневмококка (см. п. 6.1).
7. Перед прививкой, волонтеры обучаются на риски, связанные с участием в исследовании и снабжены листовки чрезвычайных пациента, цифровой термометр, номера экстренных телефонов и 3-дневный курс амоксициллина.

2. Подготовка Прививка Акции

1. Подготовка прививки акций должно быть сделано в чистой окружающей среде. Пипетки использовать следует только использоватьD для подготовки посевного материала. Все стеклянные и пластмассовые изделия должны быть стерильными. Мы рекомендуем прививки запасы быть подготовлены в специальной комнате, используя специальный fumehood и инкубатор.
2. Пневмококковых штаммов засевают на кровяной агар пластины. Планшеты инкубировали при 37 ° С в 5% СО ₂ в течение ночи. На следующий день все бактерии соскабливают с пластинки агара крови и засевают в бисер система сохранения запасов. Эти борта запасы используются для прививки подготовки массы. Проверьте борт запасы на предмет загрязнения и колонии единообразия перед приготовлением прививки акций.
3. Для получения прививки акции, привить пластины кровяной агар с двумя бусы из желаемого пневмококковых серотипов складе шарик, полос, чтобы покрыть всю тарелку. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° С в 5% СО ₂ в течение ночи. Все последующие инкубации будет использовать эти же условия. Также инкубировать Vegitone СМИ ночь, чтобы обеспечить стерильность.
4. Следующим утром тампонполовина пластины, заботясь, чтобы не удалить кровяной агар, и добавьте в 12 мл подогретого Vegitone бульон. Повторите с помощью других половину тарелки. Оставьте два 12 мл флаконах при 37 ° C в течение 2 часов или до изменения мутности становится очевидным, что наступит раньше.
5. Добавить 12 мл до 40 мл подогретого Vegitone бульон и тщательно перемешайте. Повторите для другой 12 мл флакон. Это момент времени = 0. Удалить 100 мкл читать оптической плотности (ОП) при 600 нм. Удалить 20 мкл для количественного определения бактерий, образующих колонии единицы (КОЕ) подсчет с помощью изменения метода Майлз и Мишра (M & M) ^7. Инкубируйте и флаконах.
   1. Для M & M, разделить тарелку кровяной агар из шести разделов. Добавить 180 мкл стерильной PBS до шести скважин 96-луночный планшет (U-вниз). Добавить 20 мкл бульона и сверху и перемешать. Серийно разбавить образец 1:10 в шесть раз и выбросить 20 мкл с шестого хорошо. Место три 10 мкл капли сверху хорошо в первом разделепластину кровяной агар. Повторите эти действия для остальных пяти скважин. Убедитесь, что пластина сухой перед его переворачивают и инкубируют.
   2. На следующий день подсчитать число видимых колоний в каждой секции разведения и записи. С помощью разбавления раздел с числом от 30 до 300, делят число видимых колоний на три, чтобы получить среднее.
   3. Умножьте среднее число колоний на коэффициент разбавления, а затем разделить на 10 (количество 10 мкл капли). Это дает КОЕ / мкл.
   4. Умножьте это число на 1000, чтобы получить КОЕ / мл.
6. Выполните OD 600 показаний и количественного бактерий, M & M метода каждый час до начала середине логарифмической фазы будет достигнута, ОР 0,25.
7. Как только это будет достигнуто OD, добавить стерилизованные 10% глицерина в одном флаконе и приготовления 1 порции мл. Магазин аликвоты при -80 ° C.
8. Для более концентрированных акции, центрифуги другой флакон в 3345 мкг в течение 15 минут и удалить супернатант. Ресуспендируют гранул в 22,5 мл Vegitonсредний е и добавить 10% глицерина. Подготовить 1 мл аликвоты и хранят при температуре -80 ° C.
9. Оставьте запасов при -80 ° C в течение по крайней мере 48 часа до оттаивания и количественной оценки.
10. Количественная замороженных бактериальных акции по M & M методом. Тестирование трех труб складе индивидуально для обеспечения воспроизводимости. Используйте полученное значение для разбавления складе в нужное посевной концентрации в растворе, как описано ниже.
11. Для прививки, количества пневмококков в посевной рассчитана до и после прививки. Это количественная бактерий, M & M метод используется для определения среднего количества пневмококков в посевной на долю которых приходится на время, необходимое для завершения всей процедуры.
    1. Подготовка посевного материала, разбавление до нужной концентрации, а также выполнять количественную по M & M метод «до прививки" кол.
    2. В нашей клинической фонда исследований он принимает команды от 30 минут до завершения всей процедуры прививки. Pneumococcal суспензии в физиологическом растворе, как правило, показывают снизилось количество в этом интервале. Чтобы объяснить это, мы позволим разбавленный сидеть посевной при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем выполнить "пост-прививка" количественное определение бактерий M & M методом.
    3. Возьмем среднее значение до и после определения окончательной прививку концентрации. Отрегулируйте "сидит" время в соответствии с вашими клинический протокол, но сохранить интервал как можно более кратким.
12. Все новые запасы должны быть направлены в референс-лабораторию для подтверждения чистоты на складе и идентичности.

3. Подготовка посевной

1. Подготовка к посевной следует начинать за 30 минут до назначенного времени прививки добровольцев.
2. Возьмите одну из ранее сделанных труб фондовом из морозильной камере -80 ° C, оттепель его и вращать трубу в микроцентрифуге при 17000 х г в течение 3 мин.
3. Теплый кровяной агар пластины в 37 ° С инкубатор. Готовить96-луночный планшет для бактериального количественного методом M & M и подготовить разведения труб в зависимости от желаемой дозы.
4. Снимите бульон супернатант из центрифугированных труб и ресуспендируют осадок в 1 мл физиологического раствора. Этот шаг снимает отвар из посевного материала.
5. Повторите стадии центрифугирования.
6. Удалить солевые супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл физиологического раствора.
7. Выполнить набор для разведения желаемого посевной концентрации и количественно по M & M методом.
8. Возьмем к посевной добровольцев назначения и после прививки добровольцев, повторить количественный в лаборатории. Этикетка трубки с датой и посевной дозы и хранить при температуре -80 ° C.
9. Для обеспечения согласованности с прививкой на прививку, важно использовать те же пипетки и специального оборудования лаборатории каждый раз.

4. Прививка

1. Добровольцы должны сидеть удобно в полу-лежачем положении.
2. Использование P200 пипетки и стерильные наконечники с фильтром составляет 100 мкл посевного и вставьте наконечник только внутри полости носа.
3. Медленно изгнать посевной на слизистую оболочку носа помощью кругового движения.
4. Очень важно, чтобы кончик пипетки не вступают в контакт с слизистую оболочку носа, как нарушения в целостности эпителия может привести к бактерии, попадающие в кровь.
5. Это также важно, чтобы посевной находится не слишком далеко, или она будет работать в горло, она должна находиться внутри полости носа.
6. Повторите для другой ноздри.
7. У добровольцев остаться в полу-лежачем положении в течение 10 мин без нюхают или сморкании. Это дает время для бактерий, чтобы разогнать через слизистую оболочку.

5. Мониторинг

1. Добровольцы ежедневно контролируется после прививки. Это включает в себя ежедневное текстовое сообщение, отправленное добровольцев исследователи до 2 часов.
2. Если текст, который яы не получил к 2 часам дня волонтера будет связаться, чтобы обеспечить его / ее благополучия. Если он / она не отвечает, выделенных ближайших родственников будет связаться, чтобы обеспечить волонтеров благополучия.
3. Волонтеры просят сообщать о любых верхних дыхательных путей симптомов на каждом назначении. Медицинский персонал будет просить добровольцев, чтобы описать его / ее симптомы и будет следить за любыми жалобами.
4. Антибиотики уделено добровольцев только должны быть приняты в трех случаях: в случае, если они нездоровы и поручил принять их исследовательской группы, если они несут пневмококка в конце исследования, или если они нездоровы и не может связаться с исследовательской группой. Добровольца рекомендуется держать это чрезвычайное пакет с ними в течение всего времени исследования и обращаться к исследовательской группы на ежедневной основе в течение последующих 7 дней.
5. Наша команда доступна 24/7 с медсестрой контакте в рабочее время и двум врачам доступны из хоУРС. Все вопросы решаются путем телефонного звонка и / или непосредственного обзора. Положения доступны для немедленной, прямой допуск к инфекционное отделение болезни, если это необходимо.

6. Носовые Wash (NW) процедуры

1. Носовые моет (NW) выполняется на начальном визите скрининга, а также 48 часа, 7 и 14 дней после прививки. Метод З использованы взята из Naclerio и др. ^8. Добровольцы естественно колонизирована S. пневмонии исключены из прививки и последующей деятельности.
2. Волонтер сидит комфортно и голова наклонена назад 30 ° от вертикали.
3. Попросите добровольца, чтобы сделать глубокий вдох и задержать дыхание в то время толкают их языком вверх и в обратном направлении по отношению к небу. Хотя в этом положении, волонтер просят сигнализировать, что они готовы.
4. Шприц с 20 мл солевого вставляется в переднюю носовую пространства и 5 мл физиологического раствора исключен. Volunteeг, то наклоняется вперед сразу и удаляет жидкость, быстро выдыхая через нос в миску фольгой.
5. Повторите эту процедуру еще 3 раза, так что каждый ноздри были дважды промывают и полный 20 мл были использованы.
6. Бассейн все образцы вместе в центрифужные пробирки и отправить в лабораторию при комнатной температуре обработки.

7. Носовые Wash обработки

1. Центрифуга образцов в течение 10 мин при 3345 х г.
2. Удалить супернатант и хранят в 1 мл аликвоты в маркированных трубы Эппендорф при температуре -80 ° C.
3. Добавить 100 мкл STGG среде ⁹ до осадок и тщательно перемешайте. Убедитесь, что общий объем в трубе в этой точке определяется. Это разбавление будет использоваться при расчете КОЕ перевозки положительные З.
4. Пластина 20 мкл капли STGG содержащие Ресуспендированный осадок на тарелку кровяной агар содержащие гентамицин и полоса всей пластинки.
   1. Если NW это после инокуляции, 10 мкл удалить из STGG содержащие Ресуспендированный осадок и использование для бактериального количественного М & M методом.
5. Добавить еще 800 мкл STGG к трубе NW и тщательно перемешайте.
6. Пластина 25 мкл на тарелку кровяной агар и 25 мкл на тарелку агар шоколада, полос всей пластинки.
7. Разделите оставшееся количество бактерий, взвешенных в STGG среднего на 2 криопробирки и хранят при температуре -80 ° C.
8. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° С в течение ночи в 5% CO _2.
9. Проверьте пластины на следующий день пневмококка и других потенциальных возбудителей дыхательных путей.
10. Пневмококки определяются на пластинах по морфологии колонии. Альфа-гемолитические колонии с морфологией рисовальщика являются суб-культурного на кровяной агар с диска optochin и инкубировали в течение ночи.
11. Фиксированные пневмококковой колоний, которые являются чувствительными optochin которые окрашивали по Грамму, чтобы подтвердить грамположительные диплококки и серотип использовании сывороток Института Pneumotest-Latex комплект.

Results

У нас есть опыт прививки 159 человек, из которых 35 были проведены пневмококка. Самая низкая доза мы достигли перевозки с использованием серотипа 6B было 11100 cfu/100 мкл на ноздри, самая высокая доза составляла 313000 cfu/100 мкл на ноздри. Самая низкая доза мы достигли перевозки с использованием серотипа 23F был 9000 cfu/100 мкл на ноздри, самая высокая доза составляла 84500 cfu/100 мкл на ноздри.

Наш метод перевозки оценка носовой мыть, выбран потому, что последние исследования ¹⁰ показали, что 91% добровольцев, обнаружили носовой мыть, чтобы быть более удобным, чем носоглотки тампон, носовой стирки была также больше шансов для обнаружения патогенов при микробиологической культуры. Микробной флоры восстановлены на кровяной агар пластин засевают NW может быть переменная и трудно читать. Гентамицин используется на первой пластинке агара крови, чтобы выбрать для пневмококка. Пластина шоколадный агар и второй пластиной кровяной агар используется для выявления других возможных пути дыхательнойogens, которые могут способствовать или препятствовать пневмококковой колонизации. Например пластины кровяной агар засевают NW, который легко читать показано на рисунке 1а; трудно пластину, содержащую многочисленные виды флоры показано на рисунке 1b.

На каждом назначении добровольцам было предложено для описания любых верхних дыхательных путей симптомы, если они присутствуют, и сравнения между носителями и не носителями были выделены. Из 145 человек, недавно привитых пневмококка, 28 жаловались на симптомы (табл. 1). Восемь из них были носителями, двадцать не было. Наиболее распространенными симптомами были неспецифическими назальных симптомов (табл. 1). Из всех случаев, в которых были зарегистрированы системных симптомов, включая лихорадку и / или недомогание, ни один из проведенных расследований были выявлены признаки пневмококковой инфекции и симптомы согласуются с одновременным вирусной инфекции за исключением одного случая тонзиллита. Два пневмококковой POSITIVэлектронной добровольцев лечили антибиотиками. Один жаловался на боль в горле и ухо болит, а после встречи с изучением врача, посоветовали принимать антибиотики в качестве меры предосторожности. Других добровольцев был диагностирован клинически с тонзиллитом. Все добровольцы были быстрому разрешению симптомов.

Рисунок 1. Кровь пластины агара засевают-З. Крови агаром засевают NW может быть трудно читать. 1а является примером пластину, которая легко читается с пневмококки четко видны. 1b представляет собой пластину с большим количеством совместной колонизации флоры делает его более трудно обнаружить, если пневмококки присутствует.

Симптомы		Перевозки (п = 32)	Нет перевозок (N = 112)
ВсеСимптомы		24%	18%
Систематический	Лихорадка	3%	4%
	Недомогание *	9%	4%
Местный	Ушки	9%	3%
	Нос	0	10%
	Горло	12%	3%

Таблица 1. Характеристика добровольной основе сообщаемых симптомов после S. пневмонии 6B прививки. Все жалобы были рассмотрены на заседании Комитета по внешним безопасности, и после полного расследования, никаких симптомов были отнесены к пневмококковой инфекции. Наиболее распространенными симптомами были боли в горле, фаршированные нос и гриппоподобных заболеваний.

Discussion

EHPC платформа имеет ряд потенциальных применений, включая использование в качестве слизистой модель вакцины и в качестве суррогатной защиты для тестирования вакцин нового белка. Метод зависит от последовательного технику прививки и высокое качество-З.

Воспроизводимость может быть проблема с посевной. В связи с переменным характером замороженных бактериальных аликвоты, это может быть трудно воспроизвести желаемую дозу. Пополам или удвоения требуемой дозы считаются в пределах диапазона. Очень важно, что бактериальная количественного быть сделано непосредственно перед и следующие прививки для того, чтобы точно определить количественное бактерий, КОЕ кол. По этой причине он может быть полезным, если волонтер назначения происходят одновременно, так что только один посевной необходимости быть готовыми и количественное покрытие сделано до и после прививки происходит не более чем на 30 минут друг от друга.

Метод требует З Coopeрацион добровольцев и не был бы идеальный метод у детей. Если доходность составляет менее 5 мл, процедуру можно повторить с использованием до дополнительных 20 мл. Ношение зубных протезов может привести к снижению доходности С-З. Если доброволец заблокирован / заложен нос и солевые уходит вперед после введения, взрывать нос, вставить шприц немного дальше назад, и наклонить голову больше, если необходимо.

З является метод, который становится лучше с практикой. Некоторые объем, как правило, теряется, так что цель состоит в возвращении по меньшей мере 10 мл. Если желающий может попробовать солевой течение З, то соединение между задней носоглотки и ротоглотки не была должным образом закрыта язык добровольца. Если добровольцев глотает большинство из солевого раствора, объяснить процедуру еще раз, подчеркивая нажатия язык к небу. Затем повторите процедуру увеличения объема вернулся.

Если NW содержит substantIAL количество слизи, то лучше ее удалить перед центрифугированием. Vortex образца таким образом, чтобы ослабить все, что может быть привязан к слизи, а затем удалить как можно больше крупных кусков возможно при удалении всего солевого насколько это возможно.

Предыдущая EHPC исследования в США было завершено безопасно и не имел побочных ^11. Для обеспечения постоянной безопасности EHPC платформы, мы создали чрезвычайный протокол, который базируется на 24 часа доступ к исследовательской группы. Волонтеры получают контактные данные, позволяя им получить доступ к исследовательской группой 24 часа в сутки. Любая медицинская помощь необходима предоставляется в Royal Liverpool University Hospital. В качестве дополнительной меры защиты, комитет по безопасности, состоящий из клиницистов и ученых из других исследовательская группа получает еженедельный отчет безопасности. Доклад содержит бактериальные дозу каждого добровольца получили и были ли какие-либо симптомы или болезни не сообщалось. Данный отчет позволяет безопасности гоэлектронной исследовании, которое будет внешне критикуется без предвзятости. Комитет по вопросам безопасности также доступны 24 часа в сутки в маловероятном случае возникновения чрезвычайной ситуации.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Cat #
Глицерин	Рыбак	G/0650/08
0,9% хлорида натрия	B. Braun	3627667
Молоко сухое обезжиренное	Fluka	70166
Триптон соевый бульон	Becton Dickinson	211768
Глюкоза	BDH	284504S
Колумбийский агар с chocolated крови лошади	Oxoid	PB0124
Pneumotest-латекс комплект	Statens Serum Institut	51823