Методическая статья

Изоляция и Иммуноокрашивание лимфоциты и дендритные клетки из мышиных Патчи Пейера

DOI:

10.3791/50167

⸱

17 марта 2013 г.

 ,  , 
1Division of Infectious Diseases, New York State Department of Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует растущий интерес в понимании иммунологических функций конкретной субпопуляции клеток в Пейеровы бляшки (PPS), первичные индуктивных участков кишечника связанных лимфоидной ткани. Здесь мы наметим параллельных протоколов для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии анализа и PP cryosections для иммунной окраски.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пейеровы бляшки (ПП) являются неотъемлемой частью кишечника, лимфоидной ткани (GALT) и играют центральную роль в кишечном иммунологического и гомеостаза. Частицы антигенов и микроорганизмов в просвете кишечника постоянно, отобранных PP клетки M в фолликул связанных эпителия (FAE) и транспортируется в основной сети дендритные клетки (ДК), макрофаги и лимфоциты. В этой статье мы опишем протоколы, в которых мышиные ПП являются: (I) распадается на одном суспензии клеток и подвергали проточной цитометрии и (II), подготовленный для cryosectioning и иммунной. Для проточной цитометрии, PPS механически диссоциированных и затем фильтруют через 70 мкм мембран для создания одного клеточные суспензии бесплатно эпителиальных клеток и крупного мусора. Начиная с 20-25 PPS (от четырех мышей), этот быстрый и воспроизводимый метод дает населению> 2,5 х 10 6 клеток с> 90% жизнеспособность клеток. Для cryosectioning, свежиеют изолированным PPs погружены в оптимальной температуры резания (ОКТ) среды, оснастки замороженной в жидком азоте, а затем разрезе использования cryomicrotome. Срезы тканей (5-12 мкм), сушат на воздухе, фиксировали ацетоном или метанолом, а затем подвергают иммунного.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пейеровы бляшки (ПП) являются макроскопические агрегаты организованных лимфоидных фолликулов присутствует во всем тонком кишечнике людей и мышей (рис. 1) и составляют основные сайты, на которых слизистых иммунных ответов, возбужденное в отношении диетических антигенов, синантропных бактерий, патогенных микроорганизмов, а также пероральных вакцин 1-4. В отличие от других периферических лимфоидных тканей, таких как мезентериальных лимфатических узлов, PPS не хватает афферентные лимфатические сосуды. Таким образом, адаптивный иммунный ответ в PPs приводятся в ответ на антигены, полученные из просвета кишечника. Выборка просвета антигенов осуществляется по фолликула связанных эпителия (FAE), который состоит как из энтероцитов и антиген-отбор проб клеток, известных как М-клетки. Под FAE, в суб-эпителиальные купола (SED) области, лежит сети дендритные клетки (ДК) смешались с макрофагами, В-клетки и CD4 + Т-клетки 5-9. В основе каждой PP лимфоидной folliclе, фолликулярные дендритные клетки (ФСКН) и В-клеток, богатых центрального зародышевого центра, в окружении Т-клеток богатых зон интерфолликулярной. Антиген отбора образцов, ПП результатов в развитии IgA + В-клеток plasmablasts и CD4 +-эффекторов и клеток памяти, что семена окружающих ргорпа пластинки и обеспечивает иммунитет к широкому спектру к слизистой оболочке захватчиков.

Пройдя сложные события, связанные с иммунологической антиген выборки, обработки и представления в PPs является непростой задачей, учитывая, что PP клетки составляют лишь малую долю от общего лимфоидных клеток в слизистой оболочке кишечника. Чтобы помочь в в пробирке характеристика клеток в этой среде, мы предоставляем протокол для подготовки общего мыши PP ячеек для проточной цитометрии и функционального анализа, а также протокол для подготовки PP cryosections для иммунофлуоресцентного микроскопии и immunohistology. Наш протокол для выделения, характеристика и иммуноокрашивания МоВэлектронной PP клеток не нова сама по себе, о чем свидетельствует тот факт, что имеются многочисленные ссылки насчитывает более 25 лет, что привести эти методы 5,6,9-11. Скорее всего, наш протокол обеспечивает обтекаемый (и визуальный) метод для следователей сбора PPs в первый раз. Методы мы опишем легко освоили и легко получить большое количество клеток с> 90% жизнеспособность клеток. Cryosectioning протокол дает высокую воспроизводимость серийных срезов идеально подходит для окрашивания иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии. Кроме того, наш протокол дополняет два других недавних статей Юпитера. Во-первых, Фукуда и коллег, описывает использование лигированную подвздошной анализы цикла для оценки поглощения патогенных бактерий PP клетки M 12. Другой, Geem и коллег, описывает выделение и характеристика ДК и макрофагов мыши слизистой оболочки кишечника, но явно исключает ПП от их анализ 13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животные были размещены в обычных, специфических патогенов без условий и лечились в полном соответствии с институциональной животных Wadsworth центра по уходу и использованию комитета (IACUC) руководящих принципов.

1. Желудочный зонд

  1. (Необязательно) зонд мыши штамма выбор с антигеном или микробов интерес помощью 22 G x1.5-в. тупой конец иглы кормления (Popper научных, New Hyde Park, NY). Объемы поставок не должна превышать 400 мкл на мышь.

2. Изоляция PP Клетки для проточной цитометрии

  1. Усыпить мышей CO 2 удушья, в соответствии с институциональными и использования животных комитета (IACUC) руководящих принципов.
  2. Очисти живота с 70% этанола или бетадин до операции. Выполните стандартную лапаротомию, которая включает одну (1 см) разреза с использованием хирургических ножниц класса по средней линии начала около 1,5 см от основания грудной клетки. Expose вitoneal полости и определить слепой кишки. Надрез терминал тонкой кишки в подвздошную-слепой кишки соединения и осторожно удалить кишечник в полном объеме. Будьте осторожны, не hyperextend кишечной ткани, как это будет удален из брюшной полости.
  3. Положите тонкую кишку на кровати влажные бумажные полотенца или Kimwipes. Смочить тонкий кишечник мягко физиологическим раствором, чтобы предотвратить обезвоживание тканей. Визуально определить индивидуальный PPs расположен на анти-брыжеечной стороне кишки (рис. 1). Как правило, один мышь имеет от 5 до 10 видимых PPs, которые равномерно распределены из двенадцатиперстной кишки (проксимального) в подвздошной кишки (дистальный). В среднем, четыре мышей даст 23 ПЗ.
  4. Используя изогнутые хирургические ножницы, аккуратно акцизного отдельные ПЗ и поместить их в сбалансированный солевой раствор холодным Хэнка (HBSS). Обратите внимание, ножницы должны быть размещены кривой вверх чуть выше PP, а затем аккуратно наносят на ткань. Акцизный только PP (не surroundiнг ткани) и трансфер в холодном HBSS.
    Примечание: Все инкубации и центрифугирования шаги с этого момента в разделе 2 должно быть сделано при 4 ° С, чтобы сохранить жизнеспособность клеток.
  5. Передача PPs в 5 мл селезенки Диссоциация средних и инкубировать в течение 15-20 мин при 37 ° С при интенсивном встряхивании при 250 оборотах в минуту. Больше времени инкубации отрицательно скажется на жизнеспособности клеток.
  6. Для создания суспензии отдельных клеток, место PPs на стерильную (автоклавного) 70 мкм нейлоновый фильтр ячейки сетки и насильно молоть ткани в сетку, используя базу поршень от 1 мл шприца. Кроме того, сэндвич-ПП между двумя матовыми стерильные стеклянные предметные стекла (автоклаве в конвертах) и осторожно растереть тканей с возвратно-поступательное движение. С помощью стерильной пипетки передачи для передачи клеточной суспензии в 5 мл трубки Falcon.
  7. Добавить ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ к клеточной суспензии. Выдержите на качалку для5 мин при комнатной температуре.
  8. Слейте клеточной суспензии через второе сито 70 мкм ячейки для удаления остатков сотовых агрегатов или ткани мусора. Сбор клеток в 15 или 50 мл коническую трубку.
  9. Тема клеток нежной центрифугированием (5 мин при 500 мкг). Слейте супернатант и ресуспендирования клеток в потоке буфер, который является фосфатным буферным раствором (PBS), содержащим 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS).
  10. Для определения количества клеток и жизнеспособности, разбавления клеток в 1:10 трипанового синего и осмотрите клетки с помощью светового микроскопа и гемоцитометра. Кроме того, счетчик графиня клетки (Invitrogen) или аналогичный прибор может быть использован для автоматического перечисления числа клеток и жизнеспособность.
    Начиная с 20-25 ПП, этот протокол должен дать> 2,5 х 10 6 общего числа клеток. Это соответствует ~ 0.8-1.2 х 10 6 клеток на мышь.

Антитела маркировки Клетки для проточной цитометрии

<ПР начала = "11">
  • Внесите клеток (10 5 на лунку) в лунки 96-луночных круглым дном тарелку.
  • Тема пластину нежно центрифугированием (5 мин при 1000 мкг), а переливать супернатант осторожно обращения пластины.
  • Ресуспендируют клеток в буфере блока Fc и инкубировать на льду в течение 15 мин. Хотя есть ряд коммерчески доступных буферов Fc блока (например, антимышиным CD16/CD32, BD Biosciences), мы просто используем провели среды от крыс В-клеток гибридомы (ATCC 2.4.G2), которая выделяет моноклональных IgG 1 против мышиных Fcγ рецепторами для этого шага.
  • Тема пластину нежно центрифугированием (5 мин при 1000 мкг), как указано выше, и переливать супернатант осторожно обращения пластины.
  • Добавить флуорофор-конъюгированных антител непосредственно к суспензии клеток в нужном разведении, и инкубировать на льду в течение 30 мин с непрерывным качалке.
  • Тема пластину нежно центрифугированием (5 мин при 1000 мкг), а переливатьсупернатант осторожно обращения пластины.
  • Вымойте клеток с 100 мкл буфера потока.
  • Центрифуга пластины при 1000 х г в течение 5 мин и супернатант сливают, осторожно обращения пластины.
  • Ресуспендируют клеток 400 мкл буфера фиксации, которая состоит из 300 мкл буфера потока и 100 мкл 1% параформальдегидом в PHEM буфера (60 мм труб, 25 HEPES мм, 10 мм EGTA, 4 мМ MgCl 2 при рН 6).
  • Тема клеток проточной цитометрии с использованием FACSCalibur или эквивалент. Анализ результатов с помощью Cell Quest Pro версии 5.2.

    • 3. Подготовка PP Cryosections

    1. В преддверии ткани коллекции, добавить Оптимальная температура резания (ОКТ) соединения 7x7x5 мм пластиковых форм базы. Также подготовить бассейн жидкого азота (> 750 мл) в ведре Дьюара или льда.
    2. Усыпить мыши и выполните laparotamy, как описано выше. Удалить кишечника и место на мокрые бумажные полотенца.
    3. Кизолировать PPs для cyrosectioning, нарезать 0,5 см поперечного сегмента тонкой кишки, содержащие один PP и передачу ткани на чашку Петри, содержащую PBS. Аккуратно промойте полость из этих сегментов с PBS для удаления нежелательных фекальных мусора.
    4. Поместите кишечные сегменты ткани вертикально внутри базы форм содержащие октября Погрузитесь форм в жидкий азот и позволяет ткани, чтобы заморозить полностью (1-2 мин). Цвет октября будет меняться от прозрачного до белого, когда ткань полностью заморожены. . Для более постепенным охлаждением (например, для уменьшения растрескивания OCT), погрузить плесень в ванной изопентана охлаждается жидким азотом паров Примечание: Носить соответствующие защитные очки при работе с жидким азотом.
    5. Удалить замороженных форм базы с жидким азотом с помощью пинцета и позволит формы согреться при комнатной температуре достаточно долго (~ 10-15 сек), чтобы краям блока октября, чтобы смягчить. Чтобы затем удалить замороженные блоком октября отпресс-формы, переверните форму и аккуратно нажмите на спине, чтобы извлечь блок на чистое 4 х 4 см кусок алюминиевой фольги. Сразу обернуть тканью в фольгу и положить в сумку помечены образцы хранятся в жидком азоте или с сухим льдом. Кроме того, передача тканей в морозильной камере (<-20 ° C). Использование ткани в течение недели, в противном случае блоки становятся ломкими с возрастом.

    Cryosectioning

    1. Cryosection ткани с помощью Leica CM3050S cryomicrotome или эквивалент. Температура в камере на криостата должны быть установлены до -21 ° C.
    2. Стремитесь к разделам, которые являются 12-14 мкм в толщину.
    3. Сбор разделов на Fisher SuperFrost Plus (или эквивалент) предметные стекла микроскопа и визуального осмотра с использованием стандартной низкой световой микроскоп власти. Если несколько разделов, которые собираются на слайде, чтобы они сгруппированы вместе для последующих применений окрашивания.
    4. Магазин тОн скользит при комнатной температуре в режиме слайд-бокс и, в идеале, использовать их в течение нескольких дней.

    Антитела маркировки Cryosections и конфокальной микроскопии анализа

    1. Погрузитесь слайды в ацетоне (или метанол) в тканях банку окрашивания или стеллажи на 2 мин. Длительная инкубация может привести к тканям оторваться от слайда.
    2. Передача слайдов в новом банке окрашивания и промыть 3 раза PBS-T (1X PBS с 0,05% Tween-20) в течение 3 минут каждый.
    3. Окружите участки с гидрофобным перо ImmEdge. Это гарантирует, что реагенты и антитела останутся ограничивается этой области во время инкубации.
    4. Инкубируйте слайды в блоке буфера (2% козьей сыворотки в PBS) в течение 30 мин при 37 ° С в увлажненной камере, защищенном от света месте.
    5. Инкубируйте слайды с Fc блок буфера (см. выше) в течение 10 мин при 37 ° C.
    6. Dip слайдов в PBS-T и сухой области вокруг разделы, используя Kimwipes или другие абсорбирующие ткани.Будьте осторожны, не прикасайтесь к фактической срезов.
    7. Наложение срезов ткани с первичным решением антител и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С в увлажненной камере. Первичные антитела, как правило, разводят в блоке буфера до конечной концентрации 20 мкг / мл. Использование непосредственно-меченые антитела первичного желательно, потому что целых три антитела могут быть объединены непосредственно на этот шаг. Непосредственно-меченых антител также устраняет необходимость в дополнительных шагов инкубации антитела.
    8. Wash горки 3 раза (5 мин каждая) путем погружения в PBS.
    9. Если необходимо, инкубировать слайды с соответствующими вторичными антителами в течение 30 мин при 37 ° C в камере влаги.
    10. Wash горки 3 раза (5 мин каждая) путем погружения в PBS.
    11. Инкубируйте слайды в течение 4 минут в 1% параформальдегидом в буфер PHEM, как описано выше.
    12. Промыть слайдов с PBS в течение 1 мин.
    13. Сухая зона вокруг разделы, используя Kimwipes или другие поглощаютных тканей. Будьте осторожны, не прикасайтесь к фактической срезов. С помощью пипетки или капельницы, аккуратно поместите каплю продлить Золотой монтажа средних непосредственно на раздел. Применить стекло покровное на монтажной средой заботясь, чтобы избежать пузырей. Используйте промокательной бумаги, чтобы поглотить излишки монтажной среды.
    14. Печать покровные для микроскопа слайды с коммерческими лак для ногтей и дайте высохнуть на воздухе.
    15. Просмотр слайдов с Leica TCS SP5 или эквивалентной конфокальной микроскопии.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Проточной цитометрии анализа монодисперсных суспензий от общего числа клеток PP показывает четкое различие между хорошей и плохой подготовкой клетки. В хорошем клеточные препараты с более чем 80% жизнеспособность, подавляющее большинство клеток демонстрируют высокую рассеяния вперед (FSC), показатель высокого объема клетки, и низкий разброс стороны (SSC), индикатор низкой детализации ячейки (рис. 2A). В этом эксперименте мы также намеренно подготовили "плохой подготовке ячейки" путем инкубации клеток пр...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    В этой статье мы предоставили параллельных протоколов для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии и функционального анализа и cryosections для иммунной окраски. Оба метода являются высокая воспроизводимость и легко доступны, при условии, цитометра и криостат имеются. Для первых исследователей время следует отметить, что по сравнению с селезенкой, общий выход ячейки из ПП сравнительно скудными. Тем не менее, протокол мы приводим обычно дает от 0.8-1.2 х 10 6 общее PP клеток из одной м...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Нет конфликта интересов объявлены.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы благодарим Renjie Song (Wadsworth центр проточной цитометрии Core) за помощь в анализе клеток и Хелен Джонсон (Wadsworth Центра животных Гистопатология Core) для приготовления парафиновых срезов. Мы благодарим д-р Ричард Э. Коул (Wadsworth Центра световой микроскопии Core) за помощь в конфокальной микроскопии и коллекции изображений. Мы хотели бы поблагодарить Энди Bentley (Wadsworth центр Фото и иллюстрации) за помощь с анимацией.

    MDJ при поддержке Фонда исследований науки о жизни, Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) Fellowship. SA при поддержке Центра Wadsworth-Health Research Инк очной докторской стипендии. Эта работа была частично поддержана грантами NIH HD061916 и GM082978.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Пункт Компания Кат. # Комментарии (по желанию)
    Соединение октября Tissue-Tek 4583
    7x7x5 мм Формы базы Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Слайды Thermo Scientific 4951
    Пограничный Rite лезвия Thermo Scientific 4280L
    Anti-мышь CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-мышь CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-мышь CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-мышь CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti-мышь CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-мышь CD19-PerCP BioLegend 115531
    Сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) без фенола красного Fisher Scientific 14175-079
    70 мкм ячейки фильтра BD Falcon 352350
    Средний селезенки Диссоциация Стволовые клетки технологий 7915
    Коза сыворотке Invitrogen 16210-072
    Fc блока ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes получить из ячейки 2.4.G2 линии
    Изогнутые ножницы FST 14061-09
    Криостат Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Графиня Счетчик клеток Invitrogen
    Гематоксилин Richard Allan 7211
    Эозин Richard Allan 71304
    Формалин Starplex Научные 3661

    Таблица 1. Реагенты и оборудование, используемые в этом исследовании.

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
    2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
    3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
    4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
    5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
    6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
    7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
    8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
    9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
    10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
    11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
    12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225(2011).
    13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040(2012).
    14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Похожие статьи