Оценка Полимерные доставки генов наночастиц наночастиц Анализ отслеживания и высокой пропускной проточной цитометрии

Краткое содержание

Протокол для наночастиц отслеживания анализа (NTA) и высокой пропускной проточной цитометрии для оценки полимерных наночастиц доставки генов описано. НТА используется для характеристики размеров наночастиц распределения частиц и плазмиды в распределении частиц. Высокая пропускная способность проточной цитометрии позволяет количественной оценки эффективности трансфекции для библиотеки биоматериалов доставки генов.

Аннотация

Non-вирусной доставки генов с использованием полимерных наночастиц стала привлекательной подход к генной терапии для лечения генетических заболеваний ¹ и в качестве технологии для регенеративной медицины ^2. В отличие от вирусов, которые имеют значительные проблемы безопасности, полимерные наночастицы могут быть разработаны, чтобы быть нетоксичным, неиммуногенных, не мутагенными, легче синтезировать химически универсальный, способный перевозить большие грузы нуклеиновых кислот и биологически и / или экологические требования. Катионные полимеры самостоятельно собираться с отрицательно заряженной ДНК с помощью электростатического взаимодействия образовывать комплексы порядка 100 нм, которые обычно называют полимерные наночастицы. Примеры биоматериалы используется для формирования наноразмерных поликатионный наночастиц доставки генов включают полилизин, polyphosphoesters, поли (амидоамины) с и полиэтиленимина (PEI), который является неразлагаемых вне-полки катионного полимера обычно используется для доставки нуклеиновых кислот ^1,3. Поли (бета-аминоэфир) с (PBAEs) являются новым классом катионных полимеров ^4, которые гидролитически разлагающиеся ^5,6 и были показаны, чтобы быть эффективным при доставки генов в труднодоступных трансфекции типы клеток, такие как человеческие эндотелиальные клетки сетчатки (HRECs) ^7, мышь эпителиальные клетки молочной железы ^8, человеческий мозг раковых клеток ⁹ и макрососудистых (пупочной вены человека, HUVEC) эндотелиальных клеток ^10.

Новый протокол для характеристики полимерных наночастиц использованием наночастиц отслеживания анализа (NTA) описано. При таком подходе, как распределение частиц по размерам и распределению число плазмид на одну частицу получены ^11. Кроме того, высокую пропускную способность 96-луночный планшет для анализа трансфекции для быстрого скрининга трансфекции эффективности полимерных наночастиц представлены. В этом протоколе, поли (бета-амино эфир) с (PBAEs) используются в качестве модели полимеров и человеческие эндотелиальные клетки сетчатки (HRECs) используются в качестве движениядель клетки человека. Этот протокол может быть легко адаптирована для оценки любых полимерных наночастиц и любой тип клеток интересов в мульти-луночный планшет формата.

Введение

Определение количества плазмид комплекс в наночастицы важно разработать эффективную основе наночастиц доставки генов стратегии, в частности, для совместного осуществления различных плазмид с тем же клетки-мишени, как это часто требуется в перепрограммировании стволовых клеток исследования ^12. Несколько подходов к подсчитать число плазмид, связанные с одной наночастицы были описаны, и каждый подход имеет свои недостатки в методах, используемых для оценки ^13-16. Квантовые точки (КТ) маркировка в сочетании с ТЕА была использована для оценки плазмид на одну частицу в основе хитозана наночастиц. Оценка этой QD техника сложна в связи с необходимостью для обозначения ДНК, который может изменить его самостоятельной сборки свойств; возможность того, что инкапсулированные немеченых ДНК непосредственно не обнаружено; потенциально перекрывающихся плазмид и КТ в 2D-изображений ПЭМ частиц, и другие упрощающие предположения ^13. Альтернативный подход, которыйpplicable при заказе микродоменов существуют в частицы были использованы для изучения Lipopolyamine-комплексов ДНК с помощью крио-электронной микроскопии (крио-TEM), рассеяния рентгеновских лучей и динамического рассеяния света (DLS) ^14,15. К сожалению, материалы, такие как полимерные наночастицы исследовали здесь не применимы с этим методом. . В другом исследовании, Collins и др. использовали изображения потока частиц методики анализа для изучения (Lys) _{16-содержащий} пептид / ДНК, однако их метод может оценить только большие, частиц микронного размера ^16. Таким образом, мы недавно разработали новый и гибкий анализ для количественного определения количества плазмид в наночастицы ^11.

Протокол

1. Сотовые Сеялки

1. Не позволять клеткам расти в overconfluency. Используйте ранних клеток при прохождении трансфекции первичных клеток.
2. Двадцать четыре часа до трансфекции trypsinize клеток, подсчет клеток с использованием гемоцитометр, и развести суспензию клеток со средствами массовой информации для достижения желаемой плотности клеток (клеток / объем). Семенной клеток в культуре ткани ясно обращению с плоским дном 96-луночный использованием водохранилища и многоканальных пипеток. Выбранная плотность должна дать 70-80% слияния в день трансфекции. Например, как показано в Таблице 1, клетки разводили от 25 до 50 клеток / мкл для трансфекции данные, представленные здесь.

2. Трансфекции клеток

1. Разведение полимеров и ДНК запасов. Оттепель полимеров и растворов ДНК складе при комнатной температуре (RT). Разбавить раствор полимера акций и решением ДНК акции, отдельно в чистом 96-луночные использованием двенадцати-канальная пипетка, При соответствующем растворителе к концентрации, необходимые для получения желаемого полимера ДНК весовых соотношениях (вес / вес). В этом случае, выбранный растворитель 25 мМ ацетата натрия (рН = 5,2).
   1. ДНК разведения. Как правило, ДНК хранится в дозе 1 мг / мл разбавляют в буфере ацетата натрия в концентрации от 0,03 до 0,06 мг / мл в ясном не-культуры тканей обработанных 96-луночный планшет (один хорошо для одной формулировке). Таблица 2 показывает, Типичный протокол разведения ДНК для одной формулировки использовали для трансфекции четыре повторных скважин в 96-луночный планшет засевали клетки Шаг 1.
   2. Полимерные разведения. 100 мг / мл полимер / ДМСО раствор разбавляют в буфере ацетата натрия в зависимости от концентрации, необходимой для получения желаемого полимера ДНК вес / вес отношение. Диапазон вес / вес отношения обычно используются для доставки генов с поли (бета-амино эфир) с (PBAEs) составляет от 20 до 100. PBAE полимеров сначала разбавляют до 10 мг / мл, с последующим разбавлением рrotocol, как показано в таблице 3. Полимер разведения могут быть выполнены в четком не-культуры тканей обработанных 96-луночный планшет, который соответствует ориентации образца пластины разведения ДНК.
2. Формирования наночастиц. Добавить PBAE решение равном объеме плазмиды решение ДНК с использованием двенадцати-канальная пипетка и смешать энергично. Пусть смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы позволить самостоятельной сборки.
3. Наночастицы трансфекции. После самосборки, 20 мкл наночастицы добавлены в хорошо капле культуральной среды с использованием двенадцати-канальные пипетки. Повторить скважин лечить или трансфицируют с помощью коммерчески доступных реагентов в качестве контроля. Трансфицированные клетки инкубируют при 37 ° C в течение двух-четырех часов, а затем скважин заменяется свежим СМИ (100 мкл / лунку). Выбор времени инкубации будет зависеть от клеточной линии, условий культивирования, и трансфекции системы. Разница в трансфекцииЭффективность и клеточной токсичности в результате различных инкубационный период будет количественно путем анализа протоколов описано в пункте 3.

3. Анализ эффективности трансфекции и клеточная токсичность

Эффективность трансфекции анализируется визуально с помощью флуоресцентного микроскопа и количественно с помощью проточной цитометрии через сорок восемь часов после трансфекции. Сотовые токсичности проанализированы визуально с помощью флуоресцентного микроскопа и количественно, используя CellTiter 96 водную анализа двадцати четырех часов после трансфекции.

1. Флуоресцентной микроскопии. Визуальный анализ скважин для выражения трансфицированных гена-репортера (например, EGFP или DsRed) при помощи соответствующих флуоресценции канала. Получение изображений для каждой скважины, выбирая поля зрения, надлежащим образом представлять эффективность трансфекции для конкретных составов (рис. 1). Запишите любую ячейку токсичность наблюдается визуально.
2. Проточной цитометрии.
   1. Использование многоканальных пипеток для подготовки 96-луночный планшет для проточной цитометрии. Промыть PBS, trypsinize с 30 мкл / лунку трипсин / ЭДТА, нейтрализовать с 170 мкл буфера FACS (PBS + 2% FBS), пипетки вверх и вниз в каждую лунку, в том числе по краям, и передать весь 200-мкл объема каждой скважине в соответствующие скважины в с круглым дном или V-дно 96-луночный планшет.
   2. Центрифуга пластины при 130 мкг в течение 5 мин при 4 ° C.
   3. Удалить 170 мкл среды из каждой лунки и пипетки для ресуспендирования клеток, избегая при этом пузырьки. Для жизнеспособности пятно, как пропидия йодида (PI), добавить 10 мкл буфера FACS + PI (50:1 FACS буфера: PI разведения; PI складе концентрации 1 мг / мл) в каждую лунку. Немедленно поместите на льду и укрыть от света.
   4. Начать поток C6 Accuri цитометр, HyperCyt 96-а привязанность, и программное обеспечение HyperView. Используйте HyperView Дизайн и протокол вкладки, чтобы выбрать подходящий рпозднего типа, пластины расположение и другие параметры, такие как дрожание / SIP / полоскание / поколебать времени. Для приведенного выше протокола, использовались следующие параметры, предварительно пластину премьер течение одной минуты, и предварительно пластину встряхивают в течение 30 сек при 2400 оборотах в минуту. Sip время было назначено на 15 сек при 15 оборотах в минуту, зонд, промыть каждую лунку в течение 2 сек, а между хорошо встряхнуть каждые 12 скважин в течение 12 сек при 2400 оборотах в минуту. Межскважинной сотрясение важно, чтобы клетки рассеяны в средствах массовой информации, а также для улучшения способности обрабатывать данные, в том числе приурочен перерывах между группами скважин (в данном случае 12 сек).
   5. Используйте HyperView Ну вкладку Идентификация для обработки данных и отдельный в соответствующие скважины (рис. 2). Для того, чтобы определить индивидуальные скважины, с ее помощью можно использовать шума программного обеспечения фильтра, а также включающей в себя базовую даже фильтр под расширенные настройки.
   6. Количественно процент положительно трансфицировали живых клеток соответствующей стробирования для разделения различных поп-ulations (рис. 3). Первый просмотр потока данных на участке разброс FSC против SSC для того, чтобы отдельные клетки от мусора (рис. 3А). Если пропидия йодида (PI) был использован, воротах отдельные популяции клеток и мнение, что данные о заговоре против FSC FL3 того, чтобы отделить живые клетки от мертвых клеток и ворота живых клеток. Для того, чтобы количественно число трансфицированных клеток, просматривать живое клеточной популяции по соответствующим каналам, например, GFP можно увидеть в FL1. Использование необработанной населения, ворота необработанных клетках с целью определения фонового сигнала (рис. 3В). Положительно трансфицированные клетки могут быть выделены с помощью этой ворот и, просмотрев трансфицированных населения с использованием как разброс и контурные графики (рис. 3C и 3D). Там может быть континуум положительно трансфицированные клетки, так как различные клетки будут трансфицировали в разной степени флуоресценции.
3. CellTiter 96 водную анализа
   1. Трансфекции другую тарелку точно таким же образом для измерения клеточной токсичности.
   2. Премикс 1 мл CellTiter 96 водную анализ решение с 10 мл свежей среды. Удалите носитель из клетки и использовать многоканальную пипетку, чтобы добавить 110 мкл предварительно смешанный раствор + СМИ на лунку.
   3. Измерить абсорбцию при 490 нм каждый час интервале от 1 до 4 часов, пока поглощение из скважины с необработанными условия в линейном диапазоне анализа. Включите четыре контрольных скважин с единственным решением + носитель для чтения поглощения фона.
   4. Среднее значение оптической плотности от четырех повторных скважин в состояние, и вычесть среднюю абсорбцию фоне друг от среднего. Нормализация исправлены среднем на каждого рассматриваются условия, чтобы исправить средней необработанной условия для определения жизнеспособности процентов клеток.

_title "> 4. наночастиц размеров с NTA и плазмиды по расчетам частиц

1. Премьер-системы струйной из NanoSight NS500 путем запуска насоса разбавителя вперед примерно на 1/5th максимальная скорость и образец насоса в обратном направлении примерно на 1/10th максимальной скорости. Продолжайте, пока система струйной промывают растворителем.
2. Подготовка наночастиц для анализа. В случае PBAEs, отдельно разбавить складе ДНК плазмиды (1 мг / мл) и фондовых PBAE (100 мг / мл) в буфере ацетата натрия (25 мМ, рН 5) в пробирках Эппендорф.
3. Развести концентрации ДНК плазмиды до 0,06 мг / мл. Концентрация полимера может варьироваться в зависимости от требуемого веса веса полимера с ДНК (например, в течение 60 вес / вес частиц полимера разбавляют до 3,6 мг / мл).
4. Добавить раствора полимера в равном объеме плазмиды решение ДНК и смешать энергично. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы позволить самостоятельной сборки.
5. Diлютне наночастиц решение 100-кратного в PBS для того, чтобы концентрация наночастиц, чтобы быть в соответствующем диапазоне NTA и получить конечный объем не менее 500 мкл.
6. Загрузка образца в NanoSight путем размещения загрузки трубы в образец Eppendorf трубки (рис. 4а). Убедитесь в том, чтобы не вводить пузырьки воздуха.
7. В режиме захвата, увеличение камеры до уровня частицы могут быть видны. Отрегулируйте фокус, так что частицы выглядят гладкими (рис. 4а и 4б).
8. В то время как в стандартном режиме, настроить камеру уровню прошлого точки, что все частицы можно увидеть на экране. Затем уменьшите камеру уровня до самого низкого уровня таким образом, что частицы могут все еще быть соблюдены. Если средний уровень требуется камера, перейдите в расширенный режим и изменить затвора камеры и получить на соответствующих уровнях.
9. Визуально проверить, чтобы убедиться, есть между 20 - 100 частиц на сcreen. Идеальный номер для отслеживания наночастиц составляет около 50 частиц. Если есть слишком много или слишком мало, промойте NS500, отрегулируйте разведения в PBS, и вновь загрузить образца.
10. Отрегулируйте захвата продолжительность в соответствии со стандартной таблицей режиме. Обычно 30 - 60 сек соответствующей длины захвата (рис. 4В).
11. Для загрузки следующего образца, промыть систему, а затем вновь загрузить нового образца.
12. Как только видео в плен, переходите к стадии обработки, открыв видео-файл.
13. Есть ряд параметров, которые могут быть настроены для наилучшего обработки видео (рис. 4в). Цель состоит в том, чтобы выбрать параметры, которые наилучшим захватить каждую частицу на экране, как показано красным крестиком на экране над каждой частицей (рис. 5).
14. Увеличение экрана усиления, чтобы лучше видеть частиц. В соответствии со стандартной или расширенный режим, выберите автоматической настройки для параметров clickinг соответствующие поля. В случае, если автоматические настройки не совсем адекватно выбрать частиц, повторно щелкните поле и вручную установить параметры (рис. 4в).
15. После того как все частицы собираются на экране, нажмите кнопку процессе программного обеспечения для обработки видео файлов (рис. 4в). Это обеспечивает распределение частиц по размерам, размер средних, а также концентрация частиц.
16. Для того, чтобы убедиться, что концентрация частиц является точной, изменить разведения PBS, например, путем увеличения разбавления 2x, и повторите описанную выше процедуру. Измерение нескольких разведений того же образца рекомендуется убедиться, что измерение концентрации образца является точной. Хороший диапазон измерения 10 ⁷ -10 ⁹ частиц / мл.
17. Убедитесь, что все плазмиды были включены в наночастицы, запустив гель-электрофореза наночастиц и оценке ли свободной ДНК присутствует.Если не все плазмиды инкапсулированные, используя стандартные методы для измерения поглощения ДНК для того, чтобы количественно общего инкапсулированные плазмид.
18. Для расчета среднего числа плазмид на одну частицу, разделить общее инкапсулированные плазмиды концентрации НТА измеренной концентрации частиц. Для того чтобы оценить плазмиды в распределении образца частицы, сначала использовать размер частиц НТА гистограммы для расчета объемной доли каждого 1-нм бен частиц. Умножьте это распределение объемной долей на общую сумму плазмиды, чтобы получить число плазмид в каждой корзины. Разделите эти цифры на количество частиц в каждом мусорное ведро, чтобы получить число плазмид за частицей для каждого размера частиц (рис. 6).

Результаты

На рисунке 1 показано изображение флуоресценции микроскопии пример успешной трансфекции HRECs с EGFP плазмиды. Образ светлого полезно убедиться, что клетки сохраняют свою обычную морфологию. Кроме того, жизнеспособность клеток анализы, такие как МТС или аналогичные анализы, может быть использована для оценки токсичности наночастиц ^7. Проточной цитометрии, как описано выше, может быть использована для количественной оценки эффективности трансфекции. При использовании HyperCyt мульти-и крепежну...

Обсуждение

Протоколы выше, описывают методы оценки эффективности трансфекции наночастиц составов, а также способ охарактеризовать размер частицы и ДНК загрузки наночастиц. Количество плазмид на одну частицу является важным параметром, который может помочь предсказать эффективность частиц, а также может быть использован для определения дозы. Анализ наночастиц отслеживания могут быть выполнены в диапазоне различных водных растворов, таких как различные по концентрации соли. Часто эта характеристика выполняется в PBS, чтобы имитирова...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
			Реагент
Фосфатным буферным раствором, 1x (PBS)	Invitrogen	10010
EGM-2MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Трипсин	Invitrogen	25300
Буфере ацетата натрия	Sigma-Aldrich	S7899	Разбавить до 25 мм в деионизированной воде
Диметилсульфоксид	Sigma-Aldrich	276855
pEGFP ДНК	Элим Biopharmaceuticals	Не Доступно
DsRed ДНК	Addgene	21718
PEI, разветвленные	Sigma-Aldrich	408727
CellTiter 96 водную	Promega	G3580
			Материалы
Ясно плоским дном 96-луночный планшет, стерильный	Sarstedt	82.1581.001
Ясно круглым дном 96-луночный планшет, стерильный	Sarstedt	82.1582.001
12-канальный Finnpipette	Thermo Scientific	Не Доступно	5-50 и 50-300 мкл
Флуоресцентного микроскопа	Zeiss	Не Доступно	Номер модели: AX10
C6 Accuri проточной цитометрии	BD Biosciences	Не Доступно
HyperCyt вложения	Intellicyt	Не Доступно
NS500	NanoSight	Не Доступно