Новорожденных субвентрикулярной Electroporation зоны

Summary

Мы демонстрируем минимально инвазивной техники называют новорожденных субвентрикулярной электропорации зоне. Методика заключается во введении плазмидной ДНК в боковых желудочков у новорожденных щенков и применение электрического тока для доставки и генетически манипулировать нервных стволовых клеток

Abstract

Нервные стволовые клетки (НСК) линии послеродового боковых желудочков и приводит к нескольким типам клеток, которые включают нейроны, астроциты и клетки эпендимных ^1. Понимание молекулярных путей, ответственных за НСК самообновлению, целеустремленность и дифференциация имеет решающее значение для освоения их уникальные возможности для восстановления мозга и лучше понять расстройства центральной нервной системы. Предыдущие методы манипуляции системах млекопитающих требуется много времени и средств деятельности генной инженерии в целом уровень животного ^2. Таким образом, подавляющее большинство исследований изучили функции молекулы НСК в пробирке или в беспозвоночных.

Здесь мы покажем, простой и быстрый метод управления новорожденных NPCs, что называют новорожденных субвентрикулярной зону (СВЗ) электропорации. Подобные методы были разработаны десять лет назад для изучения эмбриональных НСК и помогли исследования по corticaл развитие ^3,4. Совсем недавно это был применен для изучения послеродовой мозга грызунов ^5-7. Этот метод приводит к надежной маркировки SVZ НСК и их потомства. Таким образом, послеродовое SVZ электропорации предоставляет стоимость и время эффективной альтернативой для млекопитающих НСК генной инженерии.

Protocol

Эта процедура осуществляется в соответствии с требованиями Йельского IACUC. Ученые должны убедиться, что IACUC руководящие принципы были утверждены и затем в соответствии с их институциональными требованиями.

1. Раздел 1. Получение ДНК, решения и стеклянных пипеток

1. Создание высокой чистоты (OD 260/280> 1,80) высокой концентрации (мкг / мкл> 2,5) эндотоксина ДНК.
2. Подготовка 0,9% солевой раствор и стерильных фильтров через 22 мкм фильтр.
3. Место 10 см граненые боросиликатного стеклянные капилляры (OD: 1,5 мм, ID: 1,10 мм) в модели PP-830 Narishige PC-10 Съемник стеклянной пипетки с проводом Kanthal. Установить с....

Results

Новорожденных субвентрикулярной зоне электропорации результатов в маркировке почти все радиальные глии смежных с дорсальной, верхних боковых и боковых субвентрикулярной зоне после «зачистки» движения пинцет электрод (рис. 1E). Тем не менее, электропорации могут быть адаптированы к требованиям соответствующего эксперимента, но не радикальные электродов и использования конкретного расположения и ориентации, как описано в видео. Например, так как сверху локализованные радиальной глии отличаются от тех, под.......

Discussion

Здесь мы подробно технику новорожденных электропорации SVZ, технику, быстро и надежно маркировать и манипулировать SVZ стволовых клеток и их потомства. Есть несколько преимуществ, которые электропорации имеет по сравнению с другими методами. Во-первых, учитывая координационного маркировки клеток, человек способен различать клетки автономным и не-клетки автономных эффектов. Во-вторых, генетические манипуляции с использованием индуцибельной системы позволяет сравнить эффекты до или после синаптической интеграции. Кроме то.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Тяжелые полированные трубы из боросиликатного	Саттер инструменты	BF150-110-10
Двухступенчатая стекла микропипетки съемник	Narishige	PC-10H
Быстрый зеленый	Фишер Научные	0521192205
ECM 830 квадратных волны генератора импульсов	Harvard Apparatus	45-0052
Tweezertrodes	Harvard Apparatus	45-0488
Волоконно-оптический источник света	Fisher Scientific	12-562-36
Вольфрамовые галогенныелампа	USHIO America, Inc	1002247
Picospritzer II	Паркер инструменты	052-0312-900