Хромосома Подготовка из культивируемых клеток

Краткое содержание

Хромосомы могут быть выделены из живых клеток, таких как лимфоциты или фибробластами кожи, и из организмов, включая человека или мышей. Эти препараты хромосом могут быть дополнительно использованы для рутинного G-диапазонов и молекулярных цитогенетических процедур, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), сравнительной геномной гибридизации (CGH) и спектральной кариотипирование (SKY).

Аннотация

Хромосомный анализ (цитогенетический) широко используется для обнаружения хромосомной нестабильности. При последующей G-диапазонов и молекулярных методов, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), этот анализ имеет мощную способность анализировать отдельные ячейки для аберраций, которые включают доходы или потери части генома и перестроек с участием одного или нескольких хромосом. У людей, хромосомные отклонения происходят в примерно 1 на 160 живорожденных ^1,2, 60-80% всех выкидышей ^3,4, 10% мертворождений ^2,5, 13% людей с врожденным пороком сердца ^6, 3-6% случаев бесплодия ^2, и у многих пациентов с задержкой развития и врожденных дефектов ^7. Цитогенетический анализ злокачественности обычно используется исследователями и врачами, как наблюдения клоновых хромосомных аномалий, как было показано, чтобы иметь как диагностическую, так и прогностическую значимость ^8,9.60; изоляция Хромосома имеет неоценимое значение для генной терапии и стволовых клеток исследования организмов, включая приматов и грызунов ^10-13.

Хромосомы, могут быть выделены из клеток живых тканей, в том числе лимфоцитов крови, фибробласты кожи, amniocytes, плаценты, костный мозг, и образцов опухоли. Хромосомы проанализированы на стадии метафазы митоза, когда они больше всего конденсируется и, следовательно, более четко видны. Первым шагом в технике изоляции хромосома включает разрушение шпинделя волокон путем инкубации с Colcemid, чтобы предотвратить клетки от переходить к следующей стадии анафазе. Затем клетки обрабатывали гипотонического раствора и сохраняется в набухшем состоянии с фиксатором Карнуа. Затем клетки сбрасываются на слайдах и затем может быть использован для различных процедур. G-полосы включает обработку трипсином с последующим окрашиванием Гимза создать характерный светлых и темных полос. То же прocedure изолировать хромосом могут быть использованы для подготовки клеток для процедур, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), сравнительной геномной гибридизации (CGH) и спектральной кариотипирование (небо) ^14,15.

Введение

Хромосомный анализ представляет собой обычный метод используется во всем мире для диагностики хромосомной нестабильности и перестройки, приводящие к генетическим нарушениям и злокачественностью ^1,2,8,9. Кроме того, более высокое разрешение для диагностики и исследования конституционных и рак приобрела генетических аномалий может быть достигнуто с помощью комбинации классических цитогенетических процедур и молекулярных цитогенетических методик, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), сравнительной геномной гибридизации (CGH) , и спектральный кариотипирование (SKY) ^14,15. В последнее время эти методы были использованы для оценки хр....

Протокол

1. Хромосома Заготовка прилипшие клетки

1. Стандартный протокол
   1. Рост клеток в соответствии с конкретными условиями культивирования клеток. Когда клетки достигли логарифмическую фазу (80% слияния), добавить 10 мкл / мл Colcemid к клеточной культуральной колбе. Минимум 2 х 10 ⁶ клеток рекомендуется.
   2. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубатора в течение 45 мин. С помощью стерильной пипетки перенос носитель из клеток в 15 мл коническую пробирку. Отложите.
   3. Осторожно промыть клетки путем добавления 2 мл HBSS буфера в колбу. Вихревой буфер, а затем удалить с помощью пипетки. Откажитесь.
   ....

Результаты

Высокое качество метафазных имеют важное значение для хромосомного анализа. Успешный тест дает хромосомы, которые хорошо распространяются и о подходящей морфологии хромосом. Правильно G-полосчатые хромосомы содержат характерную светлые и темные набора полос.

Рисунок 1. Успешная хромосомные распростр.......

Обсуждение

Мы использовали существующую процедуру для изоляции хромосом из клеток различных организмов, в том числе различные типы клеток, полученных из человеческих, макак-резус, крыс и мышей ^11,20-22. Стандартный протокол обеспечен, но некоторые ключевые этапы и переменные, возможно, должны быть приспособлены для этих различных типов клеток. Несколько конкретных шагов имеют решающее значение как в подготовке хромосомной и G-полосы, чтобы обеспечить наилучшее качество результатов. Одна из переменных, которые могут повл.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS Buffer	Gibco	24020-117
0,5% Трипсин ЭДТА 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Буферные таблетки "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Центрифуга 5810	Eppendorf
Methanol	Caledon Laboratory Chemicals	6700130
ледяная уксусная кислота	Krackeler Scientific Inc.	Тел.: 11-9508-05