Выделение предсердия человека Миоциты для одновременных измерений Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Переходные и мембранные токи

Niels Voigt; Xiao-Bo Zhou; Dobromir Dobrev

doi:10.3791/50235

Методическая статья

Выделение предсердия человека Миоциты для одновременных измерений Ca

22.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50235

⸱

3 июля 2013 г.

Niels Voigt^*¹^,² , Xiao-Bo Zhou^*² , Dobromir Dobrev¹^,²

¹Institute of Pharmacology, University of Duisburg-Essen , ²Division of Experimental Cardiology, University of Heidelberg

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы описывают выделение предсердия человека миоцитов, которые могут быть использованы для внутриклеточного Са^{2 +} Измерения в сочетании с электрофизиологические патч-зажим исследований.

Аннотация

Изучение электрофизиологических свойств ионные каналы сердца с патчем метода фиксации и исследования сердечных сотовой Ca ^{2 +} обработка аномалий требует изолированных кардиомиоцитов. Кроме того, возможность исследовать миоциты от пациентов с помощью этих методов является бесценным требованием выяснить молекулярные основы сердечных заболеваний, таких как фибрилляция предсердий (ФП). ¹ Здесь мы опишем метод выделения предсердия человека миоцитами которые подходят как для патч-зажим исследований и одновременные измерения внутриклеточной концентрации Са ^{2 +.} Во-первых, правом предсердии придатков, полученных от пациентов проходят операции на открытом сердце рубят на мелкие куски ткани ("кусок метод") и промывают в Ca ^{2 +-бесплатное} решение. Затем куски ткани перевариваются в коллагеназы и протеаз содержащие растворы с 20 мкМ Ca ^{2 +.} После этого изолированных миоцитах являются ХарвеСтади фильтрацией и центрифугированием суспензии ткани. Наконец, концентрации Са ^{2 +} в растворе для хранения газа регулируется ступенчато до 0,2 мМ. Кратко рассмотрим значение Ca ^{2 +} и Ca ^{2 +} буферизации во время процесса выделения, а также предоставить представителю записи потенциалов действия и мембранных токов, как совместно с одновременным Са ^{2 +} переходных измерений, выполненных в этих изолированных миоцитов.

Введение

Изучение электрофизиологических свойств ионные каналы сердца с патчем метода фиксации и исследования клеточных аномалий Ca ^{2 +} обработка требует изолированных кардиомиоцитов. Они обычно получают после экспозиции в пробирке сердечной образцы тканей пищеварительных ферментов (коллагеназы, гиалуронидазы, пептидазы и др.). С первым докладом изоляции жизнеспособных кардиомиоцитов в 1955 году ² большое количество протоколов было разработано для того, чтобы собрать одну предсердий и желудочков кардиомиоциты из различных видов, включая мыши, крысы, кролики, собаки, морские свинки и человека. В этом обзоре мы сосредоточены на изоляцию предсердия человека миоциты. Что касается процедур, для изоляции миоциты от других видов, мы ссылаемся на "Уортингтон ткани Диссоциация руководство", предоставленные Уортингтон Биохимические корпорации, США ( www.tissuedissociation.com ).

человека предсердий миоцитов протоколов изоляции обычно получают из способа, описанного Бустаманта и соавт. ³ Здесь мы предлагаем шаг за шагом, описание методики, которая выполнена с ранее опубликованным методом, для того чтобы получить миоциты предсердий подходит не только для патч-зажим экспериментов, но и для одновременного внутриклеточного Са ^{2 +} измерений. ^4-11

Протокол

Экспериментальные протоколы должны быть одобрены местным комитетом по этике, и все пациенты должны дать письменное информированное согласие. Наше исследование было одобрено комитетом по этике Медицинского факультета Мангейм, Гейдельбергский университет (# 2011-216N-МА) и была выполнена с соблюдением всех институциональных, национальных и международных руководящих принципов для благосостояния человека. Все пациенты дали письменное информированное согласие.

0. Получение ткани предсердий человека

Во время рутинных процедур катетеризации у пациентов, перенесших операции на открытом сердце для сердечно шунтирования, кончик ушко правого предсердия обычно удаляется и может быть использован для изоляции кардиомиоцитов предсердия. После удаления образца ткани передается сразу в 50 мл трубки сокола стерильной Ca ^{2 +-бесплатное} решение транспортной содержащих 2,3-бутандиона monoxime (табл. I; BDM, сократительная ингибитора, предотвращая миоцита Contracture). С транспортом раз от 30 до 45 минут, мы не признавали явное преимущество охлаждения или оксигенации в отношении как количества и качества изолированных кардиомиоцитов предсердия. В общем транспорте в лабораторию должен быть как можно быстрее. Однако, если больше времени перевозки не может быть предотвращено, транспорта при 4 ° С в кислороде решение может быть выгодным.

1. Prearrangements

Включите thermocirculator, который контролирует температуру рубашкой стакан (табл. II). Убедитесь, что температура в стакане равна 37 ° С. Стакан накрывают стеклом крышкой для поддержания постоянной температуры в химическом стакане в течение всего процесса изоляции.
Взвесьте Коллагеназа я и протеазы XXIV на три стеклянные стаканы и хранить его при комнатной температуре. Ферменты будут разбавлены перед использованием.
Магазин 20 мл Са ^{2 +} бесплатное решение в чашке Петри при 4 ° C.
Магазин 250 мл Ca ^{2 +,} свободное решение на водяной бане при 37 ° С.

2. Очистка ткани

Передача образца ткани вместе с транспортного решения в чашку Петри (~ 10 см в диаметре) и удалить жировой ткани примерно помощью ножниц.
Взвесьте образец ткани. Между 200 и 600 мг используются для выделения клеток. Остальные ткани могут быть заморожены в жидком азоте для последующего биохимического анализа.
Передача образца ткани в чашку Петри, содержащую 20 мл Са ^{2 +} свободном растворе при 4 ° С (см. шаг 1.3) и нарезать образец ткани на мелкие куски приблизительно 1 мм ³ в размере.
Следующие шаги должны быть выполнены при 37 ° С и при непрерывном газом со 100% O _2. Кончиком пипетки могут быть размещены на кислородную трубку, чтобы избежать сильных бурлит и генерировать непрерывный поток воздуха.
Передача ткани куски вместе с Ca ^{2 +-бесплатное} решение вс рубашкой химический стакан и тщательно перемешать в течение 3 мин с помощью магнитной мешалки.
Остановите перемешивание и позволяют куски ткани, чтобы успокоиться в течение нескольких секунд. Тщательно штамм супернатанта через нейлоновое сито (200 мкм, таблица II). Вернуться сдержанным куски ткани из сетки в стакан с помощью щипцов.
Заполнить стакан с Са ^{2 +} бесплатное решение и повторите стадию промывки 2.4 и 2.5 в два раза.

3. Первая ферментативного расщепления

Повторное приостановить куски ткани с 20 мл Раствор фермента E1 (табл. I), содержащий коллагеназы и протеаз и тщательно перемешайте в течение 10 мин.
Добавить 40 мкл 10 мМ CaCl ₂ раствором с получением конечной концентрации 20 мкМ Ca ^{2 +.}
Через 35 минут штамм супернатант осторожно через нейлоновое сито (200 мкм, таблица II) таким образом, что большинство кусков ткани остаются в химическом стакане. Вернуться остальноедождь кусков ткани из сетки в стакан.

4. Второй ферментативного расщепления

Ресуспендируют ткани куски снова с 20 мл раствора фермента E2, содержащем коллагеназу я только (таблица I). Добавить 40 мкл 10 мМ CaCl _2, раствор немедленно, чтобы получить конечную концентрацию 20 мкМ Ca ^{2 +.}
Во время второго использования ножниц пищеварения дальнейшего нарезать ткани сгустки иногда.
Через 5 мин взять пробу помощью пипетки Пастера проверить диссоциации клеток. Повторите это каждые 2-3 мин до палочковидных, поперечно-полосатой кардиомиоцитов не появляются.
Остановите перемешивание и позволяют куски ткани, чтобы успокоиться в течение приблизительно 20-30 сек.
Штамм супернатант осторожно через нейлоновое сито (200 мкм, таблица II) в 50 мл сокола трубу (трубы). Вернуться сдержанным куски ткани из сетки в стакан.
Повторное приостановить куски ткани в стакан с 20 мл StoraGE растворе (таблица I) ¹⁰ и далее клетки диссоциируют, осторожно механическим растиранием с использованием 20 мл серологической пипеткой с дозатором. Старайтесь избегать образования пузырьков, так как пузырьки вредны для выживания клеток и качество.
Штамм супернатант осторожно через нейлоновое сито (200 мкм, таблица II) в 50 мл сокола трубки (трубы B).

5. Окончательная подготовка и настройка Final концентрации Са ^{2 +}

Центрифуга как Сокол труб А и В (см. шаг 4.5 и 4.7) при 95 мкг в течение 10 мин.
Удалить супернатант из обеих труб тщательно аспирации. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок. Удалите супернатант.
Повторное приостановить как гранул, в 1,5 мл решение для хранения данных (табл. I) каждый (комнатной температуры).
Добавить два раза 7,5 мкл 10 мМ CaCl ₂ раствора в каждую Фалькон и тщательно перемешать. Инкубируют в течение 10 мин после каждого шага.
Добавьте 15 мкл 10 мМ CaCl _2, раствор для получения конечной концентрации Са ^{2 +} 0,2 мМ.

6. Загрузка Миоциты с флуоресцентным Ca ^{2 +-индикатор} Fluo-3 утра (рис. 1)

Передача 1,5 мл клеточной суспензии (труба и / или трубка B) в 2 мл микроцентрифужных трубки (Eppendorf трубки).
Следующие шаги должны быть выполнены на рассмотрении в световой чувствительности флуоресцентного Са ^{2 +} Индикатор Fluo-3.
Растворить 50 мкг мембранного проницаемой ацетоксиметил производное сложного эфира Fluo-3 (Fluo-3 утра, таблица III) в 44 мкл Pluronic F-127 (таблица III) исходного раствора (20% вес / объем в безводном ДМСО), чтобы получить 1 мМ Fluo-3 утра маточного раствора, который можно хранить при -20 ° С в течение не более 1 недели.
Добавить 15 мкл Fluo-3 утра маточного раствора в микроцентрифужных пробирку, содержащую 1,5 мл клеточной суспензии (см. шаг 6.1) и взбалтываюттщательно.
Инкубируйте клеточной суспензии в течение 10 мин в оптически непрозрачные окна.
Коротко о центрифуге при 6000 оборотов в минуту.
Удалите супернатант и вновь приостановить осадок в 1,5 мл раствора ванны (табл. IV).
Оставьте клеточной суспензии в течение примерно 30 мин в течение деэтерификации, перед началом экспериментов.

7. Одновременное Патч-зажим и Epifluorescent Ca ^{2 +} Измерения

Так как патч-зажим измерения не основной темой этого обзора, мы отсылаем заинтересованного читателя к другим публикациям обеспечивая более глубокое описание этой техники. ^11-14 Для полноты картины мы предоставляем краткий обзор протокола для измерения потенциалы действия или L-типа Ca ^{2 +} токи, как совместно с одновременным Ca ^{2 +} переходных записей.

В ходе экспериментов миоциты орошали при 37 ° С с ванной решенина (табл. IV) с помощью системы быстрого перфузии (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Для фиксации потенциала экспериментов, K ⁺ токов блокировали добавлением 4-аминопиридин (5 ммоль / л) и BaCl ₂ (0,1 ммоль / л) в растворе ванны. Микроэлектродах боросиликатного стекла используются и должны были чаевые сопротивлений 2-5 МОм при заполнении пипетки раствор (табл. V). В дополнение к Fluo-3 утра загрузку миоцитов (см. шаг 6), Fluo-3, также включена в растворе пипетки (таблица V). Возбуждении флуоресценции при 488 нм и испускаемого света (<520 нм) преобразуется в [Ca ^{2 +]} _я предполагая

figure-protocol-1

где KD ₌ константа диссоциации Fluo-3 (N 864М), F = Fluo-3 флуоресценции;. F _макс = Са ^{2 +-насыщенной} флуоресценции, полученного в конце каждого эксперимента ¹² Оба электрических сигналов и epifluorescent Са ^{2 +} сигналы записываются одновременно. Потенциалы действия стимулируются с частотой 0,5 Гц в текущем зажим режиме с использованием 1 мс импульсы тока силой 1.2x порог. L-типа Ca ^{2 +} токи измеряются напряжения зажим режиме с помощью удерживающего потенциала -80 мВ и 100 мс разгона импульса до -40 мВ для инактивации быстро Na ^+-ток, а затем 100 мс Тест-импульса до +10 мВ при 0,5 Гц.

Результаты

На рисунке 2а три представителя примеры из изолированного правого предсердия человека миоциты. Для количественного выхода клеток мы пипеткой 10 мкл клеточной суспензии (шаг 5.5) на предметном стекле микроскопа CellFinder ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Средний выход клеток на Фиг.2В, ясно показывают, что существует тенденция к снижению урожайности ячейки в хронической ФП (CAF) образцов пациентов (трубки: 16,5 ± 3,1 клеток/10 мкл (п = 29) против 5,1 ± 2,3 клеток/10 мкл (N = 10) в SR и CAF, соответственно, р <0,05; трубки B: 17,9 ± 3,9 клеток/10 мкл (N = 29) по сравнению с 5,9 ± 2,0 клеток/10 мкл (n = 9) в SR и кафе, соответственно, р = 0,107).

Характерные примеры потенциала действия измерений и одновременной регистрации цитозольные Са ^{2 +} переходных процессов приведены на рисунке 3. Примерно 90% исследованных клетках, тОн потенциала действия инициируется Са ^{2 +} вызывает четкие и регулярные схватки клетки. Как сообщалось ранее, мембранный потенциал покоя, который является общепринятым показателем целостности клеток, в среднем около -73,9 ± 2,7 мВ (N = 23/10 миоцитами / пациентов) и -77,7 ± 1,8 мВ (N = 19/8 миоцитов / пациентов ) в SR и CAF соответственно (р> 0,05). ¹⁵ Рисунок 4 показывает представитель одновременной регистрации напряжения закрытого типа L-Ca ^{2 +} токов и цитозольные Са ^{2 +} переходных процессов. Применение неселективных β-адренорецепторов изопреналин (1 мкМ) увеличивает амплитуду и я, _{Ca, L} и цитозольные Са ^{2 +} переходных процессов, предполагая нетронутыми β-адренорецепторов сигнала каскада.

figure-results-1
Фаigure 1. Технологическая схема миоцитами Fluo-3 утра загрузке протокола (см. шаг 6.1-6.5). т / х, масса / объем.

figure-results-2
Рисунок 2. , Isolated правого предсердия человека миоцитов после одного часа в хранении раствора. B, среднее значение ± SEM из выход клеток подсчитывали в 10 мкл клеток в хранении раствора (см. шаг 5.5). н относится к числу препаратов внутри каждой группы. * Р <0,05.

figure-results-3
Рисунок 3. Представитель записи потенциала действия запускаемых Са ^{2 +} переходных процессов (КПП) в предсердных миоцитов из синусового ритма и CHRОНИК предсердия пациента аритмии. Топ: Литьевая мембранного тока (I _M), используемый для стимуляции (0,5 Гц). Внизу: Одновременная запись мембранного потенциала (V _M), и вызвал кот (снизу). (Перестроенный с разрешения Фойгт и соавт. 2012) ¹⁵

figure-results-4
Рисунок 4. Представитель записи изопреналин (1 мкМ) влияние на L-типа Ca ^{2 +} ток-срабатывает Са ^{2 +} переходных процессов (КПП) в предсердных миоцитов из синусового ритма и хронической формой фибрилляции пациентов. Top: напряжения зажим протокол (0,5 Гц). Ниже: одновременная запись от общего объема чистой мембранной тока (I _M), в основном отражающие L-типа Ca ^{2 +} ток (в центре) и вызвал кот (снизу). (Перестроенный с разрешения Фойгт,и соавт. 2012) ¹⁵

figure-results-5
Таблица I. Решения.

figure-results-6
Таблица II. Специальное оборудование.

figure-results-7
Таблица III. Вещества для загрузки миоцитов с Fluo-3 утра.

figure-results-8
В таблице IV. Ванна решение для патч-зажим.

figure-results-9
Таблица В. пипетки решение для патч-зажим *.

Обсуждение

Здесь мы опишем метод выделения предсердия человека миоциты из правого предсердия придатков, полученных от пациентов проходят операции на открытом сердце. Для того, чтобы использовать эти миоциты для измерений цитозольного Са ^{2 +} мы адаптировали ранее описанного метода ^4-11, исключив из ЭГТА решение для хранения данных.

Уже в 1970 году было отмечено, что хотя миоцитами диссоциируют в присутствии ионов Са ^{2 +} в процессе пищеварения, и все они были в контрактуры и нежизнеспособные. ^16,17 Таким образом, изолятор выполняется в Ca ^{2 +-бесплатное} решение. Тем не менее, повторное введение физиологических концентрациях Са ^{2 +} привело к быстрому Ca ^{2 +} притока и гибели клеток. Это было описано как Са ^{2 +} парадокс явление, которое первоначально было наблюдать в перфузии сердца Zimmerman и Hulsman. ¹⁸ Модификации изоляции носителей, включая снижение рН до 7,0, <вир> 19 добавление таурина ²⁰ или небольшого количества Са ^{2 +} (см. шаг 3.2 и 4.1) ^21, а также хранение изолированных миоцитах в EGTA содержащий хранение раствора ²² было предложено, чтобы предотвратить Са ^{2 +} парадокс ^17. Однако хорошо известно, что Са ^{2 +} буферизации через EGTA уменьшает амплитуду L-типа Ca ^{2 +,} индуцированного током Са ^{2 +} переходных амплитуд и приводит к двухфазной распада Са ^{2 +} переходных процессов. ²³ Поэтому опущены EGTA на протяжении всего процесса изоляции для получения Са ^{2 +} переходных процессов с типичными свойствами и монофазные распадов. Чтобы защитить клетки от Са ^{2 +} парадокс мы не увеличилось конечной концентрации Са ^{2 +} из раствора для хранения постадийно до 0,2 мМ.

Выбор коллагеназы, вероятно, наиболее важным шагом для успешного миоцита изоляции. Обычные Collagenases в неочищенных препаратах, полученных из Clostridium histolyticum и содержащих коллагеназу в дополнение к ряду других протеиназ, polysaccharidases и липазы. На основе их общей коллагеназам состава подразделяются на несколько типов. ⁺²⁴ Уортингтон коллагеназы типов I и II были успешно использованы для изоляции человека предсердий миоциты. ^{4-10,15,25-30} В нашем описываемом протоколе мы рекомендуем использовать коллагеназы Тип I, хотя мы также смогли получить приемлемые количества жизнеспособных клеток с использованием коллагеназы типа II. Тем не менее, даже в пределах одного типа коллагеназы, существует значительный от партии к партии изменение в отношении ферментативной активности. Эти изменения требуют тщательного выбора партии и тестирования различных партий для оптимизации выделения. Онлайн доступны пакетной инструментом выделения из Уортингтон Биохимические корпорации ( http://www.worthington-biochem.com / СМС / match.php) могут быть использованы для поиска доступных пакетах с составом, который, как было показано быть пригодны для выделения человеческого предсердного миоцитов. В настоящее время мы используем коллагеназы типа I с 250 ед / мг активности коллагеназы, 345 ед / мг caseinase деятельности, 2,16 ед / мг клострипан деятельности и 0,48 ед / мг триптическому деятельности (лот № 49H11338).

Клетки, полученные с использованием процедуры, описанной в этой рукописи может быть использована в течение 8 ч в течение патч-зажим исследований, Са ^{2 +} переходных измерений и их комбинации. ¹⁵ Кроме того, эти клетки позволяют измерять сотовой сжатие в ответ на электрическое стимулирование поле или электрической стимуляции с использованием патч-зажим пипетки (неопубликованные наблюдения).

Раскрытие информации

Уортингтон Биохимические Корпорация поддержала эту публикацию, покрывая затраты на производство видео-файл. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбор и анализ данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Благодарности

Кроме того, мы благодарим кардиохирургов Гейдельбергского университета за предоставление предсердной ткани человека, а также Клаудию Либетрау, Катрин Купсер и Рамону Нагель за их отличную техническую поддержку. Особая благодарность также Энди В. Траффорду за его полезные предложения и советы во время установления измерений переходных процессов Ca²⁺. Авторы выражают глубочайшую благодарность сотрудникам кафедры фармакологии и токсикологии (руководитель: Урсула Рэйвенс) Дрезденского технического университета за предоставленную нам возможность изучить основные методы и навыки в области клеточной электрофизиологии и выделения кардиомиоцитов.

Исследование авторов поддерживается Немецким научно-исследовательским обществом (Do769/1-1-3), Федеральным министерством образования и научных исследований Германии через Компетентную сеть по фибрилляции предсердий (01Gi0204) и Немецким центром сердечно-сосудистых исследований, Европейским союзом через Европейскую сеть трансляционных исследований фибрилляции предсердий (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, крупномасштабный интеграционный проект, предложение No 261057) и Европейско-североамериканским обществом по фибрилляции предсердий Грант Альянса по исследованию фибрилляции (ENAFRA) от Фонда Ледюка (07CVD03).

Схематический обзор, показанный в видеофайле, был создан с использованием медицинского искусства Servier.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
			Транспортировочный раствор
Альбумин	Sigma-Aldrich	A3059	Раствор для хранения: 1%
БДМ	Sigma-Aldrich	31550	Транспортировочный раствор: 30
DL-β-гидроксимасляная кислота	Sigma-Aldrich	H6501	Раствор для хранения: 10
Глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270	Транспортировочный раствор: 20 раствор, не содержащий Ca2+: 20 Растворы ферментов E1 и E2: 20 Раствор для хранения: 10
L-глутаминовая кислота	Sigma-Aldrich	G1251	Раствор для хранения: 70
KCl	Merck	1049360250	Транспортирующий раствор: 10 раствор, не содержащий Ca2+: 10 Растворы ферментов E1 и E2: 10 Раствор для хранения: 20
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Транспортировочный раствор: 1.2 раствор, не содержащий Ca2+: 1.2 Растворы ферментов E1 и E2: 1.2 Раствор для хранения: 10
MgSO4	Sigma-Aldrich	M9397	Транспортировочный раствор: 5 раствор, не содержащий Ca2+: 5 Растворы ферментов E1 и E2: 5
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	Транспортировочный раствор: 5 раствор, не содержащий Ca2+: 5 Растворы ферментов E1 и E2: 5
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Транспортировочный раствор: 100 раствор, не содержащий Ca2+: 100 Растворы ферментов E1 и E2: 100
Таурин	Sigma-Aldrich	86330	Транспортировочный раствор: 50 раствор, не содержащий Ca2+: 50 Растворы ферментов E1 и E2: 50 Раствор для хранения: 10
Коллагеназа I	Уортингтоне	4196	Растворы ферментов E1 и E2: 286 Ед/мл
Протеаза XXIV	Sigma-Aldrich	P8038	Растворы ферментов E1 и E25 Ед/мл*
pH			Транспортировочный раствор: 7.00 раствор, не содержащий Ca2+: 7.00 Растворы ферментов E1 и E2: 7.00 Раствор для хранения: 7.40
доведенный до			Транспортировочный раствор1 M NaOH раствор, не содержащий Ca2+1 M NaOH Растворы ферментов E1 и E21 M NaOH Раствор для хранения1 M KOH
Концентрации указаны в мМ, если не stated иное. BDM — 2,3-бутандионмоноксим. *Протеаза XXIV содержится только в ферментном растворе E1.
Таблица I. Растворы.


Нейлоновая сетка (200 μм)	VWR-Germany	510-9527
Реакционный стакан с рубашкой	VWR	KT317000-0050
Таблица II. Специальное оборудование.


Диметилсульфоксид	Sigma-Aldrich	D2650
Fluo-3 AM (специальная упаковка)	Invitrogen	F-1242
Плюроник F-127	Invitrogen	P6867
Таблица III. Вещества для загрузки миоцитов красителем Fluo-3 AM.


4-аминопиридин	Sigma-Aldrich	A78403	Раствор для ванны: 5
BaCl2	Sigma-Aldrich	342920	Раствор для ванны: 0.1
CaCl2 × 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080	Раствор для ванны: 2
Глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270	Раствор для ванны: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Раствор для ванны: 10
KCl	Merck	1049360250	Раствор для ванны: 4
MgCl₂ × 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250	Раствор для ванны: 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Раствор для ванны: 140
Пробенецид	Sigma-Aldrich	P8761	Раствор для ванны: 2
pH			Раствор для ванны: 7.35
доведенный до			Раствор для ванны1 M HCl
Таблица IV. Раствор для ванны при методе локальной фиксации потенциала (patch-clamp). *4-аминопиридин и BaCl добавлялись только для экспериментов с методом фиксации потенциала.


K+-соль DL-аспартата	Sigma-Aldrich	A2025	Пипетировать раствор: 92
ЭГТА	Sigma-Aldrich	E4378	Пипетировать раствор: 0.02
ГТФ-Трис	Sigma-Aldrich	G9002	Пипетировать раствор: 0.1
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Пипетировать раствор: 10
KCl	Merck	1049360250	Пипетировать раствор: 48
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Отпипетировать раствор: 1
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Пипетировать раствор: 4
Fluo-3	Invitrogen	F3715	Пипетировать раствор: 0.1
pH			7.20
доведенный до			1 M KOH
*Таблица V. Раствор для пипетки при локальной фиксации мембраны (patch-clamp).** В дни проведения экспериментов раствор для пипетирования хранится на льду до использования. *В дни проведения экспериментов Fluo-3 добавляют из стокового раствора с концентрацией 1 мМ.

Ссылки

Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation. J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).
Margaret, W. C. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).
Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).
Dobrev, D., et al. G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents. Circulation. 102, 692-697 (2000).
Voigt, N., et al. Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation. Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).
Voigt, N., et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).
Dobrev, D., et al. The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 112, 3697-3706 (2005).
Voigt, N., et al. Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).
Amos, G. J., et al. Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes. J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).
Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences. Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).
Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart. Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).
Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).
Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).
Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circ Res. 26, 679-687 (1970).
Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method. Life Sci. 33, 1-18 (1983).
Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
Bielecki, K. The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart. Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).
Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure. Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).
Rich, T. L., Langer, G. A. Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution. Circ. Res. 51, 131-141 (1982).
Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).
Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).
Worthington, K., Worthington, V. Worthington Enzyme Manual. , (1993).
Christ, T., et al. Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation. Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).
Dobrev, D., et al. Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials. Circulation. 104, 2551-2557 (2001).
Hatem, S. N., et al. Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes. Circ. Res. 80, 345-353 (1997).
Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance. Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).
Hove-Madsen, L., et al. Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes. Circulation. 110, 1358-1363 (2004).
Molina, C. E., et al. Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).