Методическая статья

Прямое изображение ЭР кальция с целевыми-эстеразы Индуцированные красителем (TED)

DOI:

10.3791/50317

⸱

7 мая 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, 2Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, 3Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целевые-эстеразы индуцированного красителем (TED) поддерживает анализ внутриклеточной динамики магазин кальций флуоресцентной визуализации. Метод основан на нацеливание рекомбинантного карбоксилэстеразы в эндоплазматический ретикулум (ER), где она улучшает местный разоблачении синтетический низким сродством Са 2 + Индикатор красителей в ER просвет.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация динамики кальция важно понимать роль кальция в физиологии клетки. Для изучения динамики кальция, синтетический флуоресцентного Са 2 + индикаторов стали популярными. Здесь показано, TED (= целевых-эстеразы индуцированного красителем), способ улучшить высвобождение Са 2 + индикатор красителей в просвете ER из различных типов клеток. На сегодняшний день TED был использован в клеточных линиях, глиальные клетки, и нейронов в пробирке. TED баз на эффективную, рекомбинантные адресности высокой активностью карбоксилэстеразы в просвете ER использованием векторной конструкции, которые выражают карбоксилэстеразы (CES). Последнее TED векторы содержат основной элемент CES2 слит с красным флуоресцентным белком, что позволяет одновременное двухцветные изображения. Динамика свободного кальция в ЭР в образ будут включены в один цвет, а соответствующие структуры ER отображается красным цветом. В начале процедуры клеток, трансдуцированных лентивирусов. Затем инфицированные клеткиRe высевали на покровные, наконец, позволить изображений живых клеток. Затем живые клетки инкубируют с ацетоксиметил эфир (AM-эфир) формы с низким сродством Са 2 + показателей, например Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM или Mag-Fura2-AM. Эстеразы деятельности в расщепляет ER от гидрофобных боковых цепей от AM форме Са 2 + индикатор и гидрофильные флуоресцентного красителя / Ca 2 + образуется комплекс и захваченных в ЭР просвет. После загрузки краситель, клетки анализируют на перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Клетки постоянно озарен Ringer-подобные решения и ER динамики кальция непосредственно визуализируется в заданный промежуток времени. Кальций освобождение от ER идентифицируется снижение интенсивности флуоресценции в регионах, представляющих интерес, в то время заправки из магазина кальция ER приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Наконец, изменение интенсивности флуоресценции во времени определяется путем расчета f / F 0.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы решить физиологические реакции кальция ER, мы разработали новую стратегию для улучшения захвата синтетических красителей чувствительной к кальцию в ЭР. Метод позволяет напрямую, без прерывания мониторинга в реальном времени свободного кальция ER в присутствии внеклеточного кальция.

Функции и сигнализации ER Кальций

Кальций сигналы находятся в разных типах клеток, например мышечных клетках, нейроны и глиальные клетки и их функции в диапазоне от посреднических сокращения мышц к участию в синаптической передаче в обучении и памяти 1,2. Изменение концентрации свободного кальция высокой научный интерес, так как кальций участвует в регуляции транскрипции генов, пролиферацию клеток, возбудимость нейронов, гибель клеток и других клеточных сигнальных событий 1-7. Все эти сигналы сотовой кальция функционально связаны и способствуют внутриклеточного кальциямагазин динамики 8-10.

Общей особенностью всех кальций сигналов поток кальция между внеклеточным пространством, в цитозоль и органелл, в основном ER и митохондрии. Это вызывает динамическое изменение концентрации кальция в эти органеллы, которые воспринимаются различные компоненты сигнализации. В общем, концентрации кальция в ЭР в диапазоне от 100 до 800 мкМ, в цитозоле концентрации кальция близка к 100 нМ, и во внеклеточном пространстве концентрация составляет около 1-2 мм. Соответственно, существует высокая движущая сила химической кальция течь к цитозоле 2,9,10.

Наиболее широко исследованы ЭР-производных сигналов кальция зависит от стимуляции G-белками рецепторы (GPCR), которые затем активируют фосфолипазу С (PLC). PLC в свою очередь производит инозитол 1,4,5-трифосфата (IP 3) 1. После связывания IP 3 до своей RECeptor (IP 3-Rec, рис. 1) в ЭР-мембраны, ионы кальция высвобождаются из просвета ER. Исторически сложилось так, IP 3-опосредованное высвобождение кальция из ER был первым - даже хотя и косвенно - измеряется в ацинарных клеток поджелудочной железы по Streb и др. в 1983 году 11.. В этой публикации предложено в первый раз сигнальный каскад с участием ацетилхолина, фосфолипазы С и IP-3. Таким образом, высвобождения кальция обычно называют IP 3-индуцированный выброс кальция (IiCR) (рис. 1). Киназы-зависимую активацию фосфолипазы сг на рецептор тирозин киназ ссылки действие факторов роста и нейротрофических факторов ER кальциевой сигнализации после IP 3 высоты 12. В дополнение к IiCR, кальций высота может быть опосредовано ионотропную ввод кальций, например, с помощью напряжения закрытого кальциевых каналов (Са V), и последующего кальций-индуцированного высвобождения кальция (CICR) путем повторного рианодиновыхрецепторов (RyR). IiCR CICR и физиологически связаны с магазина управлением поступления кальция (SOCE). SOCE включает действие СТИМ (стромы взаимодействующих молекул), который предназначен для сигнализации выброс кальция, ER. СТИМ было показано, чтобы стимулировать внеклеточной входа кальция через переходный рецепторный потенциал каналов (ГТО) 13, Orai кальциевых каналов 14 и даже напряжения закрытого кальциевых каналов 15 (рис. 1). Потеря кальция ER динамически спасен действие Sarco-эндоплазматический ретикулум кальций АТФазы (SERCA), который активно насосы кальций обратно в ЭР. Блокирование SERCA с такими препаратами, как тапсигаргин представляет непрерывную потерю кальция ER в цитозольный отсека. Это кальций ER "утечка" вызвано ER внутримембранного пор комплексы, такие как Sec61 белкового комплекса 16,17 (рис. 1).

В 1998 году опубликовал Berridge модели, "нейрон в модели нейрона", whicч предполагает принцип физиологической роли ER в интеграции нейронов кальцием 5. Эта модель рассматривает существование непрерывной мембраны ER системы формирования внутриклеточных «образ» мембраны нейронов плазмы 5. Этот бинарный эукариотических мембранной системы как утверждали, было одним из основных условий для временной и пространственной интеграции быстрых и медленных кальциевых сигналов в нейронах. Кальций сигналы, возникающие или одновременно или последовательно в разных шипами или дендритов одного и того же нейрона присвоено сомы клетки или ядра через ER, где они суммируются 5,18. Затем их сумма может оказывать действие на возбудимость нейронов, регуляцию транскрипции гена или интеграции сигнальных каскадов. Таким образом, ER поддерживает интеграцию кальций сигналов. Одной из предпосылок этой концепции является непрерывность ER в одной ячейке, которая была претендуют несколько исследований и который был доказан, по крайней мере для сомато-Dendritic районов и короткого расстояния проекции аксональное 19-21. Есть ли ER непрерывности в течение долгих аксональное прогнозов является предметом дискуссий.

Стратегии для измерения расхода свободного кальция через мембрану ER

Кальций сигналы наиболее часто контролироваться в цитозоле 22,23. Таким образом, она не может быть легко выделено ли Са 2 + течет в цитозоль из внеклеточной или из внутриклеточных депо 6,24. Чтобы преодолеть это ограничение, методические стратегии для прямой визуализации кальция ER были разработаны. Таким образом, следующие стратегии используются: (1) ER-целевых генетически модифицированных белков-индикаторов 25-27 на основе белков низким сродством Са 2 + индикаторы используют биолюминесцентного белка GFP аэкворин или в комбинации с кальцием чувствительного белка.. Эти генетически модифицированные Ca 2 + индикаторы (GECIS) можетбыть направлены на ER с помощью сигнального пептида и активно хранится в ER помощью удержания и извлечения мотива. Общие ER Ca 2 + индикаторы базы по принципу Cameleon и Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon раскол YC7.3ER 29 и Cameleon D1 30. (2) Прямая эстераза основе красителя АМ-эфира низкоаффинными Ca 2 + 31,32 показателей. AM-производных индикаторов красителей (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM или Fluo5N-AM) проходят биологические мембраны в липофильном, кальция-нечувствительными государства. Затем в цитозоле, а также в ЭР, эндогенные эстераз расщепляют на АМ-эфирной группы и отпустить Са 2 + индикатор, оставляя за определенное количество активного красителя в цитозоле и в ЭР. Таким образом, этот подход полезен в условиях высокой концентрации кальция в ЭР тех пор, пока концентрация цитозольного кальция остается значительно ниже дезащита предел низким сродством показателей, в частности, во время характерные сигналы кальция (например нМ до низкого мкМ). (3) AM-эфир нагрузки в сочетании с плазматической мембраной проницаемости 32. Любой оставшийся цитозольного Ca2 + индикатор удаляется плазматической мембраны проницаемости с небольшим количеством «мягкий» моющего средства (например, сапонин) в искусственной внутриклеточный буфера. Таким образом, внутриклеточных мембран можно стимулировать, например, с IP-3 внутриклеточной буфер, непосредственно через «поры» в плазматической мембране. (4) Диализ цитозоле при цельноклеточной конфигурации и одновременное измерение Са 2 + в просвете ER и цитозоле 32,33. Клетки сначала загружается с низким сродством Са 2 + индикатор (например, Mag-Fura2- AM, радиометрический, УФ-светом). Затем с помощью пипетки патч, оставшиеся цитosolic низким сродством Са 2 + индикатор диализу из цитозоле буфером, содержащим высокое сродство Са 2 + индикатор (например, Fluo-3, видимый свет). Такая стратегия позволяет одновременную запись и цитозольные ER полученных сигналов. (5) Целевые эстеразы-индуцированной красителем 8,34. Карбоксилэстеразы (CES) предназначен для просвете ER и обеспечивает высокую активность эстеразы для эффективного захвата АМ-форме сложного эфира с низким сродством Са 2 + показателей.

Целевые эстеразы-индуцированной красителем (TED)

Для повышения адресности с низким сродством Ca 2 + показатели ER просвет, Тед был разработан. TED требует избыточной экспрессии ER целевых мышь карбоксилэстеразы (CES2) (рис. 2), которая достигается с помощью экспрессионных конструкций. Клетки, экспрессирующие рекомбинантный CES-конструкцию инкубируют с АМ-сложноэфирной формы кальцияиндикатором красителя (Fluo5N-AM, рисунок 2). Затем в ER, краситель превращается в Са 2 + чувствительным, непроницаемой мембраны Са 2 + индикатор комплекс (Fluo5N/Ca 2 +) на высокую активность эстеразы, поэтому захвата красителя в высокой концентрации в просвете ER 8 , 34. Этот метод особенно полезен для исследования ER кальцием высвобождение через IiCR-путей, например, с помощью метаботропного, пуринергической или глутаматных рецепторов, 8,34 и визуализировать ER кальция истощения через "утечки каналы" непосредственно, например, после блокады SERCA 17 , 34. Нашему опыту низкоаффинными Ca 2 + индикатор Fluo5N-AM в настоящее время является лучшим индикатором доступны для использования с загрузкой стратегии TED красителя. Fluo5N-AM имеет низкий сродство к Са 2 + (константа диссоциации K D ~ 90 мкм, рисунок 2), почти не флуоресцентные в AM-форме, но обеспечивает высокую флуоресценцию излучения при Calciuм 8,34 обязательными. Fluo5N/Ca 2 + комплекс может возбуждаться с помощью стандартного источника света ~ 490 нм, что соответствует стандартным красители, такие как FITC, Alexa 488 или УЗФБ. Цитозольного сигнала кальций едва ли достичь концентрации в диапазоне низких мкМ и, следовательно, едва обнаружено Fluo5N в цитозоле 35.

Чтобы повысить производительность Тед, несколько рекомбинантных векторных конструкций были разработаны (рис. 3). Первоначально, Тед векторы на основе кодирующей последовательности CES2 (RefSeq инвентарным номером NM_145603, CES2c) и лучший TED производительности наблюдается при стабильной экспрессии конструкций ЕЭП. Новые векторы TED выразить одним из основных элементов CES2 слит с красной флуоресценции белков TagRFP-T2 36. Эти векторы имеют то преимущество, что они могут быть использованы для идентификации трансдуцированных клеток, а также использовать красную флуоресценцию в качестве внутреннего контроля для нормализации изменений в Fluo5N/Ca 2 + флуоресценции. Красной флуоресценции также дает возможность визуализировать структурные распределение ER и изменения в ER динамики при стимуляции условий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет TED применяется к клеточных линиях, нейронах гиппокампа и кортикальных глиальных клеток. TED производительность лучше всего, когда TED векторов стабильно экспрессируются, например, путем лентивирусов векторов. Схематический обзор метода TED показано на рисунке 4.

1. Приготовление растворов

Следующие растворы должны быть подготовлены до начала и может храниться как указано. Мы вообще используем стерилизованных стеклянных и пластиковых материалов и автоклавного воды.

  1. Подготовьте ХЕПЕС Рингер (в мм): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 7H 2 O, 2 CaCl 2, 1,25 Na 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O.. Бескальциевой ХЕПЕС Ringer состоит из (в мм): 127 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 .7 H 2 O, 1,25 Na 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O и 0,1 ЭГТА.. Без глюкозы этих Imaging Solutions можно бэлектронной хранили при 4 ° С. Необходимое количество D-глюкоза недавно добавленный перед использованием.
  2. Для анализа TED в нейронах гиппокампа искусственной спинномозговой жидкостью (ACSF) рекомендуется. ACSF состоит из (в мм): 127 NaCl, 23 NaHCO 3, 3 KCl, 2,5 NaHPO 4 H 2 O, D-25 glucose.H 2 O, 2 CaCl 2, MgCl 2 +2 0,7 H 2 0 в Ddh. 2 0.
  3. Подготовка Fluo5N-AM до концентрации 5 мМ. Чтобы помочь солюбилизации добавляют 8,9 мкл 20% Pluronic F-127 (в ДМСО, хранили при комнатной температуре в защищенном от влаги и света) до 50 мкг лиофилизированного Fluo5N-AM. Затем растворить Fluo5N-АМ посредством водяной бане ультразвуковой течение по крайней мере 2 мин. Магазин аликвоты 0,5 мкл при -20 ° С, в защищенном от света и влаги.
  4. Подготовка антагониста и агониста запасы по мере необходимости. Например: а) 10 мМ АТФ или АДФ (в H 2 O, метаботропный активации пуринергических рецепторы), б) 10 мМ карбахол в H 2 O (агонистымускариновых рецепторов ацетилхолина), в) 30 мМ циклопиазоновая кислоты (CPA) в ДМСО (блокатор SERCA), г) 50 мМ DHPG в PBS (метаботропный агонистов рецепторов глутамата для мГлуР я и мГлуР 5), д) 10 мМ глутамата в H 2 O, F) 1 мМ иономицин в ДМСО (ионофором), G) 5 мМ тапсигаргин в ДМСО (высокое сродство блокатор SERCA). Магазин аликвотах при -20 ° С.
  5. Лентивирусов векторов: Этот протокол включает в себя использование лентивирусов частиц выражение TED вектор. Их производство и хранение не является частью настоящего Протокола. Мы используем лентивирусных векторов второго поколения для передачи рекомбинантный карбоксилэстераз в клеточных линиях, глиальных клеток и нейронов. Наши лентивирусный баз системы на вектор экспрессии FUGW 37, и упаковка плазмид pCMVΔR8.91 или psPAX2 и pseudotyping плазмиды pMD2.G 38,39. ОСТОРОЖНО: считаем, что работа с рекомбинантной самостоятельно инактивации лентивирусных векторов требует тщательногорассмотрение руководящих указаний по биобезопасности. Во многих странах эти векторы классифицируются как биологической группы риска 2. Для получения дополнительной информации обратитесь к http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Подготовка и вирусная инфекция нейронов гиппокампа мыши

  1. Вымойте покровные стекла в стеклянном блюде Петри диаметром 20 см (100 покровные за блюдо) 1x в 70% этаноле в течение приблизительно 30 мин. Наконец, добавьте 100%-ного этанола (ра) в течение 2 мин. Удалите остатки этанола и высушить покровные в стерильной капотом.
  2. Подготовьте два различных видов сред для культур нейронов гиппокампа: (а) нейробазальной среды с B27 1:50, (б) полное среда: нейробазальной среды с B27 1:50, 1:100 Glutamax, N2 добавка 1:100. Стерильные фильтрата средствах массовой информации и не храните их в клетке инкубатора до использования.
  3. За один день до вскрытия, покровные получают сначала путем размещения одного стерильные 10 мм покровным в каждоми 4-луночный планшет культуре клеток. После этого тщательно покрыть каждую покровное с 80-100 мкл 0,1% поли-L-лизин и хранения блюд в инкубаторе в течение ночи.
  4. В день вскрытия и клеточных культур, начинают со стиральной покровные три раза 100 мкл HBSS и передачи 100 мкл нейробазальной среду в каждую покровным. Поместите посуду в инкубатор для равновесия (например, во время вскрытия мышей).

Рассечение

Мы выполняем наши эксперименты с мышами в соответствии с правилами ЕС союза, утвержденный нашими Уходу за животными и использованию комитета.

  1. Удалить общего мозга и гиппокампе рассекать на двусторонней основе.
  2. Осторожно удалите мозговых оболочек и тканей, кроме гиппокампа и место одного гиппокампа каждая в 1,5 мл пробирку, содержащую 450 мкл HBSS. Хранить ткани на льду до достаточного количества гиппокампе не был выделен.
<р = класса "jove_step"> Клеточные культуры
  1. Добавить 50 мкл 1% трипсина (Worthington) в каждую пробирку и инкубировали их при 37 ° С на водяной бане в течение 15 мин. Встряхнуть трубы иногда. Для остановки реакции переваривания, добавляют 50 мкл 1% ингибитора трипсина в каждую пробирку и инвертировать трубки несколько раз.
  2. Передача всех тканей до 5 гиппокампе одному 15 мл сокола трубки избежать переноса жидкости. Добавить B27-среде (а) до конечного объема 5 мл.
  3. Растирают ткани с использованием огня полированной стеклянной пипетки Пастера тщательно пипетки вверх и вниз. ОСТОРОЖНО: избежать воздушных пузырей!
  4. Спина с 400 мкг в течение 3 мин, супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл B27-среде (а).
  5. Растирают ткань вновь со стеклянной пипетки, а затем дважды с помощью 1000 мкл пластиковый кончик фильтра. Выполните это как описано в пунктах 2.9 и 2.10.
  6. После последнего центрифугирования ресуспендируют осадок клеток в 2 мл полной Mediuм (б) и растирают клеток с 200 мкл пластиковый кончик фильтра. Чтобы отделить оставшиеся сгустки клетку из одной клеточной суспензии, пусть скопления клеток поселиться в течение 1-2 мин.
  7. Граф клеток и рассчитать общее количество клеток, необходимых для вирусной инфекции. Для визуализации используют TED 25000 клеток на 10 мм покровным.
  8. Покрытие дополнительных 25000 Номера для приемными клетками в качестве контроля рекомендуется в этой точке.

Вирусные инфекции

  1. Передача клеточной суспензии на вирусную инфекцию в свежем 15 мл сокола трубки и центрифуги в течение 3 мин при 400 х г.
  2. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 300 мкл среды (б)
  3. Добавить соответствующее количество инфекционных лентивирусов частиц выражение TED вектор, и пусть трубки сокола стоять при комнатной температуре в течение 10 мин.
  4. Заполнение трубки с полной среде (б) до конечного объема необходимого для покрытия (100 мкл на каждые 10 мм покровным), аспирации среды из COVerslip, и сразу же поместите 100 мкл суспензии клеток на каждую покровным.
  5. Поместите посуду в инкубаторе, пока все клетки не расположились (около 2 ч) и внимательно заполнить посуду, пока они не содержат 2 мл среды (б).
  6. Пусть нейроны расти в течение по крайней мере одной недели. Замена 50% от среднего каждую неделю.

3. Культура и вирусно-инфекции мыши Кортикальная глиальных клеток

Подготовка

  1. Сначала готовят базальной среде глии (смесь 1:1 DMEM/F12, содержащей 10% FCS, 5% HS, 1% пенициллина / стрептомицина, 0,45% глюкозы) и нанесение покрытий на культуре клеток T75 колбу с 4 мл 0,5 нг / мл поли -DL-орнитина гидробромид (порно) (разводят в 150 мМ раствора борной кислоты, рН 8,35). После инкубации при 37 ° С в течение 2 часов или в течение ночи, промывают колбу культуры клеток три раза HBSS и добавляют 18 мл основной среды глии содержащий B27 1:50 и 10 нг / мл EGF. Равновесие колбу культуры клеток в инкубаторе (до 3 ч).
<р = класса "jove_step"> Вскрытие
  1. Мы выполняем наши эксперименты с мышами в соответствии с правилами ЕС союза, утвержденный нашими Уходу за животными и использованию комитета.
  2. Проанализируйте мозг одного P5-P7 мыши и удалить гиппокампе и мозговых оболочек в обоих полушариях, как описано в 2.5.
  3. Проанализируйте лобной коры, разрезать его на несколько небольших частей и собирать их в 1,5 мл пробирку, содержащую HBSS. Хранить пробирку на льду и перейти к части культуры клеток.

Клеточные культуры

  1. Передача всех тканей из трубки в 15 мл сокола трубки с помощью отожженной пипетки стекла.
  2. Добавить базальной среды до конечного объема 5 мл и растирают ткани с помощью пипетки несколько раз вверх и вниз с огнем полированные пипетки стекла. После центрифугирования при 300 х г в течение 3 мин, аспирации среды и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл основной среды.
  3. Повторите шаг 3,5 раза.
  4. После Тхий центрифугирования ресуспендируют осадок клеток в 2 мл основной среды глии содержащий B27 (1:50) и 10 нг / мл EGF.
  5. Titruate еще раз и передачи клеточной суспензии на подготовленную T75 колбу культуры клеток и позволяют клеткам расти в течение 3-4 дней.

Стиральная глиальных клеток (через 3-4 дня в культуре):

  1. Вымойте клетки один раз 10 мл PBS и энергично нажмите или слегка ударить колбу несколько раз рукой, удерживая его крепко в другой руке. К этому мусор шаг клеток и их скоплений будут удалены из культуры.
  2. Аспирируйте PBS и добавляют свежий базальной среде глии содержащий B27 (1:50) и 10 нг / мл EGF. Далее развивать культуру в течение 5-7 дней пока клетки не достигают 80% слияния.

Разделение, трансдукция и окончательная посева глиальных клеток:

  1. Coat 10 мм покровные 100 мкл поли-D-лизином (Основной раствор: 0,1%, разбавленный 1/50 объявлений 20 мкг / мл в PBS или HBSS) и инкубируютих в термостате в течение ночи. Вымойте покровные три раза HBSS и добавить 100 мкл базальной среды глии. Равновесие покровные в инкубаторе (3 ч).
  2. Вымойте глиальные клетки в два раза с 10 мл PBS, аспирации PBS и добавьте 3 мл трипсина (TrypLE, неразбавленный). Trypsinize клетки до 1 мин. ОСТОРОЖНО: Избегайте чрезмерного трипсинизация. Обычно более 80% всей клетки отделяют после 1 мин и этого достаточно, чтобы иметь несколько миллионов здоровых клеток.
  3. Остановить реакцию добавлением 10 мл основной среды глии, передачи клеточной суспензии в 15 мл трубки сокола, центрифуги при 300 мкг в течение 3 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл основной среды глии.
  4. Опять же, спина и аспирации, как описано в шаге 3,15, то клетки ресуспендируют в 5 мл основной среды глии.
  5. Передача необходимого количества клеток в 1,5 мл трубки. 10 4-2x10 4 глиальные клетки являются достаточными для одной 10 мм покровным. Как правило, об подвескиUMe для трансдукции клеток для одного 4-хорошо блюдо составляет менее 200 мкл. Добавить соответствующее количество лентивирусов частиц TED вектора экспрессии в клетки и инкубируют их при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем заполнить подвеска с базальной среды глии посева объема (100 мкл на покровное).
  6. Семенной 100 мкл инфицированных клеток на покровное и инкубировать в течение примерно 2 ч, затем добавляют базальной среде глии содержащий B27 1:50 и 10 нг / мл EGF до конечного объема 2 мл.
  7. Для идеальных условиях культивирования клетки использовать для экспериментов на 3-7 день после посева.

4. Генерация и культуры Репортер клеточной линии

TED линии репортер ячейки были созданы на основе HeLa, BHK21, HEK293 и SH-SY5Y. Здесь мы предлагаем протокол для клеток HeLa, но протокол может быть передан любой другой клеточной линии, а также.

Генерация стабильной клеточной линии HeLa

  1. Сплит дикий тип клеточной линии HeLa и передачи 100000 Cлоктей в объеме 200 мкл в 1,5 мл трубки.
  2. Добавить соответствующее количество лентивирусов частиц TED вектора экспрессии в пробирку и инкубируют клетки-вирусной суспензии в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем семена клеток в общем объеме 2 мл среды (DMEM, 10% FCS, 1% пенициллина / стрептомицина) в 30 мм чашки и инкубируют в течение 3 дней.
  3. После промывания один раз ЗФР, аспирации раствора и добавьте 500 мкл трипсина (TrypLE, 2:03 в PBS). Выдержите в течение ок. 3 мин, а затем остановить реакцию добавлением 3 мл среды. Передача суспензии в 15 мл трубки сокола и центрифуге при 400 мкг в течение 3 мин.
  4. Ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл среды и снова инфицировать клетки с лентивирусов частиц, как описано в 4.2. Затем семена клеток в культуре клеток T25 колбе в 10 мл среды.
  5. Рост клеток до слияния 60-80% пока не будет достигнута. Затем разделить культуру.

TED линии репортер клетки

  1. TED линии репортер ячейки можно сохранитьред в любой стандартной среде, например среде DMEM, содержащей 5% или 10% FCS и 1% пенициллина / стрептомицина используется.
  2. Пластина соответствующее количество клеток в 4-луночные чашки с стерильные 10 мм покровные стекла (см. выше), например, от 10000 до 20000 клеток на покровное.
  3. Рост клеток в течение по крайней мере двух дней, прежде чем использовать их для TED изображений.

5. Подготовка к процедуре Живая изображений на инвертированный микроскоп

    1. Prewarm HEPES-Рингера до комнатной температуры и добавляют D-глюкозы.
    2. Prewarm ACSF (без Са 2 + и Mg 2 +) до комнатной температуры и добавляют D-глюкозы. Проветривать ACSF с карбогена течение 5 минут. Затем добавляют 1 М исходных растворов CaCl 2, MgCl 2 до конечных концентраций 2 мМ каждого из них.
  2. Запустите живой микроскопы изображений и всех компьютерных программ.
  3. Начать перфузии на "пустышка" изображения камеры и уравновешивают трубки системы.
  4. Prewarm встроенный нагреватель решения и камерой изображений в столике микроскопа. Исправить изображения камеры в нагревательной вставкой.
  5. Уравновесить систему, чтобы 32-37 ° C, прежде чем начать процедуру загрузки красителя. ОСТОРОЖНО: Во избежание случайного потока перфузии раствора в микроскоп мы используем системы связи волос вокруг целей и эластомерных силиконовых листов (1 мм) для защиты столике микроскопа.

6. Красителем любого типа клеток

  1. Ресуспендируйте 1 аликвотой Fluo5N-AM (см. 1.3) в 100 мкл предварительно нагретого решение томография (HEPES-Рингера или ACSF).
  2. Растворения Fluo5N-AM в визуализации решения (ХЕПЕС Рингер или ACSF) в водяной бане ультразвуковую на 90 секунд.
  3. Использование свежей 4 - или 24-луночный планшет и передачи 400 мкл предварительно нагретого решение визуализации для одной скважиной. Добавить раствор красителя к тому же хорошо, чтобы прийти к 500 мкл 5 мкМ раствора.
  4. Аккуратно положите покровное с клетками (например,10-18 мм в диаметре) в скважине, клетки вверх.
  5. Выдержите в течение соответствующего периода времени в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° C (тем временем подготовить визуализации настройки на столике микроскопа). Типичные красителя загрузкой пояс для нейронов и глиальных клеток 7-15 мин, а для клеточных линий 10-20 мин.

CRUCIAL: красителя время загрузки и концентрации красителя зависит от типа клеток, клеточной плотности, и эксперимент конкретным потребностям! Длительное время инкубации в присутствии красителя может повредить клетки, особенно первичные нейроны и глиальные клетки, первичные и это чрезвычайно важно для реагирования на физиологические стимулы. Долгосрочные времени инкубации (например, 30 мин) будет полезно только для экспериментов ER кальция локализации исследовать распределение ER кальция в небольших субклеточных структур, например, штраф невриты или шипами. В некоторых экспериментах, смесь 1/3 питательной среде с изображениями решение может помочь в защите клеток при Fluo5N-AMЗагрузка.

  1. Мгновенно, передавать покровное к другой культуре клеток лунку, содержащую изображения растворе (HEPES-Рингера или ACSF) и начать монтаж клеток в изображения камеры.

7. ER-кальций изображений живых клеток с перевернутой лазерной сканирующей конфокальной микроскопии

  1. Используйте кисть, чтобы применить высокотемпературную смазку вакуум изображения камеры. Смазки необходимо зафиксировать покровное на дно перфузии камеры. Мы используем самодельные камеры визуализации для 10-12 мм покровные с небольшим объемом, что позволяет высокая скорость перфузии до 15 раз буфером обмена в минуту. Коммерчески доступный перфузионной камере в течение 18 покровные мм, могут быть приобретены у Warner инструментов (RC-49FS). Эта камера также позволяет поля стимуляции нейронов.
  2. Возьмите покровное с Fluo5N нагруженных клеток и добавить небольшое падение визуализации растворе (50-100 мкл) на клетках держать клетки, покрытые раствором изображений.Поверните покровного вверх ногами и установите клеток в изображения камеры. Чтобы нажать на покровное в кремний-клея, используйте ватную палочку (например, ватные палочки).
  3. Вытрите остаточного буфера из нижней части покровного стекла с ватными палочками. ОСТОРОЖНО: Тщательно вытереть остаточной влажности при использовании масла-объективом с высокой числовой апертурой для изображений с высоким разрешением. Остаточная соль лучше всего удалять водой. Случайное мазок масла можно удалить ацетоном или чистого этанола.
  4. Биржа "пустышка" изображения камеры с экспериментальной камере изображений. Вымойте клетки в течение 5-10 мин непрерывной перфузии.
  5. Вымойте клетки в течение 5 - 10 мин непрерывной перфузии.
  6. Для выбора соты использовать минимальное количество лазерного излучения, высокий уровень сканирования (2-4 Гц), небольшой размер и высоким коэффициентом усиления.
  7. ВНИМАНИЕ: Для выбора Fluo5N-меченых клеток не используют избыток света или прямого освещения с epifluorescenT свет. Яркое освещение Fluo5N/Ca 2 + комплексов вызывает полную потерю ER-конкретные флуоресценции в течение 2-4 сек (рис. 5).
  8. Настройка микроскопа в соответствии с запланированным эксперимента. Для ориентации, представитель настройки для изображений с различными векторами TED приведены в таблице 1. Для перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, мы используем Olympus IX81 микроскопа в сочетании с Fluoview 1000 конфокальной системы, оснащенной диодных лазеров (473 нм, 15 мВт, 559 нм, 20 мВт) и спектральной системы детектора.
  9. В начале эксперимента документ интересующие клетки с высокой разрешающей х, стеки уг изображения.
  10. Выполните х, у, изображений для мониторинга динамики ER кальция в конкретных экспериментальных условиях. Типичные параметры нашей системы, приведены в таблице 2.
  11. Наблюдать за изменением ER кальция при непрерывной перфузии с изображениями решения. Типичная скорость буфер обмена являются электронныеxemplarily: (а) стиральные клетке и в магазине истощение SERCA блока: 1,5 мл / мин, (б) ATP / DHPG стимуляции: 3 мл / мин.
  12. Приобретайте цифровые изображения преимущественно с 12-разрядным (4096 серого значений). Для параллельной визуализации Fluo5N/Ca 2 + и RFP, 8-битных изображений (256 серых значений) может спасти вашу систему от переполнения данных.
  13. Хранить живых клеток во времени изображения (х, у,) или 3D-изображения стеки (X, YZ) (для сотовых распределение Fluo5N/Ca 2 + комплексы) в ImageJ совместимый формат (например, TIFF).

8. Обработки изображений и анализа данных

  1. Откройте изображение стека в программе ImageJ. В случае многоцветного изображения, разделите RGB каналов, отвечая на вопрос ImageJ.
  2. Определите ваш регион (ы) интереса (ROI) путем тщательного рассмотрения стеки (например, с помощью интенсивности в зависимости от времени участка)
  3. Используйте время-анализатор серии плагин для считывания средней интенсивности пикселя в ROI (F сырье). Dependinг на цели, нарисуйте вокруг трансформирования либо полная ER или небольших регионах ER ER например дендритов периферийных регионов клетки. Кроме того, включать 1-3 ROI в районах без клеток для вычитания фона.
  4. Рассчитайте среднее фоновой флуоресценции (F б) путем вычисления среднего значения флуоресценции фона ROI и вычитать F фонового значения B из F исходные значения, чтобы получить значение F ROI.
  5. Рассчитать F 0, что базальные флуоресценции клеток, путем вычисления среднего значения от десяти до 30 флуоресцентный значений для каждого ROI в состоянии покоя.
  6. Вычислить фона с коррекцией относительных изменений флуоресценции f / F 0 по формуле:

figure-protocol-1

  1. Настоящий относительные изменения светитьсясть как след с f / F 0 на Y-оси, а время для X-оси.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает без прерывания подход для прямой визуализации свободного кальция ER. Низкоаффинными синтетического Ca 2 + индикаторы выходят в свет и захваченных в просвете ER с помощью ER целевых, рекомбинантные активность фермента эстеразы. Улучшение загрузки Са 2 + индикатор красителей для ER просвет позволяет прямую и быструю визуализацию динамики ER кальция магазине.

Сотовый типов для TED

Возможностей использования этого метода ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Преимущества и недостатки метода TED широко обсуждалась в последних публикациях 34,35. По сравнению с другими методами, описанными выше, TED обходит проблему срыва и перфузии клеток. Кроме того, два аспекта необходимо уделять особое внимание. Принцип TED для ER кальций изображений требует (1). Направленную экспрессию активного карбоксилэстеразы в просвете ER с помощью TED векторные конструкции и (2). Эффективному и преференциальный выпуска с низким сродством синтетический АМ-эфиры кальций красителей в ER прос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) и BL567/3-1 Friedrich-Баур-Stiftung. Мы хотели бы поблагодарить Роджера Y. Tsien, Медицинского института Говарда Хьюза лаборатории в Университете Калифорнии, Сан-Диего за предоставление нам Tag-RFP-T2. Мы признаем счастью Дэвид Балтимор, Калифорнийский технологический институт, Пасадена, и Дидье Trono, Женевский университет, Женева, за предоставление нам лентивирусный плазмид FUGW и psPAX2/pMD2.G.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(S)-3,5-DHPG (Дигидроксифенилглицин)Tocris0805
5';-АТФ-Na2, АТФ динатриевая соль гидратSigmaA26209-1G
B-27 добавка,50xИнвитроген17504-044
Карбамоилхолина хлорид (Чарбахол)SigmaC4382-1г
Циклопиазоновая кислота (CPA)Ascent ScientificAsc-300
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD2650
DMEM с глутамаксомInvitrogen-Gibco31966-047
PBS Дульбекко без Ca/Mg 1x PAAH15-002
Эмбриональная телячья сывороткаInvitrogen-Gibco10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μ gInvitrogenF14204
GlutamateAscent scientificAsc-049
GlutamaxInvitrogen35050-038
Ham's F12 смесь питательных веществInvitrogen-Gibco21765-029
Hank's BSS(1x) без Ca, без Mg, с фенолом красным, HBSSPAA LaboratoriesH15-010
Сыворотка для лошадейSHD3250YKLinearis
Иономицин Ca2+ сольAscent scientificAsc-116
мышиный EGF PreproTech315-09
N2 добавка 100xInvitrogen17502-048
Нейробазальная средаInvitrogen-Gibco21103-049
Pluronic F127, низкое поглощение ультрафиолета, 2гInvitrogenP6867
Poly-DL-орнитина гидробромид PORNSigmaP8638
Поли-D-лизин гидробромидSigmaP7280
Поли-L-лизинSigmaP2636
ТапсигаргинCalbiochem586005-1mg
TryLE ExpressInvitrogen12605-028
ТрипсинWorthingtonLS-003707
Ингибитор трипсинининибитора из глицина MAX (соя)SigmaT6522
Materials
Конфокальная система: инвертированный лазерный сканирующий микроскоп: FV1000 с конфигурацией IX81Olympusдля пользователя
Конфокальная система: лазерный объединитель FV10 и диодные лазеры (405, 473, 559, 635)Olympusпользовательская конфигурация
Конфокальная система: сканирующая головка FV10-SPD со спектральным детекторомOlympusпользовательская конфигурация
Контроллер нагревателя TC-344BWarner Instruments64-0101для управления нагревателем в линейном растворе
NIH Программное обеспечениеImageJWS Rasband, ImageJ, Национальные институты здравоохранения США, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Цель: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35OlympusN2709100
Цель: UPLFLN40XOOlympusN1478700
Цель: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15OlympusN1480700
Перфузионная камера, инверсная
камера, RC-49FSWarner InstrumentsW4 64-1709
Перфузионная трубка: PT-49Warner Instruments64-1730для перфузии
Перистальтический насос MiniPlus 3 (4 канала)Gilsonn.a.perfusionpump
Однолинейный нагреватель раствора SH-27BWarner Instruments64-0102управляется контроллером нагревателя
Всасывающие трубки: ST3RWarner Instruments64-1407для перфузии
Нагревательная вставка: Tempocontrol 37-2 цифровая 2-канальнаяPeconn.a.
перфузионная

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
  3. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  4. Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. Local calcium signaling in neurons. Neuron. 40, 331-346 (2003).
  5. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21, 13-26 (1998).
  6. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73, 862-885 (2012).
  7. Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
  8. Jaepel, J., Blum, R. Capturing ER calcium dynamics. European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).
  9. Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
  10. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
  11. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
  12. Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
  13. Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
  14. Cahalan, M. D. STIMulating store-operated Ca(2+) entry. Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).
  15. Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
  16. Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
  17. Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
  18. Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
  19. Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
  20. Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
  21. Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
  22. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067(2009).
  23. Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730(2011).
  24. Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
  25. Mank, M., Griesbeck, O. Genetically encoded calcium indicators. Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).
  26. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  27. Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
  28. Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
  29. Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
  30. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
  31. Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
  32. Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
  33. Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
  34. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
  35. Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, Humana Press. (2010).
  36. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
  37. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
  38. Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
  39. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
  40. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
  41. Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Calcium measurement methods. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).
  42. Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
  43. Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , In preparation (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TEDCES2Delta F Over F Zero

Похожие статьи